浙江省桑園土壤病原菌及其微生態(tài)調查

金杏麗，何金濤，蔡永良，李坤峰，陳樂陽，魯興萌，邵勇奇*

（1.德清縣農業(yè)技術推廣中心，浙江 湖州 313200；2.浙江大學動物科學學院蠶蜂研究所，杭州 310058；3.德清縣莫干天竺蠶種有限

責任公司，浙江 湖州 313204；4.浙江大學農業(yè)試驗站，杭州 310058；5.金華市農業(yè)農村局，浙江 金華 321017）

桑椹菌核病是果桑生產中的重要病害，已發(fā)現的菌核病病原均為真菌，包括桑實杯盤菌（Ciboria shiraiana）[1-4]、肉阜狀杯盤菌（Ciboria carunculoides）[5-6]、桑椹核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）[7-8]和核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）[9]等。已有大量的研究表明，地理區(qū)域[9]、氣候條件[2]、桑樹品種[10-11]、栽培和管理模式[12-13]等因素對桑椹菌核病的發(fā)生都有影響?？梢?，桑椹菌核病的發(fā)生和流行是一個復雜的系統(tǒng)過程。目前，植物病害發(fā)生與土壤微生態(tài)（細菌和真菌）的關系以及通過改善土壤微生態(tài)來減少植物病害發(fā)生并提高農產品品質正被學者所關注[14-15]，但是迄今鮮有桑椹生產桑園土壤病原菌及其微生態(tài)調查的報道。

浙江省湖州市德清縣于2009 年開始較大規(guī)模地種植果桑，至2016年果桑面積達到32 hm2。2017年，因春季低溫陰雨以及桑園用藥和防控措施單一等因素而引發(fā)大規(guī)模病害，部分桑園顆粒無收。本實驗以浙江栽培果桑相對較多的地域（德清、長興、金華）的桑園為研究對象（其中長興為大棚栽培，其他為露地栽培），同時，以四川地域的桑園（極少或未發(fā)生桑椹菌核?。┳鳛閰⒄眨_展了桑園土壤微生態(tài)的相關調查，試圖通過對土壤樣本中真菌和細菌微生態(tài)的描述及定性研究，為基于土壤的桑椹菌核病的防控技術研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

取樣調查桑椹生產桑園，包括采用常規(guī)露地栽培方式的浙江省湖州市德清縣（DQ）和金華市多湖街道（JD）、江東鎮(zhèn)（JJ）地域的3 個桑園，以及浙江大學農業(yè)科學試驗站長興分站的采用“地布覆蓋-塑料大棚-根域限制-棚架”栽培方式的桑園（長興，CX），并以歷年極少或未發(fā)生桑椹菌核病的四川1 個地域的桑園為對照（CK）。除因地域不同而產生的土壤、氣候和栽培管理方式等差異外，四川桑園的栽培品種為‘嘉陵30’，浙江桑園均為‘大10’。

1.1 果桑栽培方式和桑椹生產基本情況

采集樣本的桑園的果桑栽培時間分別為德清2009 年、金華1999 年、長興2014 年、四川2006 年。德清（DQ）和金華（JD、JJ）桑園為中低干栽培，株行距均為0.8 m，栽植密度為330～400 株/667 m2。當年果實收獲后及時修剪，留6～7 根結果枝，于秋冬季對超過1.5 m 的枝條剪梢，并在冬季用45%晶體石硫合劑50～80倍液封園。根據歷年開花期記載和本年度的果桑生長情況，于春季用藥，每隔7 d以70%甲基硫菌靈700～800 倍稀釋液和42.8%氟菌·肟菌酯1 500倍稀釋液交替使用，連續(xù)用藥3次。長興（CX）桑園采用棚架立體栽培[16]，株行距均為4.0 m，栽植密度為40 株/667 m2。冬季修剪以疏剪和短截相結合，隨著主枝的延伸和側枝的配置，形成4主枝和多側枝的樹形，剪去枝條頂端的枯梢、病蟲枝及長度為20～30 cm的細小倒側枝。病蟲害防治從覆膜時開始，用45%晶體石硫合劑80～100 倍液噴灑地面清園1 次，在花蕾初現時用70%甲基托布津可濕性粉劑1 000倍液或50%多菌靈粉劑800倍液交替噴霧，每次間隔7～10 d，一般防治4次左右。四川（CK）桑園采用喬化砧木，株行距均為1.0 m，栽植密度為350株/667 m2。冬季修剪時將夏季萌發(fā)的弱小枝、病蟲枝等全部從基部剪除，并將保留的結果母枝適當截短，一般剪去枝梢頂端15～20 cm 生長不充實、不飽滿的部分。桑椹菌核病的防治分始花期、盛花期、末花期3 次進行，每隔7～10 d 用70%甲基托布津可濕性粉劑1 000 倍液或50%多菌靈粉劑1 000倍液噴灑防治1次。

