聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶1功能與其抑制劑的作用及耐藥機(jī)制

劉 雨， 周 筱， 王嘉東

(北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)系， 北京 100191)

聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase-1，PARP1)是PARP(poly ADP-ribose polymerase)超家族中研究最廣泛的核酶，其功能眾多，且與DNA損傷修復(fù)過(guò)程密切相關(guān)。近年來(lái)，以?shī)W拉帕尼(Olaparib)為首的PARP抑制劑被廣泛應(yīng)用于家族性乳腺癌和卵巢癌的維持治療中。多項(xiàng)研究證實(shí)，PARPi能顯著提高患者的無(wú)進(jìn)展生存期[1]。然而，有部分乳腺癌基因1/2(breast cancer gene 1/2，BRCA1/2)突變型腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)PARPi的抗性，成為目前PARPi在臨床應(yīng)用上的一大問(wèn)題。這提示我們對(duì)PARP1生理功能及調(diào)控因素的認(rèn)識(shí)尚不充足。因此，闡明PARP1參與DNA損傷修復(fù)的具體過(guò)程，并從中得出腫瘤細(xì)胞對(duì)PARPi耐藥性的合理解釋，具有重大醫(yī)學(xué)和社會(huì)意義。本文首先對(duì)PARP1的功能做一總體回顧，而后圍繞PARP1在DNA損傷修復(fù)方面的作用，闡述PARP抑制劑的抗腫瘤機(jī)制及耐藥機(jī)制。

1 聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶1的結(jié)構(gòu)與功能

PARP1全長(zhǎng)1 014個(gè)氨基酸，分子量約113 kD，其結(jié)構(gòu)主要可分為N-端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain)、中部的自修飾結(jié)構(gòu)域(automodification domain)以及C-端的催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain)(Fig.1A)[2]。顧名思義，PARP1具有催化“PAR修飾(PARylation)”反應(yīng)的酶活性。所謂PAR修飾，是指以NAD+為供體，在底物上連接一串多聚ADP-核糖鏈(Fig.1B)[3]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)PARP1認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn)除經(jīng)典的PAR修飾外，PARP1也能進(jìn)行乙?；?、磷酸化、泛素化和類泛素化等多種翻譯后修飾，為PARP1功能的多樣性奠定了基礎(chǔ)[4]。

Fig.1 The main structural domain of PARP1 (A) and the catalytic process of PARP1 PARylation (B) PARP1 catalyze the reaction of nicotinamide removing from NAD+ to form ADP-ribose. Multiple ADP-ribose molecules are sequentially connected to PARP1 through glycosidic bonds and finally form PARylated PARP1

1.1 PARP1是DNA損傷修復(fù)的感受器

細(xì)胞中的DNA斷裂損傷主要可分為單鏈斷裂(single strand break，SSB)和雙鏈斷裂(double strand break，DSB)兩種。在細(xì)胞發(fā)生SSB或DSB后，PARP1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可識(shí)別并結(jié)合損傷位點(diǎn)，而后催化結(jié)構(gòu)域催化PAR修飾反應(yīng)。該反應(yīng)以其自身為底物，將PAR鏈連接在自身的BRCT結(jié)構(gòu)域上，而后促進(jìn)DNA損傷修復(fù)效應(yīng)蛋白質(zhì)募集并結(jié)合在PAR鏈上，啟動(dòng)修復(fù)過(guò)程[5]。PARP1脫落后，這些修復(fù)效應(yīng)蛋白質(zhì)在核小體PAR修飾因子1(histone PARylation factor 1，HPF1)幫助下，繼續(xù)錨定在損傷位點(diǎn)發(fā)揮功能[6]。因此，PARP1被形象地稱為“DNA損傷修復(fù)的感受器”，其中尤以SSB修復(fù)效應(yīng)分子的招募最為重要。

