不同甜香風味特征的醬香型白酒中揮發(fā)性物質分析

莫新良，楊亮，吳德光，滕明德，鐘艷霞

（茅臺學院釀酒工程系，貴州仁懷 564501）

醬香型白酒是我國風味極其獨特的一個白酒酒種，它是以糯紅高粱為原料，高溫大曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)兩次投料、九次蒸煮、八次發(fā)酵、七次蒸餾取酒，并按不同輪次的醬香、醇甜、窖底香等基酒分類儲存，精心勾調而成的風格突出的蒸餾酒，因其醬香突出、酒體醇厚、香氣幽雅而深受消費者喜愛。其中，香氣是白酒品質的重要組成部分，是影響其質量和決定消費者喜好的感官成分之一。自上世紀六十年代茅臺試點開始，研究者們一直致力于探索醬香型白酒的特征香氣成分或主體香，從最初的4-乙基愈創(chuàng)木酚說到后來的吡嗪類、呋喃類和吡喃類衍生物說以及“高沸點酸性物質和低沸點酯類物質組成的復合香”說等幾種猜想的研究。雖然到目前為止，醬香主體香氣成分依然不清晰，但是，醬香白酒的主體香主要來源于多種香氣物質的復合香，這一觀點得到相當多的研究者認可。醬香型白酒香氣成分復雜、多樣，目前，已對其構成酒體的基酒香氣類型進行了大致分類：醬香、醇甜、窖底香。白酒中的甜香氣味是較為常見的風味之一，是構成“醇甜”香型的重要感官組分，是構成醬香型白酒復合香的主要成分，對白酒幽雅風味和高品質質量有重要的影響。醬香型白酒中甜香風味物質一直存在，現(xiàn)階段針對具有甜香風味特征的醬香型酒的系統(tǒng)研究報道甚少，明晰我國醬香型白酒甜香風味特征的化學本質將有助于為白酒產(chǎn)品品質提升提供科學依據(jù)。

醬香型白酒基質復雜，香氣成分種類多、含量低，實驗儀器無法對其進行直接分析，這需要將香氣物質從白酒基質中進行提取、分離和濃縮等樣品預處理后，才能采用氣相色譜質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等技術進行檢測分析。常見的白酒風味物質的預處理方法主要有：液-液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）、固相萃取法、頂空固相微萃取法（head-space solidphase microextraction，HS-SPME）法、液-液微萃取法（liquid-liquid microextraction，LLME）等，其中，HS-SPME 因具有操作簡單、快速、無需溶劑的優(yōu)點，在白酒香氣分析中應用得最為廣泛。僅用單變量分析風味物質存在籠統(tǒng)、缺少直觀性的缺點，若結合多元統(tǒng)計分析方法來分析，則能更好地概括白酒共性和準確地區(qū)分各種醬香型白酒的差異，多元統(tǒng)計分析方法如主成分分析法、偏最小二乘回歸法、偏最小二乘判別分析法（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等在酒類香氣研究方面已經(jīng)有了廣泛的應用。

本研究采用HS-SPME 結合GC-MS 技術剖析具有不同甜香風味特征的醬香型白酒的揮發(fā)性成分，用PLS-DA 法進一步解析不同甜香風味特征的醬香型白酒中揮發(fā)性風味物質差異性及其特征性香氣成分，為醬香酒的生產(chǎn)工藝及酒體設計提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬香型白酒樣品（酒精度53%）24 種，具有不同甜香風味香氣強度的醬香型白酒樣品分別編號為A1～A12（相同前綴酒樣取自同一酒廠不同車間，如A1 酒廠的兩個車間樣品分別為A1-1，A1-2），均由貴州地區(qū)醬香型酒廠釀制而成；正構烷烴標準品（C～C，色譜純）天津光復精細化工研究所；L-薄荷醇（色譜純）Sigma-Aldrich 公司；NaCl（分析純）上海國藥集團；超純水 自制。

7890A-5975C 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、DBFFAP 毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）美國Agilent 公司；Gerstel MPS 2 多功能自動進樣裝置德國Gerstel 公司；50/30 m DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭 美國Supelco 公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng) 美國Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 感官分析 參考文獻[19]的方法，由10 名具有豐富感官經(jīng)驗的白酒專業(yè)品酒人員組成感官評價小組，對醬香型白酒樣品的風味進行定量描述性感官分析。在25 ℃室溫條件下進行感官分析，反復對酒樣進行感官品評，經(jīng)過多次討論和篩選，描述出每個酒樣的感官屬性，確定主要的風味屬性為“陳香”、“甜香/味”、“醬香/味”、“酸香/味”和“苦味”等。感官品評采用6 點打分制（0～5 分）來衡量，其中，“0”表示未感知到該香氣，“3”表示香氣強度中等，“5”表示香氣最強。每個樣品每人重復3 次，取平均值作為最終的香氣強度值。依據(jù)感官屬性、參比物和風味強度建立感官品評標準見表1。

