聚多巴胺溫敏水凝膠敷料的制備及其抗菌性能研究

賴彩云，潘煒倫，李博，王文，2*，鄭磊*

（1.南方醫(yī)科大學(xué) 南方醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510515；2.倫敦瑪麗女王大學(xué) 工程學(xué)院，倫敦E1 4NS）

傷口細(xì)菌感染是臨床常見(jiàn)的疾病，其主要治療手段是抗生素治療。近年來(lái)，由于抗生素濫用而導(dǎo)致的嚴(yán)重細(xì)菌耐藥，已經(jīng)成為威脅全球人類健康的重大醫(yī)療問(wèn)題［1-5］。目前，光熱療法已發(fā)展成為一種新型抗菌策略，其通過(guò)局部升溫破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)，具有細(xì)菌普適性和高特異性［6-8］的優(yōu)勢(shì)。其中，聚多巴胺（Polydopamine，PDA）、納米金、碳材料等是光熱治療中常用的光敏劑，但這些材料僅能清除細(xì)菌感染，往往無(wú)法提供良好的傷口愈合環(huán)境［9］。因此，構(gòu)建能夠清除細(xì)菌感染同時(shí)促進(jìn)傷口愈合的一體化材料具有重要的臨床價(jià)值。

水凝膠是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的親水高分子聚合物，具備良好的生物相容性，能夠保持傷口濕潤(rùn)、阻隔外界細(xì)菌，為感染性傷口提供更好的愈合環(huán)境，在傷口感染中具有較大的臨床轉(zhuǎn)化前景［10］。溫度敏感水凝膠是可以隨溫度改變發(fā)生溶膠-凝膠相轉(zhuǎn)變的高分子生物材料，在溫度臨界點(diǎn)下保持液體狀態(tài)，溫度超過(guò)臨界點(diǎn)則會(huì)轉(zhuǎn)變成凝膠［11］。由于這一特性與光熱治療策略十分契合，目前已有研究利用具有光熱效果的溫敏水凝膠用于感染性傷口的治療和護(hù)理，取得了較好的效果［12-14］。然而，通過(guò)傳統(tǒng)的交聯(lián)法制備光熱溫敏水凝膠需要復(fù)雜的修飾過(guò)程，且難以控制水凝膠的光熱效率，不利于應(yīng)用轉(zhuǎn)化。所以亟需建立一種簡(jiǎn)單可行的光熱溫敏水凝膠制備新策略［15］。

本研究擬制備聚多巴胺納米顆粒（PDA-NPs）作為光敏劑，通過(guò)物理?yè)饺氲姆绞脚c溫敏水凝膠（PLGA-PEG-PLGA，PPP）共孵育，構(gòu)建聚多巴胺溫敏水凝膠敷料（PDA＠PPP），并研究其抗菌性能及用于感染性傷口治療的潛力。本研究為光熱溫敏水凝膠的制備提供了一種全新思路，推動(dòng)了治療與修復(fù)一體化感染性傷口敷料的研究與轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鹽酸多巴胺、氨水、乙醇購(gòu)自上海麥克林生物科技有限公司；溫敏水凝膠購(gòu)自廣州市碳水科技有限公司；LB瓊脂購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；LB肉湯購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、96孔板、培養(yǎng)皿、胎牛血清、胰酶、青霉素-鏈霉素、細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒（CCK8）購(gòu)自廣州學(xué)友生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 PDA-NPs的合成和PDA＠PPP的制備

PDA-NPs通過(guò)氧化和自聚合兩步法合成［16］：將2 mL氨水、80 mL乙醇和180 mL去離子水?dāng)嚢杌靹?0 min，再加入20 mL的5%的鹽酸多巴胺溶液，避光攪拌32 h。通過(guò)高速離心（13 000 r／min，10 min）收集PDA-NPs，放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

PDA＠PPP的制備：配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17%的PPP溫敏水凝膠溶液，加入質(zhì)量濃度為100μg／mL的PDA-NPs，室溫?cái)嚢?0 min，放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PDA＠PPP的相變檢測(cè)