PARP1介導(dǎo)的SSB損傷修復(fù)可分為4個(gè)步驟(Fig.2A)，依次為：識(shí)別(lesion detection)、末端加工(end processing)、縫隙填補(bǔ)(gap filling)和連接(ligation)。修復(fù)過(guò)程中的重要分子已在圖中表示，包括提供修復(fù)反應(yīng)平臺(tái)的X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)蛋白1(X-ray repair cross complementing 1，XRCC1)[7]，切除不規(guī)則末端的多聚核苷酸激酶/磷酸酶(polynucleotide kinase /phosphatase，PNKP)[8]和脫嘌呤嘧啶核酸內(nèi)切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1)[9]，切除后端小段完整DNA單鏈的結(jié)構(gòu)特異性核酸酶1(flap structure-specific endonuclease 1，F(xiàn)EN1)[10]，以及相應(yīng)的DNA聚合酶和連接酶等[11]。

然而，DNA單鏈損傷并不會(huì)直接對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)致死效應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡的通常是DNA雙鏈斷裂。在細(xì)胞有絲分裂的S期，如果一條存在SSB位點(diǎn)的DNA鏈發(fā)生了復(fù)制，那么復(fù)制叉在進(jìn)行到損傷位點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生停滯，等待PARP1等一系列前文提及的蛋白質(zhì)對(duì)SSB位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)。此時(shí)，如果細(xì)胞未能完成SSB修復(fù)，復(fù)制叉將發(fā)生崩潰(collapse)，導(dǎo)致DSB的形成[12]。細(xì)胞修復(fù)DSB的途徑主要可分為同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)兩種。其中，同源重組的保真性強(qiáng)，是細(xì)胞修復(fù)DSB的最佳途徑。但由于HR過(guò)程需要與損傷鏈同源的雙鏈DNA作為模板，因此只出現(xiàn)在S/G2期[13]。HR修復(fù)也可分為4個(gè)步驟(Fig.2B)，分別為末端切除(end resection)、鏈侵入(strand invasion)、鏈延伸(DNA synthesis)和霍利迪連接體解離(dissolution of Holliday junction，dHJ)[14-17]。與SSB修復(fù)類似，在DSB中，PARP1也參與招募修復(fù)效應(yīng)分子。例如，BRCA1、BARD1和MRN復(fù)合體中的MRE11等，但不是這些分子發(fā)揮功能的必需條件[18]。

Fig.2 DNA single-strand and double-strand break repair pathways (A) After DNA single strand damage occurs, PARP1 takes the lead in locating and identifying the damage, recruiting following proteins to degrade the damage end and extend nascent DNA. (B) If the function of PARP1 is inhibited, the replication fork will collapse during the S/G2 phase, resulting in double-strand breaks and initiating the HR repair pathway. BRCA1/2 are key molecules in HR pathway. If they are mutant, cells can only choose the NHEJ pathway to repair double-strand damage, which is low fidelity, causing genomic instability and finally cell apoptosis

由此看出，細(xì)胞對(duì)DNA損傷有完備的應(yīng)對(duì)措施。在損傷初期，PARP1可識(shí)別啟動(dòng)SSB修復(fù)途徑；而即使SSB修復(fù)未能完成，也可在后續(xù)進(jìn)行DSB修復(fù)，使細(xì)胞能夠存活。這也是PARPi專一靶向BRCA突變腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞影響較小的生理基礎(chǔ)。

1.2 PARP1與多種蛋白質(zhì)相互作用維持基因組穩(wěn)定性

基因組穩(wěn)定性(genome stability)是指細(xì)胞面對(duì)復(fù)制錯(cuò)誤和DNA損傷時(shí)，能夠修復(fù)異常，保證遺傳物質(zhì)在世代傳遞過(guò)程中穩(wěn)定不變的能力[19]。維持基因組穩(wěn)定性，一方面需要細(xì)胞具有穩(wěn)定可靠的DNA損傷修復(fù)機(jī)制；另一方面，也需要細(xì)胞中多種機(jī)制共同發(fā)揮作用，為DNA損傷修復(fù)的進(jìn)行提供有利條件。