表1 醬香型白酒風味描述及參比物Table 1 Description and strength of flavor properties of sauce-flavor Baijiu

1.2.2 香氣物質的萃取分析 采用HS-SPME 法提取酒樣中風味物質，將酒樣稀釋至酒精度為10% vol后，取5 mL 稀釋酒樣、25 μL 內標（L-薄荷醇，200 mg/L）、1.5 g NaCl 加入頂空瓶內，密封后進行頂空固相微萃取。在萃取溫度為50 ℃條件下，預熱平衡5 min，萃取吸附40 min。萃取完成后，于GC 進樣口解析5 min（250 ℃），進行GC-MS 檢測分析。

1.2.3 香氣物質的檢測分析 運用GC-MS 技術分析酒樣中風味物質。

1.2.3.1 GC 條件 色譜柱為 DB-FFAP（60 m×0.25 mm×0.25 μm）。高純He 作為載氣，流速2 mL/min，不分流進樣模式，進樣口和檢測器溫度均為250 ℃。程序升溫：50 ℃保持2 min，以5 ℃/min 的速度升溫至230 ℃，維持12 min。

1.2.3.2 MS 條件 EI 電離源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍m/z 35～500 amu。

1.2.4 香氣物質定性與定量分析

1.2.4.1 定性分析 物質定性采用將未知物的圖譜與NIST14.L（Agilent Technologies Inc.）標準譜圖（MS）相比較初步定性，同時以與酒樣相同GCMS 條件下分析的C～C系列烷烴標樣保留時間為參考，計算每個已初步定性物質的保留指數(shù)（Retention Index，RI），并與已報道的文獻中相應物質保留指數(shù)比對進一步定性。

保留指數(shù)（RI）根據(jù)改進的Kovats 法計算得出，具體計算公式如下：

式中：t、t和t分別為未知物及其緊相鄰前后的正構烷烴的保留時間；n 和n+1 分別為緊鄰未知物前后的正構烷烴碳原子數(shù)。

1.2.4.2 定量分析 由半定量法根據(jù)內標峰面積與風味物質峰面積的比值，計算出揮發(fā)性物質的相對含量，計算公式如下：

式中：W和W分別為風味物質稀釋后的質量濃度和內標溶液的終濃度（mg/L）；A和A分別為風味物質的峰面積和內標的峰面積；N 為稀釋倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SIMCA 13.0（Umetricus，Sweden）對酒樣的風味物質進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），濃度單因素運用方差分析（ANOVA），值小于0.05 的物質為差異化合物，濃度熱圖等采用SPPS 軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 醬香型白酒樣品風味感官評價

為確定醬香型白酒樣品中的典型甜香風味，通過10 名白酒專業(yè)品酒人員的感官評價，選取了24種具有不同甜香風味強度的醬香型酒樣，將其分為“甜香/味”、“陳香”、“醬香/味”、“酸香/味”和“苦味”等感官屬性，分析結果見圖1。根據(jù)甜香強度的大小，24 個酒樣被分為三組，其中，A2-1、A2-2、A8-1和A8-2 四個酒樣甜香風味很明顯，甜香味強度在4.0～5.0 分，為第一組；A1-1、A1-2、A3-1、A3-2、A4-1、A4-2、A5-1、A5-2、A7-1、A7-2、A11-1、A11-2、A12-1 和A12-2 十四個酒樣的甜香味強度為3.0～4.0 分，為第二組；而A6-1、A6-2 和A9-1、A9-2、A10-1 和A10-2 六個酒樣的甜香味強度范圍在0.0～3.0 分之間，除了A10-1 和A10-2 外，其余四個酒樣的甜香味強度均小于2.0 分，并且這四個酒樣具有一定的后苦味，為第三組。

圖1 醬香型白酒酒樣感官風味分析Fig.1 Sensory analysis of flavor in sauce-flavor Baijiu samples

2.2 醬香型白酒中香氣物質分析

2.2.1 不同醬香白酒香氣物質組成分析 通過感官評價分析，選取醬香型酒廠具有代表性的12 個酒廠的24 種樣品用HS-SPME 結合GC-MS 法分析檢測，得到相關成分的總離子色譜圖，見圖2。經(jīng)質譜譜庫的檢索結合保留指數(shù)鑒定，分析得到化合物種類見表2。共鑒定出了68 種揮發(fā)性香氣成分，包括酯類27 種、醇類12 種、醛酮類化合物10 種、酸類3 種、芳香族化合物10 種和萜烯類化合物6 種。

