市售四川臘肉中微生物群落結(jié)構(gòu)及生物胺的相關(guān)性研究

劉雨萱，任冠潔，魯家璇，陳玙玲，臧名洋，湯小玲，楊柳青，李建龍，劉書亮，何利，陳淑娟，李琴，楊勇

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

腌臘肉制品是指以鮮(凍)畜、禽肉或可食副產(chǎn)品為原料，添加或不添加輔料，經(jīng)腌制、烘干(或曬干，風(fēng)干)等工藝加工而成的非即食肉制品，包括臘肉、火腿、咸肉、香(臘)腸等，市場消費(fèi)量大，特別是在川渝地區(qū)[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計腌臘肉制品消費(fèi)量約占四川肉制品消費(fèi)總量的60%左右，四川臘肉是其中很重要的一個產(chǎn)品。傳統(tǒng)四川臘肉屬自然發(fā)酵肉制品，通常是以豬肉為原料，經(jīng)過預(yù)處理、碼味、腌制、煙熏、成熟等步驟制成，因其顏色鮮明、香味濃郁、臘味濃而無煙味等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛，馳名中外[2]。傳統(tǒng)四川臘肉的發(fā)酵過程主要依賴原料肉及環(huán)境中的微生物作用，將原料肉中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等氧化、分解，生成具有特殊風(fēng)味的小分子化合物。但是，在這個過程中某些微生物會利用原輔料產(chǎn)生對人體健康有害的成分，如生物胺。

生物胺是一種小分子有機(jī)堿性物質(zhì)，由醛、酮通過轉(zhuǎn)氨基作用生成脂肪族的生物胺或是由氨基酸在微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶的作用下生成相應(yīng)的生物胺。少量的生物胺是人體必需物質(zhì)，它能參與腦活動、胃酸分泌、免疫反應(yīng)等[3]，但高濃度的生物胺則會引起惡心、頭痛、血壓變化等不良反應(yīng)，嚴(yán)重中毒還會對心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆的損害[4]。部分生物胺還會與內(nèi)源性、外源性的亞硝酸鹽反應(yīng)，生成強(qiáng)致癌物N-亞硝胺，故而發(fā)酵食品中的生物胺水平已被用作衡量食品安全的指標(biāo)之一。LI等[5]、王新惠等[6]混合取樣測定了市售中國傳統(tǒng)香腸樣品、臘腸等，發(fā)現(xiàn)部分樣品中生物胺含量超過了美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。但是未見文獻(xiàn)報道與香腸類似的市售四川臘肉中生物胺含量，且目前檢測生物胺均為混合取樣，對肥、瘦肉中生物胺含量分布并不清楚。

目前，有學(xué)者對四川臘肉中微生物多樣性進(jìn)行了研究。文開勇等[7]利用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)四川臘肉中細(xì)菌多樣性指數(shù)高于真菌，優(yōu)勢屬為葡萄球菌屬。趙睿等[8]通過比較得到川渝地區(qū)煙熏臘肉優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門等。全拓等[9]通過平板計數(shù)法得出四川臘肉貨架期內(nèi)優(yōu)勢菌群為葡萄球菌和微球菌，其次是乳酸菌。DABADé等[10]調(diào)查了比利時市售食品中生物胺與微生物之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)：尸胺濃度與乳酸菌、腐胺濃度與總需氧菌計數(shù)、β-苯乙胺濃度與腸球菌呈顯著正相關(guān)。但是關(guān)于微生物群落結(jié)構(gòu)及四川臘肉中生物胺含量的相關(guān)性未見文獻(xiàn)報道。

故而本研究將通過測定市售四川臘肉中微生物群落結(jié)構(gòu)及肥、瘦肉的生物胺含量，分析四川臘肉中微生物與生物胺的相關(guān)性，為四川臘肉的質(zhì)量及安全性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

