川芎改善非酒精性脂肪性肝炎的作用機制

王玉平，龔瑾，李沙沙，章正，楊倩之，單璐琛

（1.暨南大學 附屬第一醫(yī)院 藥學部，廣東 廣州 510630；2.暨南大學 附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，廣東 廣州 510630；3.暨南大學 藥學院，廣東 廣州 510000）

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝臟功能障礙的常見病因，目前已成為全球流行疾病，這種疾病可以發(fā)展為一種晚期形式，稱為非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）［1］。在NAFLD譜系中，NASH發(fā)展為纖維化并進展為肝硬化的風險最高［2］，影響約3%～5%的普通人群，NASH預計將成為肝硬化和終末期肝病的主要原因［3］。但目前NASH發(fā)病機制的分子基礎(chǔ)尚不清楚，也無有效的治療方法及藥物，因此，尋找治療NASH安全有效的方法和藥物至關(guān)重要。

川芎（CX）是植物川芎（Ligusticum Chuanxiong Hort.）的干燥根莖，一種非常常見的中藥，在中國被廣泛應用，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在《本草綱目》中記載其燥濕、止瀉痢、行氣開郁，主要用于治療風冷頭痛眩暈、脅痛腹疼、寒痹痙攣、經(jīng)閉、難產(chǎn)、產(chǎn)后瘀阻塊痛、癰疽瘡瘍等癥狀［4］。研究認為其主要成分阿魏酸、川芎嗪等，已被發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、改善血脂、提高血液流動性、抑制血小板聚集和發(fā)揮抗氧化活性等作用［5］。雖然川芎被報道具有抗炎、改善血脂等作用，但其對NASH或NAFLD的作用鮮有報道。

探究中藥成分對于疾病的主要分子作用機制與信號通路，是目前探索中藥方劑藥理機制的綜合有效的方法。本研究以川芎為研究對象，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，采用多成分、多靶點、多通路的思路挖掘川芎改善NASH的作用機制，為后續(xù)研究提供依據(jù)。另外，本研究通過擬建立NASH小鼠動物模型，給予模型鼠川芎提取物治療，觀察川芎對NASH的改善效果，為臨床藥物的開發(fā)和應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化合物的篩選與潛在靶點的選取

在中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，https：／／old.tcmsp-e.com／tcmsp.php）進行化合物成分和靶點的篩選，設(shè)置Herb name的檢索條件下以“川芎”為關(guān)鍵詞檢索其化學成分，口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件對川芎中的有效成分進行篩選。利用pubchem數(shù)據(jù)平臺（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／），搜索SMILES結(jié)構(gòu)后錄入Swiss Target Prediction（http：／／www.swisstargetprediction.ch／），進行靶點預測獲得化合物作用靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：／／www.uniprot.org／）得到上述靶點物種設(shè)定為人的基因名。

1.2 NASH相關(guān)靶點的選取

利用DisGenet數(shù)據(jù)庫（http：／／www.disgenet.org）以“NASH”，“Nonalcoholic steatohepatitis”，“Non-alcoholic steatohepatitis”為關(guān)鍵詞，搜索NASH的疾病靶點，將獲得的靶點導出備用。

1.3 川芎改善NASH的核心靶點篩選

將所獲得的川芎的潛在靶點與NASH疾病靶點導入Calculate and draw custom Venn diagrams平臺（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）繪制韋恩圖并獲得共有的靶點作為核心靶點，將核心靶點導入String數(shù)據(jù)庫（http：／／string-db.org／）獲得PPI蛋白互作相關(guān)信息，將上述信息導入Cytoscape 3.8.0軟件進行編輯及網(wǎng)絡(luò)分析，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點相關(guān)性信息。

1.4 “川芎-成分-靶點-NASH”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape軟件對川芎、有效成分、核心靶點、NASH的關(guān)聯(lián)關(guān)系進行可視化，繪制關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO富集分析和KEGG通路分析