復(fù)制叉停滯(replication fork stall)為DNA損傷修復(fù)過(guò)程提供充足的時(shí)間。經(jīng)典理論認(rèn)為，PARP1在損傷位點(diǎn)的募集在復(fù)制叉停滯中發(fā)揮主要作用[20]，但這無(wú)法解釋在PARPi導(dǎo)致PARP捕獲的情況下，復(fù)制叉反而更不穩(wěn)定。最近的研究認(rèn)為，PARP1在損傷位點(diǎn)的募集和PAR修飾可抑制DNA修復(fù)相關(guān)解旋酶RECQ1的活性，而RECQ1激活會(huì)導(dǎo)致停滯的復(fù)制叉重啟[21]，明確了PARP1維持復(fù)制叉停滯的作用機(jī)制。

DNA損傷修復(fù)過(guò)程需要多種蛋白質(zhì)的募集，這就需要損傷位點(diǎn)附近具有足夠的空間。一般情況下，染色質(zhì)高度聚集并纏繞在組蛋白上，不利于DNA損傷修復(fù)，這就需要損傷位點(diǎn)附近形成一段較為松散的DNA結(jié)構(gòu)[22]。Smeenk等[23]揭示，PARP1可PAR修飾核小體組蛋白并促使其解離。同時(shí)，PARP1自身的PAR修飾可以招募多種染色質(zhì)重塑因子(chromatin remodeling factor，CRF)。例如，ALC1、CHD2、CARM1和SMARCA5等。這些分子可進(jìn)一步促進(jìn)核小體解聚，使纏繞的染色質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮⒌木€性結(jié)構(gòu)[24, 25]。

另外，PARP1也能影響DSB修復(fù)途徑的選擇和DNA損傷檢查點(diǎn)的激活。此二者機(jī)制與PARPi抗腫瘤的作用機(jī)制相關(guān)，將在后文詳細(xì)說(shuō)明。

1.3 PARP1參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展

早年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在輕度氧化應(yīng)激的情況下，PARP1缺陷的組織細(xì)胞比正常細(xì)胞更易發(fā)生凋亡。盡管PARP1在維持基因組穩(wěn)定性方面的作用可以部分解釋這一現(xiàn)象，但仍不夠充分[26]。近年來(lái)，有越來(lái)越多的證據(jù)支持PARP1廣泛參與細(xì)胞自噬、衰老和炎癥過(guò)程[4]。其在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮的功能也成為最新研究的熱點(diǎn)。

神經(jīng)退行性疾病的一大病理改變是細(xì)胞內(nèi)的異常蛋白質(zhì)沉積。其中，許多蛋白質(zhì)被證實(shí)有增強(qiáng)PARP1活性的能力。例如，β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)、Tau蛋白和α-突觸核蛋白(α-synuclein)等[27-29]。PARP1活性的增強(qiáng)，一方面對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行PAR修飾，導(dǎo)致其進(jìn)一步聚集并加重神經(jīng)元毒性；另一方面，過(guò)度的PAR修飾，可使NAD+和ATP耗竭，引起細(xì)胞內(nèi)ROS生成和能量代謝障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[30]。

慢性炎癥也是神經(jīng)退行性疾病的誘因之一。沉默調(diào)節(jié)蛋白(sirtuin，SIRT)是一類NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶。多項(xiàng)研究證實(shí)，SIRT1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。例如，SIRT1可使Tau蛋白去乙?；兊貌环€(wěn)定，以減少Tau蛋白聚集[31]。而PARP1過(guò)度激活會(huì)抑制SIRT1活性[32]，可能的后果包括SIRT1介導(dǎo)的高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)乙?；浇档?，使HMGB1釋放到細(xì)胞外，進(jìn)而發(fā)揮與炎癥因子類似的作用引起神經(jīng)炎癥[33]；以及通過(guò)激活NF-κB通路，增強(qiáng)炎癥因子，例如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)及CXC亞族趨化因子配體2(CXC subfamily chemokine 2，CXCL2)等的表達(dá)[34]。

