鐵筷子揮發(fā)油對(duì)慢性腦缺血致血管性認(rèn)知功能障礙大鼠的作用及機(jī)制研究

丁曉麗，薛丁嘉，鄧萬(wàn)娟，韓彩瑤，劉曉龍，李 媛，錢海兵*

鐵筷子揮發(fā)油對(duì)慢性腦缺血致血管性認(rèn)知功能障礙大鼠的作用及機(jī)制研究

丁曉麗1, 2, 3，薛丁嘉1, 2，鄧萬(wàn)娟1, 2，韓彩瑤1, 2，劉曉龍1, 2，李 媛1，錢海兵1, 2*

1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025 2. 貴州省中醫(yī)藥方證藥理研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025 3. 龍巖市中醫(yī)院，福建 龍巖 364030

探究苗藥鐵筷子[臘梅及山臘梅的干燥根]揮發(fā)油對(duì)慢性腦缺血（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）致血管性認(rèn)知功能障礙（vascular cognitive impairment，VCI）大鼠的作用及機(jī)制。采用改良的雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）法建立CCH模型，將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組及鐵筷子揮發(fā)油高、中、低劑量（80、40、20 mg/kg）組和丁苯酞（63 mg/kg）組，另設(shè)假手術(shù)組，給予相應(yīng)藥物干預(yù)28 d，采用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、Y迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠自主活動(dòng)性和新奇事物探索能力；采用蘇木素-伊紅（HE）染色、Nissl染色、TUNEL染色觀察各組大鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化、尼氏小體以及凋亡細(xì)胞數(shù)量變化；采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平；采用比色法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（cholineacetyltransferase，ChAT）的活性；采用Western blotting法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中BDNF、酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）、磷酸化TrkB（phosphorylated TrkB，p-TrkB）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）蛋白表達(dá)。與模型組比較，鐵筷子揮發(fā)油組大鼠逃避潛伏期縮短（＜0.05、0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)和跨格次數(shù)提高（＜0.05、0.01），在新異臂所待時(shí)間延長(zhǎng)（＜0.05）；神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變性得到改善，腦組織中尼氏小體的數(shù)量提高（＜0.05），細(xì)胞凋亡減少（＜0.05）；血清中BDNF水平及海馬組織中ChAT活性升高（＜0.05、0.01），海馬組織中AChE活性降低（＜0.05）；海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低（＜0.05）。苗藥鐵筷子揮發(fā)油可以改善CCH致VCI大鼠認(rèn)知功能障礙，其作用機(jī)制可能與激活BDNF/TrkB/PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

鐵筷子揮發(fā)油；慢性腦缺血；血管性認(rèn)知功能障礙；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；酪氨酸激酶受體B；磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路

慢性腦缺血（hronic cerebral hypoperfusion，CCH）是腦內(nèi)血流量降低的一種病理狀態(tài)，其中CCH所致的血管性認(rèn)知功能障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是誘發(fā)血管性癡呆的主要危險(xiǎn)因素[1]。VCI的嚴(yán)重程度與腦內(nèi)血流灌注不足呈正相關(guān)，反映了從輕度認(rèn)知功能障礙到嚴(yán)重癡呆的整個(gè)發(fā)展進(jìn)程，若長(zhǎng)期發(fā)展即可導(dǎo)致缺血性腦卒中、阿爾茨海默病、Binswanger病等腦血管疾病的發(fā)生[2]。因此及時(shí)干預(yù)并治療VCI是十分必要的。研究表明腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）/酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）信號(hào)通路與腦內(nèi)神經(jīng)元增殖、分化、存活以及神經(jīng)遞質(zhì)釋放密切相關(guān)，其下游磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的存活有明顯的促進(jìn)作用[3-4]。許多中藥揮發(fā)油如益智仁揮發(fā)油、辛夷揮發(fā)油、當(dāng)歸揮發(fā)油、桂枝湯揮發(fā)油等在改善認(rèn)知障礙方面具有潛在優(yōu)勢(shì)，能夠提高學(xué)習(xí)記憶能力[5-8]。苗藥鐵筷子是臘梅科臘梅屬植物臘梅(L.) Link及山臘梅Oliv.的干燥根，味辛性溫，具有祛風(fēng)止痛、理氣活血的功效，其提取的揮發(fā)油氣辛香，芳香療法已被證實(shí)可以通過(guò)嗅覺(jué)的刺激改善認(rèn)知障礙，且揮發(fā)油較易通過(guò)血腦屏障，其中含量前3的為蓖麻油酸、棕櫚酸、油酸，多為不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸在腦血管方面的治療中有顯著療效[9]。本課題前期研究表明，鐵筷子揮發(fā)油具有極強(qiáng)的抗炎作用，之后又對(duì)其同屬植物山臘梅葉的揮發(fā)油進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)癡呆大鼠的認(rèn)知記憶具有明顯改善作用[10-11]。因此本研究采用改良的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）法建立CCH大鼠模型，水迷宮篩選出CCH致VCI大鼠，探究苗藥鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠的認(rèn)知功能障礙的改善作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～300 g，8周齡，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0014，動(dòng)物合格證號(hào)No. 430726200100285985。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)20210056）。