PDA＠PPP的溶膠-凝膠相變通過(guò)小瓶倒置法測(cè)定［17］。取1 mL PDA＠PPP至小瓶中，施加近紅外激光照射（808 nm，0.55 W／cm2，4 min）或不作處理，倒置小瓶觀察水凝膠的流動(dòng)狀態(tài)。

1.2.3 PDA＠PPP的光熱性能檢測(cè)

將PDA＠PPP放置在EP管中，施加不同強(qiáng)度的激光照射4 min，每隔20 s記錄凝膠溫度變化，得到溫度-光照時(shí)間、溫度-光照強(qiáng)度曲線圖。

1.2.4 PDA＠PPP的抗菌能力評(píng)價(jià)

選擇革蘭氏陽(yáng)性菌（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、銅綠假單胞菌）作為目標(biāo)細(xì)菌。將3種細(xì)菌落接種于LB肉湯中培養(yǎng)24 h，取濃度約為1.5×108CFU／mL的菌液于96孔板中，加入100μg／mL PDA＠PPP并采取激光照射（808 nm，0.55 W／cm2，4 min）處理，通過(guò)涂布平板法和熒光染色鑒定細(xì)菌活性。

1.2.5 PDA＠PPP的菌膜清除能力評(píng)價(jià)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）、大腸桿菌（E.coli）各取濃度為1.5×108CFU／mL的菌液100μL加入96孔板中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)36 h，棄去上清，得到菌膜。加入100μg／mL PDA＠PPP并采取激光照射（808 nm，0.55 W／cm2，4 min）處理，通過(guò)結(jié)晶紫試劑染色30 min后觀察菌膜。

1.2.6 PDA＠PPP的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

將成纖維細(xì)胞L929按照每孔約3 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，加入不同質(zhì)量濃度的PDA＠PPP共孵育24 h，并用CCK8試劑盒測(cè)量細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果

2.1 PDA-NPs的制備與表征

PDA-NPs通過(guò)氧化和自聚合兩步法合成（圖1A）。從透射電鏡結(jié)果可見(jiàn)（圖1B），PDA-NPs分散性好、形貌均一，粒徑約為500 nm。而且PDANPs在室溫環(huán)境中放置30 d后，其形態(tài)結(jié)構(gòu)與粒徑保持不變（圖1C），證明其穩(wěn)定性強(qiáng)。此外，光熱治療效率與光敏劑的紫外吸收強(qiáng)度密切相關(guān)。PDA-NPs在近紅外區(qū)有較強(qiáng)的吸收強(qiáng)度，是構(gòu)建光熱溫敏水凝膠的理想光敏劑（圖1D）。

圖1 PDA-NPs的表征Figure 1 Characterization of PDA-NPs

2.2 PDA＠PPP的制備和表征

PPP水凝膠在室溫條件下是透明清亮可流動(dòng)的溶液，加入PDA-NPs后得到外觀為黑色的PDA＠PPP溶液（圖2A）。PDA＠PPP溫敏水凝膠在受到激光照射后，溫度升高超過(guò)其相變溫度（＞37℃），從液態(tài)轉(zhuǎn)化為固態(tài)。該溫度變化是由于PDA-NPs自身的光熱轉(zhuǎn)換效果，而相變則是PPP水凝膠的特性。因此，根據(jù)PDA＠PPP的外觀變化及其激光響應(yīng)的相變特征，可證明PDANPs成功負(fù)載在PLGA-PEG-PLGA水凝膠上。

在激光照射下，PDA＠PPP的溫度逐步提升，在4 min內(nèi)達(dá)到53℃，并且其形態(tài)從液態(tài)轉(zhuǎn)變成凝膠態(tài)。與PDA-NPs溶液相比，PDA＠PPP升溫速度更快，光熱轉(zhuǎn)化效率更高（圖2B，C）。這可能是因?yàn)楫?dāng)凝膠的溫度超過(guò)其相變溫度時(shí)，形態(tài)從液態(tài)轉(zhuǎn)變成凝膠態(tài)，從而限制了PDA-NPs的運(yùn)動(dòng)，減少了能量逸散［18］。此外，PDA＠PPP隨著激光強(qiáng)度的變化呈現(xiàn)出不同的升溫曲線，使其可對(duì)不同感染程度的部位實(shí)施精準(zhǔn)控溫的光熱治療（圖2D）。而且，PDA＠PPP的光熱重復(fù)性強(qiáng)，在反復(fù)激發(fā)的條件下仍能保持高強(qiáng)度的光熱效果（圖2E）。因此，PDA＠PPP具有優(yōu)越的光熱轉(zhuǎn)換能力。