目前臨床上處理剖宮產(chǎn)術(shù)后鎮(zhèn)痛多采用硬膜外鎮(zhèn)痛或靜脈鎮(zhèn)痛，硬膜外鎮(zhèn)痛雖然效果確切但低血壓、運(yùn)動(dòng)阻滯、尿潴留、抑制胃腸道蠕動(dòng)發(fā)生率高，而靜脈鎮(zhèn)痛效果差，且容易發(fā)生呼吸抑制、過(guò)度鎮(zhèn)靜、惡心嘔吐等不良反應(yīng)[11]。神經(jīng)阻滯技術(shù)是術(shù)后多模式鎮(zhèn)痛的一種安全有效的補(bǔ)充方法。對(duì)阿片類藥物反應(yīng)較差或耐藥患者，神經(jīng)阻滯鎮(zhèn)痛效果良好。

總之，PARP1的過(guò)度激活在多方面影響細(xì)胞正常生理功能，促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。對(duì)此，科研人員發(fā)現(xiàn)了一些僅抑制PARP1活性，而不導(dǎo)致PARP捕獲的“新型PARP抑制劑”[35]，被認(rèn)為可有望用于神經(jīng)退行性疾病的治療。

2 聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶抑制劑的抗腫瘤作用機(jī)制

PARPi可影響PARP1的功能，使細(xì)胞失去修復(fù)SSB的能力，導(dǎo)致SSB進(jìn)展為DSB。對(duì)于正常細(xì)胞而言，正如上文所述，細(xì)胞仍可進(jìn)行同源重組修復(fù)。然而，對(duì)于BRCA1或BRCA2基因突變的細(xì)胞，其HR功能缺陷，細(xì)胞因不能修復(fù)DNA損傷，最終走向凋亡。這種由單一因素作用不表現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的殺傷，而二者共同作用下引起細(xì)胞死亡的效應(yīng)，被稱為“合成致死(synthetic lethality)”[36]。

2.1 PARPi可抑制PARP1催化活性

前已述及，PARP1進(jìn)行PAR修飾使用的ADP-核糖供體是NAD+。而奧拉帕尼、盧卡帕尼等PARPi中有與NAD+的煙酰胺類似的環(huán)結(jié)構(gòu)(Fig.3)[37]，這是PARPi競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PARP1的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。PARP1結(jié)合PARPi后，不再能催化PAR修飾反應(yīng)，也就不能啟動(dòng)SSB修復(fù)通路。

Fig.3 Molecular structure of Olaparib and Rucaparib Nicotinamide-like structures are shown in the dotted box

通過(guò)X線晶體衍射技術(shù)可以判明，PARPi的類煙酰胺結(jié)構(gòu)可與PARP1形成3個(gè)關(guān)鍵的氫鍵，分別位于Gly863、Ser904和Tyr907[38]。此外，PARPi的特殊結(jié)構(gòu)還會(huì)與PARP1形成共價(jià)連接，具體結(jié)合位點(diǎn)根據(jù)PARPi種類而略有不同，常見(jiàn)的位點(diǎn)包括Tyr889、Tyr896、Phe897、Ala898和Lys903等[39-41]。不難看出，這些位點(diǎn)仍屬于PARP1的催化結(jié)構(gòu)域。換言之，PARPi與PARP1的結(jié)合不會(huì)影響其與DNA結(jié)合的能力，這對(duì)解釋PARPi耐藥性具有重要意義。