56種四川臘肉均購于各區(qū)域的農(nóng)貿(mào)市場或超市，按照地理位置分別是川北(廣元、綿陽、阿壩)，川西(雅安、成都、甘孜、眉山)，川南(宜賓、自貢、樂山)，川東(南充、巴中、遂寧)。樣品采樣后立即置于無菌取樣袋中封存，低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立即取樣用于微生物分析。其余樣品保存在-80 ℃，用于生物胺檢測及備用。

組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、苯乙胺、亞精胺、丹磺酰氯等標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；乙腈、丙酮、甲醇均為色譜級，成都浩搏優(yōu)科技有限公司；PCA培養(yǎng)基、MRS瓊脂、MSA培養(yǎng)基、VRBA培養(yǎng)基，杭州微生物試劑公司；PDA培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；超純水等為實(shí)驗(yàn)室自制。

ST16R高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific公司；YQ-DSX-280B高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；BMS602均質(zhì)機(jī)，德國BRT；DHP-9272B型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JA1203型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；LC-2010CHT高效液相色譜儀，美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物檢測方法

取25 g樣品，加入225 mL無菌生理鹽水后，高速均質(zhì)3 min，吸取1 mL上清液進(jìn)行梯度稀釋。參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》的方法對樣品中菌落總數(shù)進(jìn)行測定。參照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》方法對樣品中乳桿菌進(jìn)行測定。參照GB 4789.41—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 腸桿菌科檢驗(yàn)》的方法對樣品中腸桿菌科進(jìn)行測定。參照GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計數(shù)》的方法對樣品中霉菌和酵母進(jìn)行測定。參照劉洋[11]的方法對樣品中葡萄球菌和微球菌進(jìn)行測定。

1.2.2 生物胺的檢測

1.2.2.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

參照LU等[12]的方法，準(zhǔn)確稱取10 mg組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、亞精胺、苯乙胺，用0.4 mol/L高氯酸定容至10 mL，為各單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，貯存于4 ℃冰箱備用。分別吸取10、20、25、50、100、250、500、1 000 μL的各單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液定容至10 mL，為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行柱前衍生，其余于4 ℃冰箱備用。

1.2.2.2 樣品處理

參照SUN等[13]的方法，略作修改。分別取5 g 瘦肉、5 g肥肉加入20 mL 0.4 mol/L高氯酸，高速勻漿3 min，過濾上清液，沉淀部分如上述步驟再提取1次。合并2次上清液定容至50 mL，取1 mL進(jìn)行柱前衍生。

1.2.2.3 柱前衍生

參照LU等[12]的方法，依次加入200 μL 2 mol/L NaOH、300 μL飽和NaHCO3、2 mol/L丹磺酰氯丙酮溶液，最后用乙腈定容至5 mL，過0.22 μm濾膜，上機(jī)檢測。

1.2.2.4 柱前衍生

參照孫霞[14]的方法，色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，流動相A為超純水，流動相B為色譜級乙腈，采用梯度洗脫程序進(jìn)行分離，如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)下的平均值，所有生物胺含量數(shù)據(jù)均通過水分含量換算成干基物質(zhì)含量。數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算各指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；采用R語言Corrplot包進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著；繪圖使用R語言、Origin 2020、Microsoft office Excel 2007 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 四川臘肉中微生物群落結(jié)構(gòu)

四川臘肉中群落結(jié)構(gòu)如圖1所示，可以看出川南地區(qū)臘肉中微生物數(shù)量最多，其次是川西地區(qū)，川北和川東地區(qū)差距不大，川東地區(qū)最低。張佳敏等[15]檢測了四川傳統(tǒng)臘腸中微生物含量，川南地區(qū)臘腸中微生物含量最高，川北地區(qū)、川西地區(qū)和川東地區(qū)呈現(xiàn)不顯著差異，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致?？赡苁且?yàn)榇系貐^(qū)濕度較高、風(fēng)速較低，川南地區(qū)臘肉中水分散失較慢，有利于微生物生長；而川東地區(qū)氣候比較干燥，相對濕度較低，水分散失較快，限制了微生物的生長[16]。