將核心靶點錄入到Metascape分析系統(tǒng)中（https：／／metascape.org／gp／index.Html＃／main／step1），將篩選條件設(shè)置為“H.sapiens”，分別GO富集分析和KEGG通路分析，并將獲得信息導入微生信網(wǎng)（http：／／www.bioinformatics.com.cn／）進行GO富集分析柱狀圖和KEGG通路分析氣泡圖的繪制。

1.6 分子對接驗證

在PPI網(wǎng)絡(luò)中選取度值排列前5的蛋白靶點與川芎有效成分度值排列前5的化合物進行分子對接驗證。利用PDB數(shù)據(jù)庫（https：／／www.rcsb.org／）下載PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心蛋白的結(jié)構(gòu)，并Pymol去除其配體和水分子；利用PubChem數(shù)據(jù)庫（http：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）下載川芎核心化合物的sdf文件，用OpenBabel軟件將其轉(zhuǎn)化為mol2格式，得到的配體（化合物）及受體（蛋白結(jié)構(gòu)）運用autodock軟件進行分子對接，最后用Pymol軟件將對接結(jié)果絕對值最大的4種組合進行可視化。配體和受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定能量越低，產(chǎn)生作用可能性越大。當結(jié)合能絕對值大于4.25 kcal／moL時，表示分子與靶點具有一定的結(jié)合能力，當結(jié)合能絕對值大于5.0 kcal／moL時，表示結(jié)合能力較強。

1.7 動物與試劑

C57雄性小鼠，SPF級，（20±2）g，購自浙江維通利華實驗動物有限公司，許可證號SCXK（浙）2019-0001。高脂飼料（D12108C）購自美國Research Diets有限公司，其中含40%脂肪和1.25%膽固醇。TC、TG生化分析試劑盒購自南京建成科技有限公司。ALT、AST檢測試劑盒和HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。高速低溫離心機購自Sigma公司。

1.8 動物實驗

1.8.1 川芎提取物制備

川芎飲片購自廣東和祥制藥有限公司，原產(chǎn)地為四川，為道地藥材，符合中國藥典2015年版一部的相關(guān)規(guī)定。飲片采用10倍量水煎煮提取2次，每次2 h，水煎濃縮；然后醇沉，第1次醇沉體積分數(shù)為60%，4℃冷藏24 h，濃縮；第2次醇沉體積分數(shù)為80%，4℃冷藏48 h，濃縮得到樣品，再進行大孔樹脂分離得到樣品。根據(jù)川芎提取率計算，稀釋成川芎組分質(zhì)量濃度為1 mg／mL；川芎提取物（chuanxiong total extracts，CTE）給藥組50 mg·kg-1·d-1灌胃。

1.8.2 動物造模及取材

試驗前小鼠經(jīng)過1周的適應性喂養(yǎng)，期間小鼠飼喂普通日糧，自由采食飲水。1周后隨機將小鼠隨機分為以下3組：正常對照組（Ctrl）、NASH模型組（NASH）、川芎提取物給藥組（CTE），10只／組，5只／籠飼養(yǎng)，每天更換水瓶，每2 d更換1次墊料。Ctrl組小鼠給予普通飼料，NASH組及CTE組小鼠給予高脂飼料，同時CTE組采用灌胃的方式進行給藥，每天給藥2次。Ctrl組與NASH 組小鼠給予對應體積的生理鹽水。實驗持續(xù)10周，每周稱量并記錄小鼠體質(zhì)量。實驗結(jié)束后，小鼠禁食12 h，第2天取材。麻醉小鼠后心臟取血，于4℃，3 500 r／min的條件下離心15 min，測定各組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量。同時適量稱取小鼠肝臟組織，用組織勻漿機制備肝臟組織勻漿，按照試劑盒說明書操作，檢測小鼠肝臟組織中的TG、TC含量。部分小鼠肝臟組織約0.5 cm3固定于10%的甲醛液中，之后組織脫水，行HE染色。本研究通過暨南大學實驗動物倫理委員會審批（20210603-01）。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。計量資料采用mean±SD表示，3組間比較用One-Way ANOVA方差分析和Student's t檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 川芎化合物和潛在靶點的收集