2.2 PARP1捕獲是PARPi殺傷腫瘤的主要原因

雖然PARPi抑制PARP1催化活性的能力客觀存在，但這種能力尚不能完全解釋PARPi的抗腫瘤活性。因?yàn)槿绻麅H從抑制PARP1酶活性的角度來(lái)看，使用PARPi和敲除PARP1的效果應(yīng)該是一致的。然而，2012年Murai等[42]發(fā)現(xiàn)，PARP1敲除組細(xì)胞存活率顯著高于使用PARPi組，同時(shí)如果敲除PARPi組細(xì)胞的PARP1，細(xì)胞存活率將提高，表明除抑制PARP1活性，PARPi還有其他抗腫瘤機(jī)制。近年的研究表明，相比于PARP1催化活性的抑制，“PARP捕獲(PARP trapping)”是PARPi更為重要的作用機(jī)制[43]。體外和體內(nèi)研究均證實(shí)，在正常情況下，PARP1發(fā)生PAR修飾后，其與DNA結(jié)合能力將減弱，導(dǎo)致其自動(dòng)從損傷位點(diǎn)脫落，以便相關(guān)效應(yīng)酶定位在損傷位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)[44]。然而，在PARPi存在情況下，PARP1不能正確進(jìn)行PAR修飾，也就不能從損傷位點(diǎn)脫離，即形成“PARP捕獲”。導(dǎo)致PARP1不能正常發(fā)揮功能的同時(shí)，還成為DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程的障礙，加劇了基因組不穩(wěn)定。此外，一些腫瘤細(xì)胞中存在PARP1基因的突變，而其仍能存活[45]，提示PARP1并非SSB修復(fù)通路的唯一啟動(dòng)因子。事實(shí)上，細(xì)胞中還有其他參與修復(fù)SSB通路，例如在損傷初期，RPA也可與ssDNA結(jié)合，而后募集損傷檢查點(diǎn)激酶ATR，ATR發(fā)生自身磷酸化，激活后續(xù)SSB修復(fù)相關(guān)酶[46, 47]。PARP1捕獲也同時(shí)影響了這些分子對(duì)SSB的修復(fù)作用。

2.3 PARP1其他功能的抑制導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定

前已述及，PARP1參與DSB修復(fù)通路的選擇。在細(xì)胞的S/G2期，理論上HR和NHEJ都有進(jìn)行的基礎(chǔ)，此時(shí)細(xì)胞選用哪種途徑進(jìn)行修復(fù)，實(shí)際上是2條通路間的分子競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。例如，在DSB初期的53BP1-RIF1-Shieldin復(fù)合體保護(hù)末端，不利于HR途徑中MRN復(fù)合體對(duì)末端的剪切加工，此時(shí)如BRCA1活性強(qiáng)，則能去除53BP1，進(jìn)行HR，而如果53BP1活性強(qiáng)，則進(jìn)行NHEJ[48]。近年有研究證實(shí)，PARP1激活產(chǎn)生的PAR鏈能直接與NHEJ修復(fù)的識(shí)別分子Ku70和Ku80結(jié)合，抑制二者活性，從而抑制NHEJ途徑[49]。因此，在PARPi存在情況下，NHEJ通路的抑制會(huì)被解除，與BRCA突變細(xì)胞的HR缺陷表型產(chǎn)生協(xié)同作用，使細(xì)胞選擇NHEJ修復(fù)途徑，而NHEJ的保真性不強(qiáng)，因此常導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。

PARPi對(duì)S期DNA損傷檢查點(diǎn)的抑制也是導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定的原因之一。DNAFiber研究發(fā)現(xiàn)，在PARPi存在時(shí)，復(fù)制叉速度提高了約1.4倍[50]，復(fù)制叉行進(jìn)速率過(guò)快常導(dǎo)致復(fù)制錯(cuò)誤，無(wú)法停滯的復(fù)制叉也直接加快了崩潰的速度。一種合理的解釋是，在復(fù)制叉上存在SSB位點(diǎn)時(shí)，PARP1可以PAR修飾p53，從而促進(jìn)p53活性，進(jìn)而啟動(dòng)DNA損傷檢查點(diǎn)，使復(fù)制叉停滯[51, 52]，以便損傷得到修復(fù)。而PARPi使這些功能喪失，引發(fā)復(fù)制叉迅速崩潰。