2019 年度各取樣地域桑園的桑椹菌核病調查結果為：德清（DQ）桑園可見少量菌果；金華多湖（JD）及江東（JJ）桑園菌果較多，感官不佳，但對產量的影響不大；長興（CX）和四川（CK）桑園未見菌果。

1.2 土壤樣本來源和采樣時間

在桑園邊界的2 行（或2 株）內，用梅花法選擇5株桑樹，在距桑樹根部約20 cm、地表約5 cm處采集5個土樣，土壤量約50 g，分別置于含干冰的密封袋中，24～48 h 內送至浙江大學家蠶病理學與病害控制實驗室。實驗室收到樣本后，即刻于－80 ℃低溫條件下保存，備用。

土壤采樣時間為最后一次用藥后1周左右。德清（DQ）的具體采樣時間為2019年4月2日，金華多湖（JD）和江東（JJ）均為2019 年3 月27 日，長興（CX）為2019 年3 月24 日，四川（CK）為2019 年4月3日。

1.3 土壤樣本的DNA 提取及16S rRNA 和內轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS）基因的高通量測序

分別稱取低溫保存的土壤樣品250 mg，裝入破碎管，利用Precellys?24 組織研磨儀（法國Bertin公司）以5 500 r/min研磨45 s。利用DNeasy?PowerSoil試劑盒（德國Qiagen公司）提取各土壤樣品的DNA。經NanoDrop 2000 紫外-可見分光光度計對樣品的DNA 濃度進行測定，并經1%瓊脂糖凝膠電泳確定DNA 提取質量后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行MiSeq 高通量測序，共計25 個測序樣品（5個地域，每個地域5個土樣）。靶基因的擴增引物及序列[17-18]為：細菌（16S rRNA-V4 區(qū)域），515FGTGCCAGCMGCCGCGGTAA和806R-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT；真菌，ITS1-CTTGGTCATTTA GAGGAAGTAA和ITS2-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC。

1.4 土壤樣本主要理化指標測定

將土壤樣本送至有檢測資質的公司（浙江國正檢測技術有限公司）進行主要理化指標分析。其中：全氮（total nitrogen,TN）參照LY/T 1228—2015進行測定；全磷（total phosphorus, TP）參照LY/T 1232—2015 進行測定；全鉀（total potassium,TK）參照LY/T 1234—2015 進行測定；有機質（organic matter, OM）參照NY/T 1121.6—2006 進行測定；pH參照NY/T 1121.2—2006進行測定。

1.5 數據分析

16S rRNA 和ITS 基因的高通量測序數據分析參考本實驗室前期的研究[19-20]，使用Trimmomatic v0.33 軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH v1.2.11 軟件進行拼接：1）過濾測序序列（reads）尾部質量值低于20 的堿基，設置50 bp 的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，則從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的測序序列，去除含N 堿基的測序序列；2）根據雙端測序（pairedend, PE）序列之間重疊部分（overlap）的關系，將成對測序序列拼接成1 條序列，最小重疊部分長度為10 bp；3）拼接序列的重疊部分允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；4）根據序列首尾兩端的條形碼（barcode）和引物區(qū)分樣品，調整序列方向，其中，條形碼允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。