圖2 PDA＠PPP的表征Figure 2 Characterization of PDA＠PPPhydrogel

2.3 PDA＠PPP的抗菌活性評(píng)價(jià)

如圖3A所示，經(jīng)過(guò)PDA＠PPP處理后，3種細(xì)菌的數(shù)量明顯減少，表現(xiàn)出較好的抗菌效果。而且，由于PDA＠PPP的光熱效果更強(qiáng)，其抗菌能力也比PDA-NPs好。此外，細(xì)菌菌膜是細(xì)菌附著于機(jī)體黏膜或醫(yī)學(xué)材料表面形成的復(fù)合體，包含其分泌的多糖藻酸鹽為主的多糖-蛋白復(fù)合物，具有高致病性、難治愈、多重耐藥的特性，清除菌膜的方法研究是當(dāng)今的熱點(diǎn)［19］。如圖3B所示，PDA＠PPP能夠高效地清除耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌的菌膜結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果驗(yàn)證了PDA＠PPP在近紅外光照射下，能夠迅速升溫到45℃以上，具有優(yōu)異的抗菌性能，能夠滿足不同類型感染傷口的護(hù)理需求［20］。

圖3 PDA＠PPP的抗菌性能表征Figure 3 The antibacterial properties of PDA＠PPP

2.4 PDA＠PPP的生物相容性

如圖4所示，將PDA-NPs和PDA＠PPP與小鼠成纖維細(xì)胞L929孵育，測(cè)量其生物相容性。結(jié)果表明，隨著PDA-NPs和PDA＠PPP濃度增大，L929細(xì)胞存活率沒(méi)有明顯下降，細(xì)胞活性仍維持在95%以上，而且PDA＠PPP組的細(xì)胞活性更高。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PDA＠PPP具有優(yōu)異的生物相容性，有望作為感染傷口的抗菌敷料。

圖4 PDA＠PPP的細(xì)胞生物相容性Figure 4 Cell biocompatibility of PDA＠PPP hydrogel

3 結(jié)論

本研究通過(guò)簡(jiǎn)便快捷的方式構(gòu)建了一種PDA＠PPP敷料，該敷料具有溫度敏感的相變特征，在室溫下是液態(tài)，能夠很好地契合傷口形狀；在施加光照后迅速升溫，殺死感染性病原菌的同時(shí)從液態(tài)轉(zhuǎn)變成凝膠態(tài)，阻擋外源細(xì)菌二次感染傷口。所制備的PDA＠PPP具有高效、可重復(fù)激發(fā)的光熱特性，對(duì)大腸桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌及其菌膜均有較好的殺滅和清除能力。此外，該敷料的生物相容性好，可用于體內(nèi)外的抗菌應(yīng)用，改善傷口愈合環(huán)境。本研究為開(kāi)發(fā)光熱抗菌的溫敏水凝膠提供了一種方便可行的新策略，并促進(jìn)新型傷口敷料的研究和轉(zhuǎn)化。

作者貢獻(xiàn)聲明

賴彩云：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)試劑、整理數(shù)據(jù)并繪制圖譜、撰寫(xiě)論文初稿；潘煒倫：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程的核實(shí)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)評(píng)估、初稿的審閱修改；李博：構(gòu)思實(shí)驗(yàn)思路、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)過(guò)程探究、終稿的確認(rèn)；王文：實(shí)驗(yàn)流程監(jiān)督和領(lǐng)導(dǎo)、管理和協(xié)調(diào)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的運(yùn)行；鄭磊：實(shí)驗(yàn)課題的資金支持和平臺(tái)建設(shè)、提供實(shí)驗(yàn)過(guò)程難題的指導(dǎo)。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。