熄風(fēng)化濕方對腹瀉型腸易激綜合征大鼠的作用及其機制*

王克超，李珩

淄博市中心醫(yī)院，山東 淄博 255036

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種功能性胃腸疾病，其特征是腸排空改變、腹脹、腹痛及腹部不適，而無解剖或生化異常[1]。IBS主要分為腹瀉型、便秘型和混合型三種主要類型[2]，腹瀉型腸易激綜合征(diarrheal irritable bowel syndrome，IBS-D)臨床上常表現(xiàn)為與腹痛相關(guān)的腹瀉，排便后腹痛可緩解，具有慢性和反復(fù)發(fā)作的特點[3]。IBS-D雖無明顯致死率，但給患者帶來嚴重的心理壓力和經(jīng)濟負擔(dān)，影響患者的正常生活[4]。目前，IBS-D的病理機制尚不完全清楚，常認為其與胃腸道菌群改變、傳染性腸胃炎、內(nèi)臟超敏反應(yīng)、腸腦軸失調(diào)、慢性應(yīng)激及遺傳因素有關(guān)[5]，其中，內(nèi)臟高敏感性是IBS-D發(fā)病的主要原因[6]。報道顯示，IBS-D的發(fā)生機制與腦-腸軸功能紊亂密切相關(guān)，其中腦腸肽在IBS-D發(fā)病過程中起著重要的傳遞作用[7]。IBS-D患者結(jié)腸黏膜組織中存在一些輕、中度非特異性炎癥改變，表明IBS-D可能與免疫功能紊亂密切相關(guān)[8]。迄今為止，臨床上還沒有用于治療IBS-D的標準治療劑，西醫(yī)在治療 IBS-D 中有一定的療效，但其不良反應(yīng)較多。目前，越來越多的中藥配方用于臨床治療IBS-D[9-10]，中藥熄風(fēng)化濕方是南京中醫(yī)藥大學(xué)田耀洲教授的經(jīng)驗方，臨床治療IBS-D多年，具有清熱化濕、柔肝熄風(fēng)的功效，能顯著改善患者的臨床癥狀[11]。本研究探討熄風(fēng)化濕方對IBS-D內(nèi)臟高敏感性大鼠生長激素釋放肽(growth hormone releasing peptide，Ghrelin)、膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)及免疫功能的影響。

1 材料

1.1 實驗動物40只SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證：SYXK(京)2018-0042，正常飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，第2周開始實驗，飼養(yǎng)環(huán)境濕度70%，室溫21 ℃，通風(fēng)良好，12 h循環(huán)光照，本研究經(jīng)淄博市中心醫(yī)院倫理委員會批準(202207001)。

1.2 藥物與試劑黃連、干姜、木香、黃芩、陳皮、生甘草、防風(fēng)、鉤藤、石榴皮、白術(shù)、白芍、白蒺藜、敗醬草購自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥房。Ghrelin、CCK、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-2 ELISA檢測試劑盒(美國abcam公司，貨號：ab263887、ab120209、ab197447、ab274400)；大鼠抗小鼠γδTCR抗體(美國SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司，貨號：sc-100289 )；總蛋白提取試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號：P1271-25)；BCA蛋白定量試劑盒(德國MERCK公司，貨號：71285-M)；酪氨酸蛋白激酶(tyrosine-protein kinase，Jak)抗體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子(signal transducer activated transcription factor，Stat)抗體(美國abcam公司，貨號：ab125051、ab3987)。

1.3 儀器TG16G型臺式高速離心機(常州市億能儀器廠，離心半徑：4 cm)；WMS-1037型生物顯微鏡、WMF-3590研究型熒光顯微鏡(上海無陌光學(xué)儀器有限公司)；DNM-9602型酶標分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；Mini-PROTEAN Tetra型電泳槽(美國伯樂公司)；eBlotTML1型快速濕轉(zhuǎn)儀(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 熄風(fēng)化濕方溶液的制備取黃連、干姜各3 g，木香、黃芩、陳皮、生甘草、防風(fēng)各6 g，鉤藤、石榴皮、白術(shù)各10 g，白芍、白蒺藜、敗醬草各15 g，將上述藥材粉碎，過40目篩，按質(zhì)量體積比120加入水，煮沸提取30 min，提取3次，將提取液抽濾并濃縮，濃縮液放入80 ℃水浴中，進一步濃縮為終濃度為 1.0 g·mL-1的溶液。