使用UPARSE v7.1 在線軟件（http://drive5.com/uparse/），根據97%的相似度對序列進行可操作分類單元（operational taxonomic unit, OTU）聚類并剔除嵌合體。利用RDP分類器（classifier）v2.10.2（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，在Silva v128（16S rRNA）和Unite v7.0（ITS）數據庫中進行比對，設定比對閾值為70%，獲得OTU表。實驗數據的統(tǒng)計分析使用R v3.6.3軟件。

2 結果與分析

2.1 土壤樣本真菌和細菌多樣性分析

觀察從不同地域5個桑園中采集的土壤樣本的真菌和細菌多樣性發(fā)現，真菌和細菌相對豐度（relative abundance,RA）＞1.0%（優(yōu)勢菌）的OTU數目分別為7.0～12.6 和21.0～24.6，0.1%≤RA≤1.0%（稀有菌）的OTU 數目分別為18.8～40.8 和104.6～134.4，可鑒定OTU 的總數分別為70.6～141.4 和441.8～558.6（表1）。從可鑒定的優(yōu)勢菌的分布及其微生態(tài)結構看，細菌的多樣性大于真菌。但從各樣本的可鑒定序列占總測定序列的比例看，真菌類微生物為92.79%～95.81%，細菌類微生物為53.97%～64.46%，由此可進一步判斷桑園土壤中細菌類微生物的多樣性較真菌類更為豐富，且在屬、科、目、綱和門的分類學鑒定中，不能明確的細菌（其他）更多（圖1～2）。

表1 不同桑園土壤樣本中可鑒定的真菌和細菌種類（OTU數目）Table 1 OTU numbers of identified fungi and bacteria in the soil samples from different mulberry fields

圖1 不同桑園土壤樣本的真菌微生態(tài)結構（RA）Fig.1 Fungal microecological structures of the soil samples from different mulberry fields(RA)

圖2 不同桑園土壤樣本的細菌微生態(tài)結構（RA）Fig.2 Bacterial microecological structures of the soil samples from different mulberry fields(RA)

在真菌的可鑒定序列中，不同桑園土壤中優(yōu)勢真菌（RA＞1.0%）的OTU 數目以四川（CK）樣本組最高，極顯著高于長興（CX）、多湖（JD）和江東（JJ）樣本組（圖3A）；對于稀有真菌（0.1%≤RA≤1.0%）的OTU數目，四川（CK）樣本組極顯著高于其他4個樣本組（圖3B）；在可鑒定的OTU總數上，四川（CK）樣本組也極顯著高于其他4個樣本組（圖3C）。

圖3 不同桑園土壤樣本中的真菌在不同RA范圍可鑒定的OTU數目比較Fig.3 Comparisons of identified OUT numbers at different RA ranges of fungi in the soil samples from different mulberry fields

在細菌的可鑒定序列中，不同桑園土壤中優(yōu)勢細菌（RA＞1.0%）的OTU數目未見顯著性差異（圖4A）；稀有細菌（0.1%≤RA≤1.0%）的OTU 數目以多湖（JD）樣本組最高，分別極顯著和顯著高于德清（DQ）和江東（JJ）樣本組，其他樣本組間未見顯著性差異（圖4B）；在可鑒定的OTU總數上，多湖（JD）樣本組最高，極顯著高于德清（DQ）樣本組，其他樣本組間未見顯著性差異（圖4C）。

2.2 菌核病病原真菌及其他真菌的微生態(tài)結構分析

對比不同桑園土壤中杯盤菌屬（Ciboria）真菌的RA（圖5）發(fā)現：多湖（JD）和江東（JJ）樣本組的RA 都極顯著高于德清（DQ）、長興（CX）和四川（CK）樣本組；德清（DQ）樣本組的RA 極顯著高于四川（CK）和長興（CX）樣本組；江東（JJ）和多湖（JD）以及長興（CX）和四川（CK）樣本組的RA 未見顯著性差異。