圖2 醬香型白酒酒樣香氣成分總離子色譜圖Fig.2 Total ions chromatogram of ingredients of flavor in sauce-flavor Baijiu samples

2.2.2 不同醬香白酒香氣物質定量分析 根據(jù)定量分析結果可知（見表2），各化合物在不同酒樣中存在明顯差異。從不同香氣物質的含量上看，酯類化合物、芳香族類化合物和醇類化合物是醬香型酒中含量較為豐富的三類化合物，并且種類均達10 種以上。綜合酒樣中各類物質的含量情況，發(fā)現(xiàn)酯類化合物最豐富，其在各酒樣中的總含量為374.86～4441.5 mg/L，其中，酯類總含量較高的酒樣是A11-1和A11-2，達4441.5 和4222.7 mg/L，其次是A2-2、A8-1、A6-1、A8-2，分別達2755.5、2584.9、2534.6和2517.6 mg/L，這六個醬香型酒中酯類總含量明顯高于其它酒樣中的總含量（ANOVA，<0.05），6 個酒樣中除了A6-2 外，其余酒樣甜香強度值均大于3.0，說明酯類物質在甜香型酒中有一定的作用，但并不是風味物質總含量越高，酒樣的品質就越好，只有各類物質所占比例適宜時才能有利于白酒品質的提升。含量較高的酯類物質主要包括：己酸乙酯（20.93～1195 mg/L）、乳酸乙酯（27.54～657.73 mg/L）、丁酸乙酯（3.84～540.84 mg/L）、乙酸乙酯（24.06～601.14 mg/L）、乳酸異丁酯（3.54～229.09 mg/L）、辛酸乙酯（21.45～425.49 mg/L）、癸酸乙酯（15.19～200.42 mg/L）、戊酸乙酯（0.43～241.31 mg/L）和3-甲基丁酸乙酯（2.7～159.69 mg/L），這些酯類物質被證明是醬香白酒的骨架成分，在本研究的各酒樣中占很大的優(yōu)勢，其含量情況和文獻報道的相吻合。雖然大多酯類物質含量比較高，但是有些酯類物質含量卻很低甚至沒有，如乙酸糠酯（0～3.18 mg/L）和辛酸丙酯（0～5.13 mg/L）。酯類物質主要貢獻水果香和甜香，是構成醬香型典型性及綜合性香氣特征的關鍵物質。其中，乙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯是醬香白酒中香氣貢獻較大的化合物，丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯等被鑒定為茅臺酒中香氣最強的幾種重要風味物質，賦予茅臺酒幽雅甜香和水果香香氣，這些酯類物質在本研究醬香型白酒中含量均較高，且他們的香氣閾值均較低，故對醬香型白酒甜香風味特征有一定貢獻。

表2 不同醬香型白酒酒樣中揮發(fā)性香氣組分的種類及含量Table 2 Variety and contents of volatile compounds in different sauce-flavor Baijiu samples

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

芳香族化合物是第二大類含量較豐富的化合物。其在各酒樣中的總含量為29.91～1344.63 mg/L，其中，總含量較高的是A11-1 和A11-2，達1344.6和1312.9 mg/L，其次是A1-2、A1-1，分別達943.91和872.25 mg/L，這4 個醬香型酒中香氣總含量明顯高于其它酒樣中的總含量（ANOVA，<0.05）。其中2-苯乙酸乙酯含量最高（0.75～988.55 mg/L），在所檢測白酒樣品中的平均含量為236.64 mg/L。其次是乙酸-2-苯乙酯、2-苯乙醇和3-苯丙酸乙酯，含量分別為7.70～157.59、10.67～106.43 和0.89～131.36 mg/L。多數(shù)芳香族化合物主要貢獻甜香、水果香和花香。其中，具有蜂蜜甜香、玫瑰花香的2-苯乙酸乙酯、3-苯丙酸乙酯及2-苯乙醇在醬香白酒中被報道具有較高的香氣強度，對醬香型酒的整體甜香香氣輪廓具有重要的貢獻。3-苯丙酸乙酯、2-苯乙醇等化合物被鑒定是醬香型白酒風味物質中最有效的幾種具有水果和甜香香味的物質。2-苯乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、3-苯丙酸乙酯及苯乙醇的香氣閾值比較低，分別為0.406、0.908、0.125 和28.922 mg/L，而這些芳香族類物質在本研究醬香型白酒中含量均較高，對醬香型白酒甜香風味特征有重要貢獻。