2.2 動物分組、模型建立及藥物干預(yù)從40只SPF級雄性Wistar大鼠中隨機選取10只作為空白組，其余30只大鼠采用“母嬰分離+乙酸刺激”法建立IBS-D大鼠模型[12]，具體操作如下：將經(jīng)石蠟油潤滑的直徑為1 mm的輸液導(dǎo)管插入大鼠肛內(nèi)約2 cm，注入0.2 mL的0.5%乙酸，每天1次，隨后每隔2 d增加0.1 mL，造模10 d后維持在0.5 mL，共處理14 d。糞便含水率≥30% 視為模型建立成功。將30只建模成功的IBS-D大鼠隨機分成模型組、低劑量熄風(fēng)化濕方組和高劑量熄風(fēng)化濕方組，每組10只，低、高劑量熄風(fēng)化濕方組大鼠分別以 10 mL·kg-1的體積灌胃給予10.9 g·kg-1、43.6 g·kg-1的熄風(fēng)化濕方溶液，空白組和模型組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水，每天1次，給藥2周。

2.3 糞便含水率檢測提尾刺激大鼠排便，收集大鼠糞便，用微量電子天平稱其質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)后，烘箱干燥直至糞便質(zhì)量不再變化，記錄數(shù)據(jù)，計算糞便含水率。

糞便含水率=(鮮糞便質(zhì)量-干糞便質(zhì)量)/鮮糞便質(zhì)量×100%

2.4 內(nèi)臟敏感性檢測通過檢測大鼠腹部抬起和背部拱起所需注水量評價大鼠的內(nèi)臟敏感性[13]。采用乙醚將大鼠麻醉后，絡(luò)合碘消毒肛門，將石蠟潤滑導(dǎo)尿管并插入大鼠肛門至氣囊末端剩余1 cm時固定。大鼠蘇醒后放入透明塑料籠內(nèi)，向氣囊內(nèi)緩慢注水，持續(xù)觀察大鼠腹部抬起和背部拱起20 s時的注水量并記錄，所需注水量越少，提示大鼠內(nèi)臟敏感性越高。實驗重復(fù)3次取平均值。

2.5 大鼠結(jié)腸組織病理變化檢測取結(jié)腸組織，多聚甲醛固定，包埋，切片，HE染色，二甲苯透明，干燥，封片，光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)腸組織病理變化。

2.6 血清腦腸肽及免疫功能指標的檢測按350 mg·kg-1的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血3 mL，離心取上清。ELISA法檢測血清Ghrelin、CCK、IL-1β、IL-2的水平，操作步驟嚴格按照說明書進行。

2.7 免疫熒光染色檢測大鼠腸黏膜γδT細胞給藥結(jié)束后處死大鼠，取末端回腸組織，沿中線切開，采用載玻片刮取腸內(nèi)組織，300目銅網(wǎng)過濾，然后制備成腸組織細胞懸液，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，獲得細胞。加入10 mL的磷酸緩沖液，重懸細胞，然后加入10 mL淋巴細胞分離液，離心，獲得白色分層，加入磷酸緩沖液15 mL，離心重復(fù)兩次，采用磷酸緩沖液調(diào)整細胞濃度至1×106mL-1，取流式檢測專用試管，每管加入100 μL，然后加入采用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的大鼠抗小鼠γδTCR抗體進行孵育，室溫避光 20 min 后，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，磷酸緩沖液重懸，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察各組大鼠腸黏膜γδT細胞的熒光強度，評估細胞數(shù)量。

2.8 大鼠結(jié)腸組織Jak/Stat通路蛋白表達情況檢測取結(jié)腸組織，制成勻漿，加入適量預(yù)冷RIPA裂解液充分混勻，冰上孵育1.5 h后，于4 ℃下 10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用BCA蛋白檢測試劑盒對各組細胞總蛋白進行定量后制樣。凝膠電泳分離樣品蛋白，轉(zhuǎn)膜，截取目的條帶浸于5%脫脂奶粉制成的封閉液中，置于搖床上室溫封閉1 h。加封閉液稀釋的Jak和Stat一抗(稀釋比例為11 000)，充分搖勻后置于4 ℃環(huán)境下孵育過夜。洗膜，加入稀釋比例為15 000的對應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，避光反應(yīng) 5 min，用定量成像儀收集結(jié)果。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并采用Graphpad5.01軟件進行作圖，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 熄風(fēng)化濕方對大鼠糞便含水率的影響與空白組比較，模型組大鼠糞便含水率顯著升高(P<0.05)，且糞便含水率>30%，提示IBS-D大鼠模型制備成功。與模型組比較，低、高劑量熄風(fēng)化濕方組大鼠糞便含水率明顯降低(P<0.05)。見圖1。