從圖1可以看出，川北地區(qū)霉菌和酵母是臘肉貨架期中主要的優(yōu)勢菌群，其次是乳桿菌及葡萄球菌和微球菌，川西地區(qū)優(yōu)勢菌群是霉菌和酵母以及乳桿菌，川南地區(qū)優(yōu)勢菌群為霉菌和酵母菌，乳桿菌、葡萄球菌和微球菌次之，川東地區(qū)優(yōu)勢菌群為乳桿菌，葡萄球菌和微球菌次之?？偟膩碚f，四地區(qū)含量最高的為霉菌、酵母菌或乳酸菌，葡萄球菌和微球菌次之，最低的是大腸桿菌。這與文開勇等[7]的研究不一致，文開勇等通過高通量測序技術(shù)獲得四川臘肉中優(yōu)勢細(xì)菌門為厚壁菌門，優(yōu)勢細(xì)菌屬為為葡萄菌屬，趙睿等[8]利用高通量測序分析市售工業(yè)臘肉細(xì)菌多樣性時也發(fā)現(xiàn)川渝地區(qū)厚壁菌門是絕對優(yōu)勢菌門，這可能一方面是因?yàn)槲拈_勇等僅測了四川達(dá)州地區(qū)6份臘肉樣品,趙睿等檢測的是市售工業(yè)臘肉，不包括農(nóng)家自制臘肉，與本實(shí)驗(yàn)所選樣本不同；另一方面可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所采用的方法僅能檢測可培養(yǎng)微生物，部分不可培養(yǎng)微生物無法檢測。陳美春等[17]研究表明四川臘肉中優(yōu)勢菌為乳酸菌和葡萄球菌，貯藏后期霉菌大量增長，甚至超過乳酸菌，與本研究結(jié)果一致。

圖1 四川各地區(qū)臘肉中群落結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of microbial community in Sichuan bacon from various regions

2.2 四川臘肉中生物胺含量

2.2.1 生物胺標(biāo)品色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖2所示，雜質(zhì)峰及溶劑峰在6 min前全部洗脫，標(biāo)準(zhǔn)品峰能夠較好分離。標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示，7種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)較高，說明該方法能較為準(zhǔn)確的測出生物胺含量。

1-色胺；2-苯乙胺；3-腐胺；4-尸胺；5-組胺；6-酪胺；7-亞精胺圖2 生物胺標(biāo)品色譜圖Fig.2 Chromatograms of biogenic amine standards

表2 生物胺回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Biogenic amine regression equation and correlation coefficient

2.2.2 市售四川臘肉中生物胺含量

市售四川臘肉中生物胺含量相應(yīng)結(jié)果見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.ts.20220124.2034.010.html)。

組胺是毒性最強(qiáng)的生物胺，歐盟規(guī)定食品中組胺含量不得超過100 mg/kg。由圖3可知組胺主要集中在瘦肉中，瘦肉中組胺含量超過100 mg/kg的樣品有27個，肥肉中13個，說明四川臘肉中組胺含量偏高，需要進(jìn)行控制。而川北地區(qū)肥肉中平均含量超過瘦肉，這可能是因?yàn)榇ū钡貐^(qū)臘肉的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物更能促進(jìn)組氨酸化學(xué)脫羧形成組胺[18]。從地區(qū)來看，川南地區(qū)臘肉中組胺含量最高，瘦肉中組胺平均值為144.59 mg/kg，肥肉中組胺平均值為65.17 mg/kg；川東地區(qū)臘肉組胺含量最低，瘦肉中組胺平均值為78.49 mg/kg，肥肉中組胺平均值為21.66 mg/kg，整體趨勢與微生物結(jié)構(gòu)類似。