醇類物質是第三大類物質，各酒樣中醇類物質的總含量為38.59～715.04 mg/L，A11-1 和A11-2 中的總含量達715.04 和615.89 mg/L，其次是A8-1 和A8-2，含量分別為516.72 和565.46 mg/L。所檢測白酒樣品中含量最高的醇類物質是3-甲基丁醇，除在A3-1（1.31 mg/L）和A3-2（0.02 mg/L）中含量很低外，在其他樣品中含量均很高，含量為22.05～522.37 mg/L，其次是1-庚醇（3.39～45.92 mg/L）和1-辛醇（0.72～38.53 mg/L）。大部分的醇類化合物主要呈現(xiàn)醇香、水果香和甜香，但其香氣閾值都較高，是醬香型白酒醇甜香味的基本組成物質。醇類物質不僅具有呈香呈味特征，而且還是醇甜和助香物質的主要來源，對酒醇甜風味的形成和促使酒體醇厚起著重要的作用。其中，2-甲基丙醇、3-甲基丁醇是醬香白酒中的重要香氣貢獻物質。

醛類物質在本研究中的含量不高，種類也不多，共有4 種，其中，具有甜香和杏仁香味的糠醛是所檢測樣品中醛類物質含量最高的化合物，含量從A6-2中的2.91 mg/L 至 A11-2 中的507.01 mg/L，和現(xiàn)有研究相一致?？啡┦轻u香型白酒中的香氣貢獻物質和重要特征香氣物質，被證明是醬香型白酒區(qū)別于其他香型白酒的主要標志性物質?？啡┰诎拙浦械拈撝禐?4.029 mg/L，因其在樣品中含量普遍較高，故對本研究醬香甜香風味白酒有重要貢獻。

酮類物質在本研究樣品中共6 種，含量均較低。揮發(fā)性酮類化合物大多具有青香、脂肪、奶油、花香等氣味，其閾值較高，對酒的香氣風味影響較小。

在本研究樣品中，共檢測到3 種揮發(fā)性酸類物質，分別是乙酸、3-甲基丁酸及丙酸。適量的酸類物質是構成白酒酸香韻味及協(xié)調白酒香氣平衡的主要香氣物質，且乙酸等脂肪酸能夠與醇通過酯化反應進一步形成酯類如乙酸乙酯等，對白酒的水果、甜香等風味具有重要貢獻，但是若乙酸等脂肪酸含量過高時，產(chǎn)生的酸腐、汗臭等難聞氣味則會對于白酒的整體香氣產(chǎn)生不利影響，故由這類物質對酒體產(chǎn)生甜香風味的可能性較小。

本研究樣品測得的六個萜烯類化合物分別為：松油醇、D-橙花醇、雪松醇、-柏木烯、-柏木烯和香葉基丙酮，這些萜烯類化合物在酒樣中所測得濃度比較低。萜烯類化合物廣泛存在飲料酒中，呈現(xiàn)特殊香氣，已在多種香型白酒中檢測到種類繁多的萜烯類物質。本研究檢測到的香葉基丙酮和橙花叔醇具有愉悅的甜香及花香香氣特征，被證明是葡萄酒中的重要香氣物質，在醬香型茅臺酒中具有很強的香氣強度，故對醬香型白酒甜香風味具有潛在的貢獻。

2.2.3 不同甜香風味醬香白酒特征物質解析 醬香型酒中的香氣成分復雜，為了更好、更直觀地區(qū)分不同甜香風味酒樣中關鍵成分的濃度差異及樣品之間的差異，根據(jù)檢測出的68 種物質，對24 種酒樣進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），結果見圖3。由PLS-DA 得分圖（圖3）得知，可以將24 種醬香型酒樣很好的區(qū)分為3 組，區(qū)分結果和根據(jù)感官分析中酒樣甜香風味強度分組結果一致，即A2（A2-1 和A2-2）和A8（A8-1 和A8-2）為第一組，A1、A3、A4、A5、A7、A11 和A12（A1-1、A1-2、A3-1、A3-2、A4-1、A4-2、A5-1、A5-2、A7-1、A7-2、A11-1、A11-2、A12-1 和A12-2）為第二組，A6（A6-1 和A6-2）、A9（A9-1 和A9-2）和A10（A10-1 和A109-2）為第三組。表明不同甜香風味醬香型酒樣之間香氣物質具有顯著差異。