在桑椹菌核病低發(fā)生地域的四川（CK）樣本組中，主要為青霉屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusarium）和Fusicolla真菌，其RA 分別為24.05%、15.35%、9.75%。青霉屬（Penicillium）在德清（DQ）樣本組中有一定豐度（RA 為3.07%），但在其余樣本組中的RA都很低，均極顯著低于四川（CK）樣本組（圖6A）；鐮刀菌屬（Fusarium）在德清（DQ）樣本組中的RA 也較高（11.70%），與四川（CK）樣本組無顯著差異，且均極顯著高于長興（CX）、江東（JJ）和多湖（JD）樣本組（圖6B）；Fusicolla在長興（CX）和多湖（JD）樣本組中未檢出，在德清（DQ）和江東（JJ）樣本組中的RA也極低。

圖6 不同桑園土壤樣本中青霉屬（Penicillium）（A）和鐮刀菌屬（Fusarium）（B）真菌的RAFig.6 RA of Penicillium(A)and Fusarium(B)fungi in the soil samples from different mulberry fields

在桑椹菌核病低發(fā)生地域長興（CX）樣本組中，主要為被孢霉菌屬（Mortierella）、毛殼菌屬（Chaetomium）和腐質霉屬（Humicola）真菌，其RA分別為36.46%、21.59%、15.93%，與同為桑椹菌核病低發(fā)生地域的四川（CK）以及德清（DQ）、江東（JJ）和多湖（JD）樣本組有較大不同，長興（CX）樣本組中這3 個菌屬的RA 均極顯著高于其他樣本組（圖7）。

圖7 不同桑園土壤樣本中被孢霉菌屬（Mortierella）（A）、毛殼菌屬（Chaetomium）（B）和腐質霉屬（Humicola）（C）真菌的RAFig.7 RA of Mortierella(A),Chaetomium(B),and Humicola(C)fungi in the soil samples from different mulberry fields

此外，在長興（CX）樣本組中，Pseudaleuria的RA較高（11.94%），極顯著高于其他樣本組（圖8A）；在德清（DQ）樣本組中，木霉屬（Trichoderma）的RA較高（3.97%），且其在5 個樣本組內的差異較大（0.27%～53.30%）（圖8B）；在四川（CK）樣本組中，隱球菌屬（Cryptococcus）的RA 較高（3.97%），顯著高于長興（CX）樣本組，極顯著高于德清（DQ）及多湖（JD）樣本組，與江東（JJ）樣本組未見顯著性差異（圖8C）。

圖8 不同桑園土壤樣本中Pseudaleuria（A）、木霉屬（Trichoderma）（B）和隱球菌屬（Cryptococcus）（C）真菌的RAFig.8 RA of Pseudaleuria(A),Trichoderma(B),and Cryptococcus(C)fungi in the soil samples from different mulberry fields

2.3 細菌的微生態(tài)結構分析

假單胞菌屬（Pseudomonas）是唯一在5 個樣本組中均有可鑒定序列的細菌：在長興（CX）和多湖（JD）樣本組中其RA 較低，其中，長興（CX）樣本組極顯著低于江東（JJ）、德清（DQ）和四川（CK）樣本組，多湖（JD）樣本組顯著低于江東（JJ）樣本組；江東（JJ）樣本組的RA 最高（6.81%），德清（DQ）和四川（CK）樣本組的RA 也較高，但兩者組內差異較大（圖9A）。藍細菌門（Cyanobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和SC-I-84 目未確定的芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）的可鑒定序列在長興（CX）樣本組中的RA 很低，其平均值分別為0.06%、0.10%、0.09%，在其他樣本組中的平均值為1.10%～7.41%（圖9，部分數據未列出）。藍細菌門（Cyanobacteria）可鑒定序列在多湖（JD）樣本組中的RA 具有較高的平均值（4.81%），分別顯著和極顯著高于江東（JJ）和長興（CX）樣本組；其在多湖（JD）和四川（CK）樣本組內差異較大，分別為0.11%～9.83%和0.05%～9.81%（圖9B）。酸桿菌門（Acidobacteria）可鑒定序列的RA 在德清（DQ）和江東（JJ）樣本組中較高，分別為7.41%和7.54%，且兩者間無顯著差異，但德清（DQ）和江東（JJ）樣本組分別極顯著和顯著高于四川（CK）和多湖（JD）樣本組，長興（CX）樣本組則極顯著低于德清（DQ）、江東（JJ）和多湖（JD）樣 本組（圖9C）。