綜上所述，PARPi抗腫瘤的作用機(jī)制可總結(jié)如Fig.4。

Fig.4 The main anti-tumor mechanism of PARPi PARPi can interrupt cells from repairing DNA single strand damage by (A) competitive binding of PARP1 to suppress PARylation and (B) making PARP1 trapping on DNA break site. In addition, PARPi can also (C) reduce the binding of Ku70 and KU80 to PARP1, thus affecting the choice of DSB repair pathway. PARPi can also (D) interfere with the DNA damage checkpoint by affecting the PAR modification of p53. Together with BRCA deficiency, the above mechanisms lead to cell genomic instability and eventually apoptosis

3 腫瘤細(xì)胞對(duì)聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶抑制劑的耐藥機(jī)制

耐藥腫瘤細(xì)胞無(wú)一例外地都有一個(gè)或多個(gè)基因的突變，這些基因從不同層面影響DNA損傷修復(fù)過(guò)程[53]。從機(jī)制上，與耐藥相關(guān)的突變可分為以下幾類。

3.1 HR途徑恢復(fù)

PARPi抗腫瘤主要依賴合成致死效應(yīng)，因此細(xì)胞自身HR通路的缺陷對(duì)PARPi的殺傷作用是至關(guān)重要的。BRCA1/2突變是臨床最常見(jiàn)的HR缺陷型腫瘤，也是PARPi的用藥指征之一。但臨床發(fā)現(xiàn)，少數(shù)患者在接受PARPi治療后，自身BRCA1/2會(huì)發(fā)生回歸突變。其中，2次移碼突變占絕大多數(shù)，即原本發(fā)生1次移碼突變，導(dǎo)致BRCA轉(zhuǎn)錄翻譯提前終止。而再次突變時(shí)，2次相加缺失的堿基數(shù)恰為3的倍數(shù)，使BRCA基因在一定程度上恢復(fù)活性[54]。

在HR恢復(fù)表型中占更大比例的是53BP1缺失型[55]。前文提到，細(xì)胞面對(duì)DSB時(shí)存在HR和NHEJ途徑的選擇機(jī)制，53BP1因能保護(hù)損傷末端不受HR所必要的剪切加工，可促使細(xì)胞傾向選擇NHEJ修復(fù)途徑。而如53BP1缺失，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞傾向選擇HR，在一定程度上避免了細(xì)胞凋亡，致使細(xì)胞對(duì)PARPi耐藥。最新的臨床報(bào)告證實(shí)，與53BP1共同發(fā)揮作用的Shieldin基因及其下游的腫瘤蛋白P53基因(tumor protein P53 gene，TP53)突變，也會(huì)帶來(lái)類似的結(jié)果[56, 57]。

目前，臨床上開(kāi)發(fā)了多種聯(lián)合用藥策略，以應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞此種類型的耐藥，主要思路是通過(guò)人為干預(yù)HR的其他靶點(diǎn)，減弱細(xì)胞HR活性。例如，聯(lián)用CDK抑制劑、HSP90抑制劑、HDAC抑制劑以及聯(lián)合電離輻射等[58]。其中，CDK是HR第一步末端剪切的重要活化因子[59]，熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)是BRCA1發(fā)揮活性的輔因子[25]。HDAC是細(xì)胞中重要的組蛋白去乙?；?，在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮作用。如果去乙?；饔帽灰种?，許多與HR修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)將會(huì)下調(diào)，例如細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(cell cycle checkpoint kinase 1，CHK1)、RAD51、BRCA1和HSP90等[60, 61]。此外，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，電離輻射能促進(jìn)細(xì)胞核中BRCA1向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，使核內(nèi)BRCA1耗竭，導(dǎo)致HR缺陷[62]。