本研究通過對樣本數(shù)量以及后續(xù)數(shù)據(jù)的研究價值考慮，選擇OB≥30%且DL≥0.18作為篩選川芎化學成分的條件。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到川芎化學成分189個，其中符合篩選條件的化學成分7個（有效成分5個，川芎醌、川芎哚未預測到相關(guān)靶點），具體信息見表1。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫搜索上述化合物的關(guān)聯(lián)靶點共計307個，采用UNIPROT數(shù)據(jù)庫將靶點名標準化。

表1 川芎主要活性成分信息Table 1 The main active components information of Chuanxiong

2.2 NASH相關(guān)靶點的選取

通過DisGenet數(shù)據(jù)庫以“NASH”，“Nonalcoholic steatohepatitis”，“Non-alcoholic steatohepatitis”為關(guān)鍵詞，檢索非酒精性脂肪肝炎相關(guān)靶點434個。

2.3 川芎改善NASH的核心靶點篩選

繪制川芎改善NASH核心靶點韋恩圖，并獲得靶點44個（圖1）。將核心靶點輸入String數(shù)據(jù)庫中，以medium confidence（0.400）為篩選條件，最終獲得核心靶點39個，獲得川芎改善NASH蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。將PPI數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件，并按照度值排序獲得核心靶點數(shù)據(jù)（表2）。

圖1 核心靶點韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the core target

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Protein Interaction（PPI）Network

表2 川芎改善NASH核心靶點信息Table 2 The core target information of Chuanxiong

2.4 川芎改善NASH“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

分別將“藥物-成分”、“成分-靶點”、“靶點-疾病”的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件，通過網(wǎng)絡(luò)將其連接起來，并剔除不相關(guān)的靶點，將川芎改善NASH“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進行可視化（圖3）。

圖3 川芎改善NASH網(wǎng)絡(luò)Figure 3 The network of Chuanxiong improving NASH

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析

川芎治療NASH的GO富集結(jié)果見圖4。富集的生物過程包括炎癥反應的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的調(diào)控、細胞對脂質(zhì)的反應、蛋白激酶活性的調(diào)節(jié)、激素水平的調(diào)節(jié)、對營養(yǎng)水平的反應、類固醇代謝過程、脂質(zhì)定位的調(diào)節(jié)等，涉及炎癥反應、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)代謝等生物過程；細胞組成主要涉及細胞膜、囊泡、受體、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復合物、轉(zhuǎn)移酶等；分子功能主要包括了核受體激活、蛋白酶激活、脂肪酸綁定、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運活性等。

圖4 川芎改善NASH GO富集分析柱狀圖Figure 4 GO enrichment analysis histogram

川芎治療NASH的KEGG通路分析結(jié)果見圖5，按基因在通路中的比例排序，具體通路信息見表3。川芎治療NASH與眾多通路有關(guān)，可能通過調(diào)節(jié)PPAR 信號通路、AMPK 信號通路、cAMP信號通路、Wnt信號通路等發(fā)揮作用。

圖5 川芎改善NASH KEGG通路分析氣泡圖Figure 5 KEGG signaling pathway analysis bubble plot

表3 川芎改善NASH KEGG通路分析Table 3 KEGG signaling pathway analysis

2.6 分子對接驗證結(jié)果

在PPI網(wǎng)絡(luò)中選取度值排列前5的蛋白靶點EGFR、ESR1、PPARG、MAPK14、PPARA與川芎有效成分度值排列前 5 的化合物谷甾醇（sitosterol）、楊梅酮（Myricanone）、亞油酸乙酯（Mandenol）、川芎萘呋內(nèi)酯（wallichilide）、阿魏酸（FA）進行分子對接驗證，其 中 PPARG 和Myricanone、PPARA 和 Myricanone、PPARA 和Sitosterol、PPARA和wallichilide的分子對接結(jié)果結(jié)合能絕對值最高，分別對其進行可視化，具體結(jié)構(gòu)如圖6、表4所示。