3.2 熄風(fēng)化濕方對大鼠內(nèi)臟敏感性的影響與空白組比較，模型組大鼠腹部抬起和背部拱起所需注水量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量熄風(fēng)化濕方組大鼠腹部抬起和背部拱起所需注水量明顯升高(P<0.05)，提示熄風(fēng)化濕方可降低 IBS-D 大鼠的內(nèi)臟敏感性。見圖2。

注：與空白組比校，*P<0.05；與模型組比校，#P<0.05圖1 各組大鼠糞便含水率的比較

注：A：腹部抬起所需注水量比較；B：背部拱起所需注水量比較；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖2 熄風(fēng)化濕方對大鼠內(nèi)臟敏感性的影響

3.3 熄風(fēng)化濕方對大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響空白組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，黏膜完整，腺體排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，固有層可見黏膜肌層；模型組大鼠結(jié)腸組織固有層有明顯中性粒細胞浸潤，間質(zhì)水腫嚴重，腺體排列紊亂，邊界不清晰，黏膜下層可見血管增生；低、高劑量熄風(fēng)化濕方組大鼠結(jié)腸組織的浸潤和水腫情況顯著改善，腺體增生愈合，排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰完整，未見明顯的炎癥細胞浸潤。如圖3。

3.4 熄風(fēng)化濕方對大鼠血清Ghrelin、CCK水平的影響與空白組比較，模型組大鼠血清Ghrelin、CCK水平明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量熄風(fēng)化濕方組大鼠血清Ghrelin、CCK水平顯著下降(P<0.05)。見圖4。

3.5 熄風(fēng)化濕方對大鼠免疫功能的影響與空白組比較，模型組大鼠血清IL-1β水平顯著上升(P<0.05)，IL-2水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量熄風(fēng)化濕方組大鼠血清 IL-1β 水平顯著降低(P<0.05)，IL-2水平顯著上升(P<0.05)。見圖5。

注：a：空白組；b：模型組；c：低劑量熄風(fēng)化濕方組；d：高劑量熄風(fēng)化濕方組圖3 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果(×200)

注：A：各組Ghrelin水平比較；B：各組CCK水平比較；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖4 各組大鼠血清腦腸肽Ghrelin、CCK水平的比較

注：A：各組IL-1β水平比較；B：各組IL-2水平比較；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖5 熄風(fēng)化濕方對大鼠免疫功能的影響

3.6 熄風(fēng)化濕方對大鼠腸黏膜γδT細胞的影響與空白組比較，模型組大鼠腸黏膜γδT細胞熒光強度顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量熄風(fēng)化濕方組大鼠腸黏膜γδT細胞熒光強度顯著降低(P<0.05)。提示熄風(fēng)化濕方可明顯降低 IBS-D 大鼠結(jié)腸黏膜γδT細胞的數(shù)量。見圖6。

3.7 熄風(fēng)化濕方對大鼠結(jié)腸組織中Jak/Stat通路蛋白表達變化的影響與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織Jak、Stat蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量熄風(fēng)化濕方組大鼠結(jié)腸組織Jak、Stat蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖7。

注：A：免疫熒光染色圖(藍色熒光：淋巴細胞；綠色熒光：γδT細胞；a：空白組；b：模型組；c：低劑量熄風(fēng)化濕方組；d：高劑量熄風(fēng)化濕方組)；B：黏膜γδT細胞熒光強度比較；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖6 各組大鼠腸黏膜γδT細胞數(shù)量的比較

注：A：Western Blot檢測Jak、Stat蛋白表達圖；B：Jak、Stat蛋白相對表達水平結(jié)果比較；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖7 各組大鼠結(jié)腸組織中Jak/Stat通路蛋白表達水平比較