3.2 PARP1與SSB位點(diǎn)結(jié)合減弱

PARP1捕獲是PARPi殺傷腫瘤的主要機(jī)制。細(xì)胞中如缺失PARP1基因，損傷位點(diǎn)便不會(huì)有捕獲的PARP1引發(fā)復(fù)制壓力，且細(xì)胞也能通過(guò)其他途徑修復(fù)SSB，導(dǎo)致PARPi耐藥。但這類突變一般僅在科研工作中人為構(gòu)建，在臨床上尚未發(fā)現(xiàn)[63]。更為常見(jiàn)的是PAR糖苷水解酶(poly ADP-ribose glycohydrolase，PARG)基因的缺失[64]。PARG可水解PAR鏈，與PARP1功能相拮抗。在生理情況下，PARG活性對(duì)PARP1功能的維持具有重要意義。PARP1經(jīng)過(guò)自身PAR修飾后，從SSB位點(diǎn)脫落，由PARG去除PAR修飾，使PARP1恢復(fù)與DNA的結(jié)合能力和PAR修飾催化活性，以便下次發(fā)生SSB時(shí)行使正常功能[65]。而如果細(xì)胞中PARG缺失，一方面PARP1即便被PARPi結(jié)合，仍可被其他酶進(jìn)行PAR修飾，從而正常啟動(dòng)SSB損傷修復(fù)通路；另一方面，由于脫離的PARP1不能被及時(shí)去除PAR修飾，在之后的SSB過(guò)程中不能正常與DNA結(jié)合，也就減少了PARP1捕獲。對(duì)于PARG缺失導(dǎo)致耐藥，一些人工合成PAR鏈降解劑，如iRucaparib-AP6被證實(shí)有良好的療效[66]。

3.3 復(fù)制叉穩(wěn)定性增強(qiáng)

復(fù)制叉停滯是細(xì)胞在面對(duì)復(fù)制壓力時(shí)的保護(hù)機(jī)制，也是細(xì)胞得以修復(fù)DNA損傷并繼續(xù)存活的保證。BRCA1/2除上述HR修復(fù)通路的功能外，也參與復(fù)制叉停滯的保護(hù)，對(duì)于BRCA1/2突變細(xì)胞，復(fù)制叉呈現(xiàn)不穩(wěn)定性，易被降解[67, 68]。細(xì)胞中存在多種降解復(fù)制叉的機(jī)制，其中具有核酸酶活性的效應(yīng)分子主要是甲磺酸鹽及紫外線敏感基因81(methanesulfonate and ultraviolet sensitive gene clone 81，MUS81)編碼蛋白質(zhì)MUS81和減數(shù)分裂重組蛋白11(meiotic recombinant protein11，MRE11)兩種。這二者識(shí)別和招募的機(jī)制略有不同，其中MUS81主要通過(guò)甲基化酶Zeste基因增強(qiáng)子(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)進(jìn)行H3K27me3修飾而被招募到復(fù)制叉[69]，而MRE11主要通過(guò)Pax反式激活域相互作用蛋白(Pax transactivation domain-interacting protein，PTIP)-MLL3-MLL4甲基化酶復(fù)合體進(jìn)行H3K4me3修飾而被招募[70]。

因此，細(xì)胞如發(fā)生EZH2和PTIP基因的缺失，組蛋白相應(yīng)位點(diǎn)不能被甲基化，因而核酸酶不能被招募到停滯的復(fù)制叉附近，抑制了復(fù)制叉的降解。復(fù)制叉穩(wěn)定性增強(qiáng)，意味著細(xì)胞有更充足的時(shí)間修復(fù)DNA損傷，使腫瘤細(xì)胞在PARPi的攻擊下得以存活。針對(duì)此類突變的治療策略主要是通過(guò)聯(lián)用CDK抑制劑、p53抑制劑等[71]，促使細(xì)胞DNA損傷檢查點(diǎn)失效，從而使復(fù)制叉加速。

