青稞秸稈總黃酮提取工藝優(yōu)化及降血糖活性研究

龍 林，黃 盼，程佩佩，胡 輝，李清安，劉源才，石子林

(1.勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，中國 黃石 435100；2.湖北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，中國 黃石 435100；3.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，中國 黃石 435100；4.勁牌研究院，中國 黃石 435100)

青稞(HordeumvulgareLinn.var.nudum Hook.F.)，為禾本科大麥屬一年生草本植物[1]。其主要分布于青海、西藏、甘肅以及四川等高海拔地區(qū)[2]，其中以西藏地區(qū)的種植最廣，青稞早已成為藏民心中不可替代的主糧。在藏區(qū)，青稞在飼料以及釀造行業(yè)也起著無可替代的作用，以青稞釀造而成的青稞酒、青稞啤酒深受社會各界的喜愛。

除此之外，青稞還富含多種氨基酸、蛋白質(zhì)以及豐富的無機鹽、維生素、酚類、甾醇類以及黃酮類等生物活性物質(zhì)，具有較好的保健功效[3-5]。其中，黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抑菌、降血脂、降血糖等諸多藥理活性，在臨床上應(yīng)用較為廣泛[6-8]。目前，對青稞種子中總黃酮的研究較多[9-11]，而對青稞秸稈中總黃酮的研究相對較少，尚未見到對青稞秸稈中總黃酮的相關(guān)研究。每到青稞采收的季節(jié)，大量的青稞秸稈被遺棄，造成了極大的資源浪費。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，全球約有9.1%的成年人患有糖尿病，還有6.9%的人由于糖代謝功能受損而存在潛在的患病風(fēng)險，在這些患者和潛在患者當(dāng)中，中國的占比位居第一[12-14]。而α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶通過參與小腸內(nèi)的碳水化合物消化和吸收進(jìn)而影響著人體餐后的血糖水平，目前市場上常見的降血糖藥物有拜糖平、倍欣等，這些藥物雖具有一定的功效，但大多都有或多或少的毒副作用，不宜長期服用[15,16]。因此，找到一款天然產(chǎn)物類降血糖類藥物也成為了目前研究的熱點課題。

本研究以青稞秸稈為對象，對其秸稈總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對總黃酮抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性進(jìn)行探究，旨在提高青稞秸稈的利用率。

1 材料與方法

1.1 主要材料

青稞秸稈(西藏奇正藥業(yè)有限公司，經(jīng)勁牌持正堂藥業(yè)有限公司孫代華研究員鑒定為禾本科大麥屬植物青稞HordeumvulgareLinn.var.nudum Hook.F.的莖稈)，α-淀粉酶(>10 U·mg-1) (Sigma公司)、α-葡萄糖苷酶(>50 U·mg-1) (Sigma公司)，蔗糖酶(Sigma公司)，其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

儀表恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)，Ultrospec-4300型紫外分光光度計(瑞典GE公司)，TE412-L型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.3 材料預(yù)處理

青稞秸稈自然風(fēng)干至恒定質(zhì)量后，粉碎，過藥典五號篩，將過篩后的青稞秸稈粉末常溫避光保存。

1.4 提取方法

精密稱取2.0 g青稞秸稈粉末，按照一定的提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比，水浴冷凝回流提取，提取完畢后，加純水定容至100 mL，即得供試品溶液。

1.5 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品40 mg，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶解并定容至100 mL，混勻后即得0.4 g·L-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液；于25 mL容量瓶中精密滴加1，2，4，6，8，10，12 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次向容量瓶中滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻靜置6 min，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻靜置6 min，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氫氧化鈉溶液10 mL后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min，以空白樣品作對照，并于510 nm處測其吸光度。以蘆丁的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后所得回歸方程如下：Y=0.496X-0.015 2(R2=0.999 6)，線性范圍：0.04～4.00 g·L-1。

1.6 青稞秸稈總黃酮含量測定

精密量取提取完畢后的青稞秸稈溶液1 mL，按照1.5中的方法顯色后結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計算青稞秸稈中總黃酮含量。

1.7 青稞秸稈總黃酮提取率測定

青稞秸稈總黃酮提取率=(青稞秸稈總黃酮質(zhì)量/青稞秸稈粉末質(zhì)量)×100%。

1.8 青稞秸稈總黃酮提取單因素試驗

按照1.4中的提取方法，研究提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)及液料比對青稞秸稈總黃酮提取率的影響。

1.8.1 提取溫度 精密稱取5.0 g青稞秸稈粉末，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時間90 min、液料比40∶1 (mL·g-1)，按提取溫度(50,60,70,80,90 ℃)設(shè)置梯度試驗，研究提取溫度對青稞秸稈總黃酮提取率的影響。

1.8.2 提取時間 精密稱取5.0 g青稞秸稈粉末，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度80 ℃、液料比40∶1 (mL·g-1)，按提取時間(30,60,90,120,150 min)設(shè)置梯度試驗，研究提取時間對青稞秸稈總黃酮提取率的影響。