4 討論

我國IBS-D的患病率高達6.5%，且呈逐年上升趨勢[14]。目前，西醫(yī)主要采用調(diào)節(jié)腸道菌群、止瀉、解痙等對癥治療方法治療IBS，但并未取得滿意的療效[15]。研究表明，中醫(yī)藥在治療IBS-D方面具有獨特的優(yōu)勢，可明顯改善腸道功能紊亂癥狀，降低復(fù)發(fā)率[16]。IBS-D在中醫(yī)屬于“泄瀉、腹痛、郁癥”等范疇，肝郁生風(fēng)、風(fēng)木乘脾、脾虛生濕為IBS-D的重要發(fā)病機制[11]。熄風(fēng)化濕方是南京中醫(yī)藥大學(xué)田耀洲教授在臨床實踐及中醫(yī)學(xué)理論的基礎(chǔ)上創(chuàng)制的用于治療IBS-D的中藥配方，具有柔肝熄風(fēng)、清熱化濕的功效，可雙向調(diào)節(jié)腸道活動，改善其電生理活動，降低內(nèi)臟敏感性[17]。本研究成功制備了IBS-D大鼠模型并給予熄風(fēng)化濕方治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，熄風(fēng)化濕方組大鼠的精神狀態(tài)、活動、飲食等情況均明顯好轉(zhuǎn)，糞便含水率和內(nèi)臟敏感性下降，血清腦腸肽、免疫功能指標得到改善，表明熄風(fēng)化濕方對IBS-D大鼠具有較好的治療作用。

Ghrelin由28個氨基酸組成，廣泛分布于胃腸道器官，少量存在于下丘腦、弓狀核、胎盤、腎臟等部位[18]，是體內(nèi)促生長激素分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)的天然配體，刺激生長激素(growth hormone，GH)的分泌[19]，當(dāng)Ghrelin與其受體結(jié)合后，能夠加快胃排空和小腸傳輸速度[20]。CCK是促使膽囊收縮的物質(zhì)，存在于十二指腸、大腦皮層、海馬、杏仁核、下丘腦等部位[21]。CCK以多種激素形式存在于血漿和胃腸組織中，促進胃腸道平滑肌興奮收縮，對胃腸道起到重要的調(diào)節(jié)作用；也可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，起著神經(jīng)遞質(zhì)的作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠血清Ghrelin、CCK水平顯著上升，表明IBS-D模型大鼠可能因大量分泌Ghrelin、CCK導(dǎo)致胃腸功能紊亂，出現(xiàn)腹瀉等癥狀；給予熄風(fēng)化濕方治療后，血清Ghrelin、CCK水平顯著下降，提示熄風(fēng)化濕方對IBS-D大鼠血清腦腸肽水平具有調(diào)節(jié)作用。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，IBS-D患者結(jié)腸黏膜組織中存在一些輕、中度非特異性炎癥，表明IBS-D的發(fā)生可能與免疫功能紊亂密切相關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠血清IL-1β水平明顯升高，IL-2水平明顯降低，表明IBS-D的發(fā)生與免疫功能紊亂有關(guān)；給予熄風(fēng)化濕方治療后，血清IL-1β水平顯著下降，IL-2 水平顯著上升，表明熄風(fēng)化濕方對改善大鼠免疫功能有較好的療效。γδT細胞是一類表型和功能獨特的T淋巴細胞亞群，是連接天然免疫和固有免疫的橋梁，決定機體特異性免疫應(yīng)答的類型，對維持黏膜免疫穩(wěn)態(tài)具有重要的作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腸黏膜γδT細胞數(shù)量明顯增加，而給予熄風(fēng)化濕方治療后，γδT細胞數(shù)量顯著降低，表明熄風(fēng)化濕方可有效調(diào)節(jié)IBS-D大鼠腸黏膜中γδT細胞的數(shù)量，調(diào)節(jié)免疫功能。Jak/Stat信號通路是由細胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在機體細胞的增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[25]。Jak/Stat信號通路與機體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，可參與腸道炎癥反應(yīng)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠結(jié)腸組織Jak、Stat蛋白表達水平顯著上升，經(jīng)熄風(fēng)化濕方治療后，Jak、Stat蛋白表達水平顯著下降，表明熄風(fēng)化濕方可通過調(diào)控Jak/Stat信號通路調(diào)節(jié)大鼠的免疫炎癥反應(yīng)。

綜上所述，熄風(fēng)化濕方能有效改善IBS-D大鼠的癥狀，降低大鼠血清Ghrelin、CCK水平，改善免疫功能，其機制可能與Jak/Stat信號通路的調(diào)控有關(guān)。腸道神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)協(xié)同完成腸道的神經(jīng)支配和調(diào)節(jié)，大鼠血漿中的P物質(zhì)及血管活性腸肽是中樞和腸道神經(jīng)系統(tǒng)中普遍存在的肽類物質(zhì)，與IBS-D的發(fā)生密切相關(guān)，本研究將進一步探究熄風(fēng)化濕方對IBS-D大鼠血漿及組織中P物質(zhì)和血管活性腸肽水平的影響，并探究其作用機制，進一步闡明熄風(fēng)化濕方對IBS-D大鼠的治療作用。