3.4 主動(dòng)藥物外排增加

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter)，是一種以ATP為驅(qū)動(dòng)能源的跨膜運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以耗能形式將細(xì)胞中代謝產(chǎn)物、毒素和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至膜外。其中，與藥物外排相關(guān)的蛋白質(zhì)主要是ABC家族成員中的1a和1b(ABC1a/b)[72]。有研究證實(shí)，在PARPi耐藥乳腺癌中，ABC1a/b的水平有不同程度的上調(diào)(2～85倍)。且在應(yīng)用2種常見(jiàn)的ABC抑制劑Elacridar和Verapamil后，腫瘤耐藥性有所逆轉(zhuǎn)，證實(shí)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在PARPi耐藥中發(fā)揮的作用[73]。

事實(shí)上，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的上調(diào)可見(jiàn)于大量腫瘤患者中，且常導(dǎo)致多藥耐藥性?？朔幬锿馀诺姆椒ㄒ膊o(wú)特異性，主要思路包括聯(lián)用ABC抑制劑和改進(jìn)藥物結(jié)構(gòu)，使ABC不能外排。ABC抑制劑目前研究比較成熟，已有最新的3代藥物，例如Cyclosporine、VX-710、GF120918和XR-9576等[74]；而在藥物結(jié)構(gòu)的改進(jìn)方面，發(fā)現(xiàn)蒽環(huán)結(jié)構(gòu)可極大阻礙ABC轉(zhuǎn)運(yùn)[75]，為新型PARPi研發(fā)提供了方向。

PARPi的耐藥機(jī)制和相關(guān)突變基因可總結(jié)于Table 1。值得注意的是，除基因突變可導(dǎo)致PARPi耐藥，最近的研究發(fā)現(xiàn)，PARPi耐藥還可能與細(xì)胞表觀遺傳修飾和miRNA的異常表達(dá)相關(guān)[76, 77]。不難看出，因PARPi耐藥的機(jī)制各異，在選擇對(duì)抗PARPi耐藥的方案之前，了解患者存在的基因突變，找到具體的耐藥機(jī)制，對(duì)治療具有較大幫助。

Table 1 Mechanism and related genes of PARPi resistance

4 問(wèn)題與展望

雖然PARP1參與DNA損傷修復(fù)已是較為經(jīng)典的認(rèn)識(shí)，但該過(guò)程仍有諸多細(xì)節(jié)值得探究。例如，PARP1與DNA的結(jié)合-解離過(guò)程是否需要其它分子的協(xié)助，影響PARP1底物選擇和催化活性的分子有哪些，PARPi結(jié)構(gòu)的不同是如何影響PARP1捕獲程度的等。解明這些問(wèn)題，無(wú)疑將會(huì)為克服PARPi耐藥性，研制更為高效的PARPi提供支持。另外，與PARPi相關(guān)的基礎(chǔ)研究也在不斷發(fā)展，包括在基因?qū)用鎸ふ遗cBRCA突變類似的HR缺陷表型腫瘤，從而將PARPi推廣到多種類型癌癥的治療中；以及仿照PARPi與HR缺陷的合成致死概念設(shè)計(jì)藥物靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)全新的抗腫瘤用藥策略。與此同時(shí)，隨著研究的進(jìn)展，人們對(duì)PARP1功能的認(rèn)識(shí)已經(jīng)不再局限在DNA損傷修復(fù)上。近年越來(lái)越多的研究指出，PARP1在細(xì)胞周期和能量代謝調(diào)控等方面發(fā)揮更為廣泛的作用，這讓人們認(rèn)識(shí)到PARP1在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中均扮演重要角色。總之，在意識(shí)到臨床問(wèn)題，開(kāi)發(fā)新療法的同時(shí)，基礎(chǔ)研究也應(yīng)持續(xù)推進(jìn)，期待有朝一日，我們能對(duì)PARP1的功能有全面的認(rèn)識(shí)，PARPi能夠得到廣泛的應(yīng)用。