圖9 不同桑園土壤樣本中假單胞菌屬（Pseudomonas）（A）、藍細菌門（Cyanobacteria）（B）和酸桿菌門（Acidobacteria）（C）可鑒定序列細菌的RA比較Fig.9 Comparisons of RA of identified sequences of Pseudomonas (A), Cyanobacteria (B), and Acidobacteria (C) bacteria in the soil samples from different mulberry fields

鏈霉菌屬（Streptomyces）、黃質菌屬（Flavobacte‐rium）、克雷伯菌屬-P（Klebsiella-Paraburkholderia）、熱酸菌屬（Acidothermus）、硝化螺菌屬（Nitrospira）和H16是在5 個地域的樣本組中較為高頻出現的細菌，但它們在不同樣本組之間存在較大的差異（圖10）。

圖10 不同桑園土壤樣本中6個高頻出現的細菌屬的RA比較Fig.10 Comparisons of RA of the six high frequency bacterium genera in the soil samples from different mulberry fields

2.4 土壤樣本主要理化指標分析

對浙江桑園土壤樣本的主要理化指標（有機質、全氮、全磷、全鉀含量和pH）分析發(fā)現，不同采樣地域的土壤pH 差異不顯著（pH 7～8），并且同一地域發(fā)病與不發(fā)病土壤間主要理化指標的差異也不大。進一步分析發(fā)現，長興（CX）桑園土壤有機質（155.7 g/kg）、全氮（9.6 g/kg）、全磷（6.3 g/kg）含量高于其他地域（有機質9.6～50.0 g/kg、全氮0.5～3.1 g/kg、全磷0.6～0.9 g/kg），但其全鉀含量偏低（13.5 g/kg），而其他地域為18.7～34.2 g/kg。

3 討論與結論

土壤是微生物的大本營，土壤真菌和細菌的多樣性是其微生態(tài)的基本特征。作物栽培（種類、耕作和培肥管理等）和土壤微生態(tài)間存在著復雜的相互作用關系，其作用結果對作物的生物產量和病害發(fā)生有著不同的影響[14-15,21-22]。本研究以歷年極少或未發(fā)生桑椹菌核?。ㄋ拇ǎ┖桶l(fā)生桑椹菌核?。ㄕ憬┑纳@土壤樣本為對象，發(fā)現浙江4 個地域（德清、長興、金華多湖及江東）和四川對照地域桑園土壤樣本的真菌和細菌都具有豐富的多樣性，但其在微生態(tài)結構上存在明顯的不同。