酪胺的毒性僅次于組胺，但也有研究證明在作用于人腸上皮細(xì)胞的體外模型上時,酪胺比組胺的毒性更大[19]。LATORRE-MORATALLA等[20]報道酪胺是西班牙市售發(fā)酵干香腸中最常見、含量最豐富的生物胺。在四川臘肉中，酪胺并非含量最多的生物胺，在瘦肉中平均值為67.92 mg/kg，肥肉中平均值為0.66 mg/kg，這可能是因?yàn)槔野彼嶂饕性谑萑庵?，并且脂質(zhì)氧化產(chǎn)物等無法促進(jìn)酪胺形成。從地區(qū)來看，川南地區(qū)臘肉中酪胺含量最高，川北地區(qū)、川西地區(qū)臘肉次之，川東地區(qū)臘肉中酪胺含量最低。

尸胺和腐胺本身毒性較小，但他們能夠抑制單胺氧化酶和其他代謝組胺的酶，從而增強(qiáng)組胺毒性，同時在加熱過程中，腐胺和酪胺還會與亞硝酸鹽形成N-亞硝胺等致癌物，故而有必要對四川臘肉中尸胺和腐胺含量進(jìn)行檢測[21]。尸胺在肥、瘦肉中均有檢出，瘦肉中平均值為128.23 mg/kg，肥肉中平均值為91.43 mg/kg，是四川臘肉中含量第二高的生物胺。WANG等[22]研究表明尸胺是干腌培根中主要的生物胺，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，這可能是因?yàn)樗鶛z測樣品種類及地區(qū)不一致。腐胺肥瘦肉中均有，且腐胺在肥肉中含量較高，這可能是因?yàn)楦返脑现弧劝滨０房梢源嬖谟谥局衃23]。從地區(qū)來看，尸胺在川南地區(qū)臘肉中含量最高，川東地區(qū)臘肉中含量最低；腐胺在四地區(qū)臘肉中含量都較高，川西地區(qū)臘肉中最高，川南地區(qū)最低。

攝入過量的苯乙胺、色胺會引發(fā)高血壓、嘔吐、出汗、頭疼等反應(yīng)，甚至還會引起腸細(xì)胞的壞死和凋亡[24]。歐洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)報道發(fā)酵肉制品中苯乙胺高達(dá)182 mg/kg，色胺達(dá)194 mg/kg[25]。四川臘肉瘦肉中苯乙胺平均值達(dá)68.95 mg/kg，色胺平均值達(dá)171.49 mg/kg；肥肉中苯乙胺含量達(dá)33.55 mg/kg，色胺為15.62 mg/kg，與EFSA報道結(jié)果接近。從地區(qū)來看，苯乙胺含量在四地區(qū)臘肉中相差不大；色胺在川南地區(qū)臘肉瘦肉中檢出最高。

亞精胺會引起腸細(xì)胞壞死，但是通常情況下食品中亞精胺濃度不具有細(xì)胞毒性。四川臘肉中亞精胺主要來源于原料肉，其會根據(jù)原料肉來源及部位不同而有所區(qū)別，含量差異較大[24]。川西地區(qū)臘肉中亞精胺最高，瘦肉達(dá)161.61 mg/kg，肥肉達(dá)133.50 mg/kg；川東臘肉中亞精胺含量最低，瘦肉為62.35 mg/kg，肥肉為37.60 mg/kg。

從總生物胺含量來看，市售四川臘肉瘦肉中含量高于肥肉中，瘦肉中總生物胺含量在162.8～2 161.58 mg/kg，平均值為574.15 mg/kg；肥肉中總生物胺含量在NA(未檢出)～1 158.52 mg/kg，平均值為338.44 mg/kg，與孫霞[14]檢測結(jié)果接近。如圖3所示，市售四川臘肉中，川南地區(qū)臘肉中生物胺總量最高，其次是川西地區(qū)和川北地區(qū)，川東地區(qū)臘肉最低，與微生物結(jié)果一致，這可能也與該地區(qū)溫度、濕度等環(huán)境因素有關(guān)。與孫霞[14]結(jié)果不一致，這可能是樣品種類不同所導(dǎo)致。