表4 川芎改善NASH KEGG分子對接信息Table 4 KEGG Molecular Docking Information

圖6 川芎改善NASH分子對接圖Figure 6 Molecular docking map

2.7 動物實驗

2.7.1 一般情況及體質(zhì)量變化

實驗期間3組小鼠飲食及排便基本正常，正常組小鼠反應迅速，動作靈敏，皮毛整潔有光澤；NASH模型組小鼠活動較少，皮毛油膩；CTE給藥組一般情況有所緩解，CTE組體質(zhì)量較NASH組明顯下降，但與對照組無顯著差異（圖7）。

圖7 各組體質(zhì)量曲線圖Figure 7 Body mass graph of each group

2.7.2 血清酶學及肝臟脂質(zhì)水平比較

與正常對照組比較，NASH模型組肝臟組織TC、TG水平，血清ALT、AST均明顯升高，有顯著差異（P＜0.05）。與CTE組比較，NASH模型組血清ALT、AST，肝臟組織TG水平均明顯下降（P＜0.05），但肝臟組織TC水平差異無統(tǒng)計學意義（圖8）。

圖8 各組小鼠血清酶學及肝臟脂質(zhì)水平比較Figure 8 Comparison of serum enzymology and liver lipid levels of mice in each group

2.7.3 小鼠肝病理變化

由圖9可見正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞核形態(tài)、大小均一，未見明顯異常。NASH模型組肝細胞明顯腫脹，水樣變性，可見散在或灶性肝細胞氣球樣變，形成脂肪樣空泡，CTE給藥組小鼠肝小葉脂肪變程度較模型組明顯改善。

圖9 各組小鼠肝臟HE染色（×200）Figure 9 HE staining of mouse liver in each group（×200）

3 討論

NASH是一種以炎性浸潤和脂肪變性為主要特征的慢性肝病，其與肥胖、血脂異常、胰島素抵抗等諸多代謝性致病因素密切相關(guān)，又被稱為代謝性肝炎［6］。目前藥物對NAFLD 患者并存的NASH特別是肝纖維都無肯定的治療效果［7］。本研究根據(jù)文獻報道［8］，制備川芎提取物，并建造動物模型，結(jié)果表明體質(zhì)量曲線及血液生化指標顯示造模成功，川芎提取物治療組較NASH模型組血清ALT、AST及肝臟組織TG均有明顯改善作用（P＜0.05），并明顯減輕小鼠肝小葉脂肪變程度，顯示該模型效果明顯，成功率較高。