1.8.3 乙醇體積分?jǐn)?shù) 精密稱取5.0 g青稞秸稈粉末，固定提取時間120 min、提取溫度80 ℃、液料比40∶1 (mL·g-1)，按乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%,60%,70%,80%,90%)設(shè)置梯度試驗，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對青稞秸稈總黃酮提取率的影響。

1.8.4 液料比 精密稱取5.0 g青稞秸稈粉末，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時間120 min、提取溫度80 ℃，按液料比(mL·g-1) (20∶1,30∶1,40∶1,50∶1,60∶1)設(shè)置梯度試驗，研究液料比對青稞秸稈總黃酮提取率的影響。

1.9 青稞秸稈總黃酮提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化

在1.8單因素試驗基礎(chǔ)上，以提取溫度，提取時間和液料比3因素為研究對象，以青稞秸稈總黃酮提取率為響應(yīng)值，按照中心組合試驗設(shè)計原理設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，以確定3因素對青稞秸稈總黃酮提取率影響的顯著性水平以及青稞秸稈總黃酮的最優(yōu)提取工藝條件。響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面法實驗因素水平Table 1 Levels of experimental factors for the response surface method

1.10 青稞秸稈總黃酮生物活性試驗

1.10.1α-淀粉酶抑制活性測定 取20 μL青稞秸稈總黃酮溶液(20% DMSO溶解)與200 μLα-淀粉酶溶液37 ℃保溫反應(yīng)40 min；再加入700 μL淀粉溶液，37 ℃保溫酶解15 min，之后用100 μL HCl溶液終止反應(yīng)，加碘顯色，測定650 nm處吸光值。計算公式如下：

其中OD樣品，OD陰性及OD空白分別為正常實驗的吸光值、用無水乙醇代替α-淀粉酶的吸光值及用純水代替青稞秸稈總黃酮溶液實驗的吸光值。

1.10.2α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 取20 μL青稞總黃酮溶液與200 μLα-葡萄糖苷酶溶液37 ℃保溫反應(yīng)30 min；再加入700 μL PNPG(對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)溶液，37 ℃保溫酶解15 min，之后用100 μL碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，測定405 nm處吸光值。計算公式如下：

其中OD樣品，OD陰性及OD空白分別為正常實驗的吸光值、用無水乙醇代替α-葡萄糖苷酶的吸光值及用純水代替青稞秸稈總黃酮溶液實驗的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞秸稈總黃酮提取工藝單因素試驗

2.1.1 提取溫度 由圖1可知，隨著提取溫度的逐漸上升，青稞秸稈總黃酮提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這可能是因為溫度過高導(dǎo)致提取出的總黃酮又被水解，在80 ℃時提取率達(dá)到峰值，為1.61%。因此選擇青稞秸稈總黃酮提取的最佳溫度為80 ℃。

圖1 提取溫度對青稞秸稈總黃酮提取率的影響Fig. 1 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids in barley stalks and leaves

2.1.2 提取時間 由圖2可知，隨著提取時間的增加，青稞秸稈總黃酮提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這可能是因為過長的提取時間會導(dǎo)致所提出的總黃酮部分水解，從而降低了所提總黃酮的濃度，當(dāng)提取120 min時，此時提取率達(dá)到峰值1.72%。因此選擇青稞秸稈總黃酮的最佳提取時間為120 min。

圖2 提取時間對青稞秸稈總黃酮提取率的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids in barley stalks and leaves

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù) 由圖3可知，青稞秸稈總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，此時提取率達(dá)到峰值1.82%。故選擇提取青稞秸稈總黃酮的最優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對青稞秸稈總黃酮提取率的影響Fig. 3 Effect of ethanol volume on the extraction rate of total flavonoids in barley stalks and leaves

2.1.4 液料比 由圖4可知，隨著液料比的逐漸增大，青稞秸稈總黃酮提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這可能是因為，如果液料比太小會導(dǎo)致青稞秸稈提取不夠充分；液料比太大則會導(dǎo)致濃縮的時間過長，從而使得總黃酮有所損失。當(dāng)液料比為30∶1 (mL·g-1)時，此時提取率達(dá)到峰1.92%。故選擇青稞秸稈總黃酮提取的最佳液料比為30∶1 (mL·g-1)。

圖4 液料比對青稞秸稈總黃酮提取率的影響Fig. 4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of total flavonoids in barley stalks and leaves

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化青稞秸稈總黃酮提取工藝試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，篩選出對青稞秸稈總黃酮提取率影響較大的3個因素：提取溫度(A)、提取時間(B)和液料比(C)。以青稞秸稈總黃酮提取率(Y)為響應(yīng)值，依據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗的設(shè)計原理進(jìn)行試驗設(shè)計，設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示，利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2進(jìn)行回歸分析，所得回歸方程如下：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