圖3 市售四川臘肉肥肉及瘦肉中總生物胺的含量Fig.3 The content of total biogenic amines in commercial Sichuan bacon

2.3 市售四川臘肉中微生物群落結(jié)構(gòu)與生物胺的相關(guān)性分析

通過Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，評估市售四川臘肉中群落結(jié)構(gòu)與肥肉、瘦肉中生物胺含量之間的相關(guān)性，結(jié)果如圖4所示。

SH-瘦肉組胺；SL-瘦肉酪胺；SS-瘦肉尸胺；SF-瘦肉腐胺；SSE-瘦肉色胺；SY-瘦肉亞精胺；SB-瘦肉苯乙胺；SZ-瘦肉總生物胺；FH-肥肉組胺；FL-肥肉酪胺；FS-肥肉尸胺；FF-肥肉腐胺；FSE-肥肉色胺；FY-肥肉亞精胺；FB-肥肉苯乙胺；FZ-肥肉總生物胺；VRBA-大腸桿菌；PCA-菌落總數(shù)；MSA-葡萄球菌和微球菌；MRS-乳桿菌數(shù)；PDA-霉菌和酵母；ZM-總微生物數(shù)圖4 四川臘肉微生物群落結(jié)構(gòu)與肥肉、瘦肉中生物胺的相關(guān)性Fig.4 Correlation between the microbial community structure and the biogenic amines in fatty and lean meat of Sichuan bacon注：*表示顯著相關(guān)(P<0.05)，**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)，***表示極顯著相關(guān)(P<0.001)

大腸桿菌與肥肉、瘦肉中各種生物胺均沒有顯著相關(guān)性。菌落總數(shù)與瘦肉中總生物胺含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.28，與肥肉中組胺、腐胺含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)-0.36、-0.52。葡萄球菌、微球菌數(shù)與肥肉中組胺、腐胺含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.35、-0.52。乳酸桿菌與肥肉中腐胺含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.38。霉菌、酵母與瘦肉中總生物胺含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.36，與肥肉中組胺含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與肥肉中腐胺含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。GARDINI等[26]報道總生物胺與菌落總數(shù)呈顯著正相關(guān)，腸桿菌與發(fā)酵香腸中生物胺呈正相關(guān)，乳酸菌與組胺、酪胺、尸胺、腐胺形成都有關(guān)。這可能一方面是因?yàn)闃悠返脑?、加工方式、生產(chǎn)環(huán)境等不同，而這些因素都對生物胺的形成有影響；另一方面是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)只檢測了可培養(yǎng)微生物，而不可培養(yǎng)微生物可能很大程度影響了一些生物胺的形成，這需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法測定可培養(yǎng)微生物，高效液相色譜法測定生物胺含量，探明了四川區(qū)臘肉中微生物群落結(jié)構(gòu)、生物胺含量及其相關(guān)性。結(jié)果表明，市售四川臘肉中最主要的微生物是霉菌、酵母及乳酸菌，川南地區(qū)臘肉中微生物數(shù)量最多，川東地區(qū)最低。四川臘肉中總生物胺含量與微生物趨勢一致。色胺和尸胺是四川臘肉中含量最多的生物胺，都主要存在于瘦肉中(P<0.05)；組胺在肥、瘦肉中均含有(P>0.05)，川北地區(qū)臘肉肥肉中組胺含量高于瘦肉；酪胺主要存在于瘦肉中(P<0.05)；腐胺在肥、瘦肉中分布較為均勻(P>0.05)。56種四川臘肉樣品中有27個樣品瘦肉中組胺含量超過100 mg/kg，肥肉中有14個樣品，存在一定的安全隱患。通過Spearman分析得到，菌落總數(shù)與瘦肉總生物胺呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.28；霉菌和酵母數(shù)與瘦肉總胺呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.36。綜上，市售四川臘肉中微生物群落結(jié)構(gòu)與生物胺含量存在一定的相關(guān)性，且市售四川臘肉中生物胺含量普遍較高，需要對其進(jìn)行控制。