氧化應激所導致的脂質(zhì)氧化和氧化過程中的系列產(chǎn)物，也是引起NASH肝損傷的主要機制之一［9］。本研究GO富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)川芎改善NASH炎癥反應與脂質(zhì)代謝、核受體和蛋白酶激活、脂肪酸綁定、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運活性等相關(guān)。據(jù)報道，NASH的病理生理學很復雜，主要特征是脂肪變性以及肝細胞損傷和炎癥反應，常與2型糖尿病和胰島素抵抗相關(guān)，也可能存在于許多其他內(nèi)分泌疾病中，例如多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能低下，男性性腺功能低下、生長激素缺乏或糖皮質(zhì)激素過多［10］；來自NASH患者的肝細胞檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有異常的脂質(zhì)成分，脂質(zhì)的積累會導致細胞器功能障礙，細胞損傷和死亡以及慢性炎癥，推斷NASH發(fā)病機理和潛在治療靶標的脂質(zhì)種類和代謝途徑，包括參與脂肪酸和甘油三酸酯合成的酶，生物活性鞘脂和多不飽和衍生的類花生酸，以及親脂性脂質(zhì)介體［11］。本研究的KEGG通路富集結(jié)果顯示，川芎治療NASH與眾多通路有關(guān)，可能通過調(diào)節(jié)PPAR 信號通路、AMPK 信號通路、cAMP信號通路、Wnt信號通路等發(fā)揮作用。氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是在脂質(zhì)代謝和炎癥中起調(diào)節(jié)作用的核受體，這使得PPARs被認為是一種潛在的治療NASH的作用靶點［10，12］，一些靶點PPARs激動劑已經(jīng)被證實對NASH具有治療作用［13-15］。研究發(fā)現(xiàn)NASH相關(guān)的肝細胞凋亡被AMPK細胞能量狀態(tài)的主要傳感器所抑制，NASH小鼠AMPK活性降低，而肝臟特異性AMPK敲除（LAKO）小鼠研究表明，AMPK的缺失會加大飲食誘導的NASH病理，包括肝臟損傷、纖維化和細胞死亡（特別是凋亡）的增加［16］；AMPK還被認為可以調(diào)控脂肪組織炎癥和NASH中的巨噬細胞極化，巨噬細胞中AMPK激活和脂肪酸氧化的增加可能為NASH治療提供新的途徑［17］；肝臟特異性AMPK敲除能夠加重小鼠NASH模型中的肝損傷，AMPK磷酸化促凋亡caspase-6蛋白以抑制其活化，從而控制肝細胞凋亡。AMPK活性的抑制緩解了這種抑制作用，使caspase-6在人和小鼠NASH中被激活。AMPK激活或caspase-6抑制，即使在NASH發(fā)作后，也能改善肝損傷和纖維化，預示著AMPK可能是NASH治療的靶點［18］。Wnt信號通路的失調(diào)與NASH的發(fā)生密切相關(guān)，針對Wnt信號通路的調(diào)節(jié)被作為對抗NASH的潛在手段［19-21］。

分子對接結(jié)果表明，川芎改善NASH的過程中，由川芎中多個有效成分和核心靶點共同作用發(fā)揮治療其中Myricanone、Sitosterol、wallichilide是起主要作用的成分，目前文獻報道的川芎提取方法，得到的川芎提取物其中主要的部分活性成分［8，22-23］。PPARA和PPARG可能是川芎作用最緊密的靶點，PPARA和PPARG共屬于PPAR信號通路，均是脂肪代謝和炎癥反應中發(fā)揮重要作用的靶點，此結(jié)果為川芎改善NASH后續(xù)研究提供了理論依據(jù)。雖然本研究發(fā)現(xiàn)的NASH有關(guān)的可能靶點及機制已有文獻先后報道，而更深的分子機制及完整通路需進一步驗證和證實。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法發(fā)現(xiàn)川芎可能主要通過谷甾醇、楊梅酮、亞油酸乙酯、川芎萘呋內(nèi)酯和阿魏酸5種化合物作用于EGFR、PPARG、PPARA、ESR1、MAPK14等39個核心靶點，調(diào)節(jié)PPAR、AMPK等信號通路發(fā)揮對NASH的治療作用，并通過動物模型進行驗證，為川芎改善NASH后續(xù)研究提供了理論依據(jù)及初步驗證。雖然網(wǎng)絡(luò)藥理學研究手段日趨成熟，數(shù)據(jù)庫信息逐漸完善，但仍需進一步的分子機制研究進行驗證，為川芎改善NASH提供現(xiàn)實參考。本研究表明，川芎可以改善高脂飲食所致的小鼠非酒精性脂肪性肝炎，具有一定臨床應用可能，值得進一步研究。

作者貢獻聲明

王玉平：文章構(gòu)思、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；龔瑾：分析數(shù)據(jù)，修改論文建議；李沙沙：部分作圖分析；章正：部分作圖分析；楊倩之：部分作圖分析；單璐琛：提出研究思路和框架，修改論文。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。