菌核病病原杯盤菌屬（Ciboria）真菌在多湖、江東和德清露地栽培樣本組中為主要菌群（RA分別為70.15%、60.17%、28.84%），在長興大棚栽培和四川對照樣本組中的RA很低（分別為0.02%和0.06?），與桑園桑椹菌核病的實際發(fā)生情況吻合，即證實桑椹菌核病發(fā)生與桑園土壤杯盤菌屬（Ciboria）病原菌的存在和數量有關。四川桑園不僅果桑品種與其他4個桑園不同（四川為‘嘉陵30’，浙江為‘大10’），在地理上也相距較遠，氣候和土壤條件等存在較大差異，該地域未見桑椹菌核病病果可能與其獨特的地理、氣候、土壤條件以及人為防控措施有關。浙江長興地域也未見桑椹菌核病病果，可能與其采用地布覆蓋和大棚栽培方式有關。地布覆蓋具有良好的土壤隔離作用，且有利于消毒；大棚則有利于隔離大范圍存在或漂移的子囊孢子。此外，在長興地域采用根域限制栽培時對土壤進行了嚴格配比，其土壤有機質、全氮、全磷含量高于其他地域，這些土壤的主要理化特性與其微生態(tài)的關系值得深入研究。隋躍宇等[23]研究了有機質含量不同的農田黑土與土壤微生物量、碳、氮及土壤酶活性的關系，發(fā)現土壤微生物量、碳、氮隨土壤有機質含量的增加而增加。何金祥等[24]對煙草栽培地研究表明，土壤速效磷含量和pH 對植株發(fā)病率的影響較大，而其他土壤化學性狀（如鉀、水分含量等）與植株發(fā)病率的相關性不顯著。桑椹菌核病發(fā)現地域中真菌多樣性的下降，以及四川和浙江長興地域中主要菌群[如被孢霉菌屬（Mortierella）、毛殼菌屬（Chaetomium）、腐 質 霉 屬（Humicola）、青 霉 屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusarium）和Fusicolla]的功能也是值得關注的問題。比如，土壤微生物多樣性的變化可能會影響植物土傳病害。有研究表明，土壤微生物多樣性與植物健康呈正相關[25]：健康煙草土壤與枯萎病株土壤相比，前者具有更高的細菌多樣性；健康三七根際土壤中細菌和真菌的多樣性指數亦高于根腐病株根際土壤。健康植物根際土壤優(yōu)勢菌屬有助于對土傳病害的抑制[25]。

在本研究中，不論是屬水平的可鑒定的OTU數目還是可鑒定序列的RA 都顯示了細菌豐富的多樣性，雖未見明顯優(yōu)勢菌群，但假單胞菌屬（Pseudomonas）在不同地域的5 個桑園中均被檢出；鏈霉菌屬（Streptomyces）、黃質菌屬（Flavobacterium）和克雷伯菌屬-P（Klebsiella-Paraburkholderia）等雖有較高的出現頻率，但其RA都較低。本研究結果為后續(xù)進一步尋找不同地域、不同栽培條件下相同品種、相同樹齡以及發(fā)病程度相似的試驗材料進行定量研究提供了良好的視角和基礎。

桑椹菌核病的發(fā)生主要由病原真菌感染引起。已發(fā)現的可引起桑椹菌核病的真菌有杯盤菌屬（Ciboria）和核地杖菌屬（Scleromitrula），它們的子囊孢子黏附在?；ㄖ^后感染桑椹，導致桑椹變成灰白色并膨大或縮小，甚至落果。病原真菌的主要來源可能是病果跌落后在土壤中越冬，并在來年春季其菌核生長，子囊盤鉆出土表，發(fā)育成熟后從子囊頂端噴出子囊孢子并隨風飄散，到達?；ㄖ^發(fā)生感染[1-3]。因此，為防止桑椹菌核病的發(fā)生，主要在果桑開花期進行數次化學藥物噴施，或者進行果桑品種選育、調整果桑開花期，以及嘗試其他農業(yè)防治措施等[26-28]。桑椹菌核病的病原被認為主要來源于土壤，利用土壤微生態(tài)結構提高作物產量和防止病害發(fā)生，以及利用微生態(tài)制劑改變土壤微生態(tài)的研究和應用已有嘗試[29-30]。雖然ITS和16S rRNA基因的高通量測序局限于屬水平的鑒定，對杯盤菌屬（Ciboria）具體種的地位未能確定，但不同桑園土壤的微生態(tài)結構和主要菌群特征暗示了諸多進一步解析病害發(fā)生機制的途徑，以及利用或研發(fā)病原菌微生態(tài)防控技術的可能性。本研究對不同地域桑園土壤病原菌及其微生態(tài)的調查為桑椹菌核病的綠色防控提供了新思路。