Y=-7.3+0.152 25A+0.018 5B+0.141 25C-1.67×10-5AB-0.000 15AC+1.67×10-5BC-0.000 925A2-8.06×10-5B2-0.002 075C2。

為了驗證回歸方程的可行性，以及更好地驗證各因素對青稞秸稈總黃酮提取率的影響大小，結(jié)合響應(yīng)面試驗結(jié)果以及回歸方程作方差分析，如表3所示。由表3可知，該模型F值為16.35，P值為0.000 7<0.01，說明該模型差異極顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義；其失擬差的P值為0.151 4>0.01，差異不顯著，表明差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)合模型的P值和失擬差的P值，說明該回歸方程具有良好的擬合性，該實驗所造成的誤差相對較小。Radj=0.896 2，說明該模型可解釋89.62%的響應(yīng)值的變化，R2=0.954 6進(jìn)一步驗證了該模型的擬合性較為良好。表3中F值表示各因素對響應(yīng)值Y影響的強弱，F(xiàn)值越大說明該因素對響應(yīng)值Y的影響越強，由表3中F值可知，C>B>A，說明各因素對青稞秸稈總黃酮提取率影響從大到小為：液料比、提取時間、提取溫度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化后，所得最優(yōu)提取工藝為：提取溫度78.74 ℃，提取時間109.95 min，液料比31.64∶1(mL·g-1)的條件下，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇提取，此時提取率為1.95%。考慮到實際應(yīng)用的可操作性和便捷性，選擇青稞秸稈總黃酮的最優(yōu)提取工藝為：提取溫度78 ℃，提取時間110 min，液料比30∶1(mL·g-1)，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇提取。平行試驗5次后，所得總黃酮提取率為1.92%，與預(yù)測值相近，且具有較好的可重復(fù)性。

2.3 青稞秸稈總黃酮生物活性試驗

2.3.1α-淀粉酶抑制活性測定 以淀粉為底物，使α-淀粉酶與青稞秸稈總黃酮充分作用后，再與淀粉反應(yīng)。用紫外分光光度計檢測反應(yīng)后各溶液在650 nm處吸光度，結(jié)果見表4。

表4 青稞秸稈總黃酮對α-淀粉酶的體外抑制效果Table 4 Inhibitory effect of total flavonoids in barley stalks and leaves on α-amylase in vitro

圖5 青稞秸稈總黃酮對α-淀粉酶抑制率 Fig. 5 Inhibitory rates of total flavonoids in barley stalks and leaves on α-amylase

以α-淀粉酶活性抑制率對樣品濃度作圖，見圖5。由圖5可知，青稞秸稈總黃酮對α-淀粉酶的抑制作用呈濃度依賴型，較高濃度的青稞秸稈總黃酮才能明顯抑制α-淀粉酶活性，其IC50>10 g·L-1，表明青稞秸稈總黃酮對α-淀粉酶活性抑制作用不明顯。

2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 以對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)為底物，使α-葡萄糖苷酶與青稞秸稈總黃酮充分作用后，再與PNPG反應(yīng)，產(chǎn)物為對硝基苯酚(PNP)，顯黃色。用紫外分光光度計測得反應(yīng)后各溶液在405 nm處吸光度如表5所示。

表5 青稞秸稈總黃酮對α-葡萄糖苷酶的體外抑制作用Table 5 Inhibitory effect of total flavonoids in barley stalks and leaves on α-glucosidase in vitro

以樣品濃度和α-葡萄糖苷酶活性抑制率作圖，見圖6。由圖6可知，青稞秸稈總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用呈濃度依賴性，較高濃度的青稞秸稈總黃酮能明顯抑制α-葡萄糖苷酶活性，其IC50為2.5 g·L-1，表明青稞秸稈總黃酮對α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用。

圖6 青稞秸稈總黃酮(A)和陽性對照(B)對α-葡萄糖苷酶抑制率Fig. 6 Inhibitory rates of α-glucosidase by total flavonoids in barley stalks and leaves (A) and positive control (B)

3 結(jié)論與討論

本實驗采用乙醇回流法對青稞秸稈總黃酮提取工藝進(jìn)行研究，在單因素實驗基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，所得最優(yōu)提取工藝為：用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇在78 ℃下用30∶1(mL·g-1)的液料比提取110 min，此時總黃酮提取率為1.92%，試驗的實測值與預(yù)估值差距不大，說明該實驗具有較好的預(yù)測性。利用α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶對提取的青稞秸稈總黃酮進(jìn)行活性試驗，結(jié)果表明青稞秸稈總黃酮對α-淀粉酶活性抑制作用不明顯，但對α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用，說明所提取的青稞秸稈總黃酮具有一定的生物活性。

青稞是日常生活中的一種極為常見的植物，但人們對青稞秸稈的開發(fā)利用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。本文研究了青稞秸稈總黃酮對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用，青稞秸稈中其他生物活性物質(zhì)的開發(fā)利用有待學(xué)者們繼續(xù)探討。