圖3 醬香型白酒酒樣偏最小二乘判別分析Fig.3 PLS-DA of sauce-flavor Baijiu samples

同時，在PLS-DA 分析基礎上，通過分析變量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）來衡量變量香氣物質含量對組間樣本分類差異的貢獻能力，VIP>1 表示該香氣物質為“重要”變量，且VIP 值越大說明該物質對區(qū)分樣本分類差異的貢獻越大。以VIP>1 為篩選條件，篩選得到可以作為醬香型白酒甜香風味標志性物質,結果見圖4（VIP>1）所示。由圖4 可知，共有25 種風味物質對醬香型酒樣甜香風味差異有重要影響。

根據(jù)25 種甜香風味標志性化合物的濃度繪制熱圖，比較分析其在各樣品中的含量情況，如圖5所示。

圖5 醬香型酒樣中甜香相關風味物質的含量熱圖分析Fig.5 Analysis of heat map for the sweat volatile compounds in the sauce-flavor Baijiu samples

由圖4 可以看出，這24 個酒樣與甜香相關風味物質之間存在一定相關性，與之相關的甜香類物質主要為酯類物質，共13 種，分別是辛酸乙酯、己酸丙酯、乙酸己酯、丁酸己酯、己酸丁酯、辛酸丙酯、十一酸乙酯、戊酸丁酯、乳酸異丁酯、癸酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和壬酸乙酯；其次為醇類物質，共5 種，分別是1-戊醇、1-辛醇、3-甲基丁醇、3-辛醇和順式-6-壬醇；其他的是3 種酮類，分別是2-十三烷酮、2-十一烷酮，3-辛酮，2 種芳香族類分別是苯乙酸乙酯和苯乙酸異戊酯，以及1 種醛類和1 種酸類，分別是壬醛和乙酸。主要是因為醬香型白酒的生產(chǎn)工藝和環(huán)境條件不同。其中，甜香風味強度比較明顯的第一組代表性酒樣（A2-2、A8-1 和A8-2）的風味標志性物質是：3-甲基丁醇、辛酸乙酯和乳酸異丁酯（ANOVA，<0.05）；具有一定甜香風味強度的第二組代表性酒樣（A1-1、A1-2、A11-1 和A11-2）的風味標志性物質為：苯乙酸乙酯、3-甲基丁醇、辛酸乙酯和乳酸異丁酯（ANOVA，<0.05）。第三組酒樣風味特征物質不是很明顯。

圖4 68 種揮發(fā)性物質VIP 分析Fig.4 Analysis of VIP for the 68 volatile compounds

3 結論

本研究用感官分析法篩選出24 種具有不同甜香風味強度的醬香型白酒樣品，采用HS-SPME-GCMS 對68 種揮發(fā)性物質進行定性定量分析。發(fā)現(xiàn)酯類、芳香族類和醇類物質是不同醬香型酒中含量較為豐富的三類化合物。利用PLS-DA 進一步解析不同醬香型甜香風味酒中的風味物質差異性及特征性香氣成分，可以將24 種酒樣很好地區(qū)分為3 組，區(qū)分結果和感官分析中根據(jù)酒樣甜香風味強度分組結果一致，共有25 種香氣風味物質對醬香型酒樣甜香風味差異有重要影響。其中，甜香風味強度比較明顯的代表性酒樣的風味標志性物質主要為3-甲基丁醇、辛酸乙酯、乳酸異丁酯和苯乙酸乙酯，說明這些物質是造成不同甜香酒樣之間差異的重要香氣物質。

本研究首次對具有不同甜香風味特征的醬香型酒樣進行區(qū)分，并確定影響差異產(chǎn)生的重要揮發(fā)性物質及相關風味標志性物質。雖然已有研究對醬香型白酒中的重要香氣物質及呈香特性進行了較多研究，但是并未單獨系統(tǒng)的研究不同醬香型白酒甜香風味特征及風味差異物質。通過本研究，可以為不同醬香型白酒風味物質差異物質分析提供理論依據(jù)，并能為實際生產(chǎn)中醬香型成品白酒的勾調以及品質的提升提供理論支撐。目前，關于不同甜香風味特征的醬香型白酒風味物質鑒定的相關研究尚處于初級階段，并未對酒中風味物質進行GC-O 聞香及香氣活力值分析，關于重要甜香相關結果與結論還需在后續(xù)工作中進一步探究，可以用GC-O 聞香方法結合香氣重組實驗、缺失/添加等實驗進一步驗證重要甜香物質對醬香型白酒的貢獻。