1.2 藥材

苗藥鐵筷子購(gòu)自貴陽(yáng)萬(wàn)東橋藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉曉龍博士鑒定為臘梅科臘梅屬植物臘梅(L.) Link的干燥根。

1.3 藥品與試劑

丁苯酞軟膠囊（批號(hào)1182005116）購(gòu)自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)20190929）、Nissl染色試劑盒（批號(hào)20210712）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)20210717）、牛血清白蛋白（批號(hào)212D051）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)030521210615）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Omni-EasyTM一步法PAGE凝膠快速制備試劑盒（批號(hào)02561150）、Omni-ECL超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（批號(hào)02581060）購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase，ChAT）試劑盒（批號(hào)20210816）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210806）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BDNF試劑盒（批號(hào)6C3GRQT3BJ）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)AA16201）購(gòu)自南京巴傲得生物科技有限公司；β-actin抗體（批號(hào)00097048）購(gòu)自美國(guó)Protrintech公司；BDNF抗體（批號(hào)3507448002）購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；磷酸化TrkB（phosphorylated TrkB，p-TrkB）抗體（批號(hào)4621T）、p-Akt兔多克隆抗體（批號(hào)9018T）購(gòu)自美國(guó)CST公司；TrkB抗體（批號(hào)GR3360045-3）、PI3K抗體（批號(hào)GR277867-1）、Akt抗體（批號(hào)GR240003-94）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號(hào)GR3241586-3）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.4 儀器

DRT-TW型電熱套（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；JJ224B型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；DNS-2型Morris水迷宮設(shè)備（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；SMART 3.0曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、Y型迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備（美國(guó)Panlab公司）；YZB/0009-2003型組織包埋機(jī)、RM2265型組織切片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；SLK-O3000-S型搖床（美國(guó)Scilogex公司）；XH-D型渦旋混合器（江蘇天翎儀器有限公司）；XK-400型低溫高速離心機(jī)（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；DKZ-2型電熱恒溫水槽（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；EPS300型電泳儀、VE-180型電泳槽（上海天能科技有限公司）；InfiniteM200型酶標(biāo)儀（北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司）；ChemiDocTMTouch超靈敏多功能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光機(jī)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 鐵筷子揮發(fā)油的制備

取粉碎的鐵筷子藥材100 g，置2 L圓底燒瓶中，加入10倍量水，浸泡過(guò)夜，采用水蒸氣蒸餾法制備，取所得揮發(fā)油，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，置于棕色玻璃瓶中備用，所得鐵筷子揮發(fā)油為淡黃色油狀物，具辛香氣味，提取率為0.8%。參照高源等[12]提取方法，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黔產(chǎn)鐵筷子揮發(fā)油中主要成分為棕櫚酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.496%，其余主要成分為亞油酸16.996%、油酸14.586%、α-杜松醇9.028%、氧化石竹烯5.654%。

2.2 動(dòng)物造模及篩選

采用改良的BCCAO方法進(jìn)行造模[13]，大鼠ip 20%烏拉坦（6 mL/kg）麻醉，頸部備皮、消毒，在頸部左側(cè)處皮膚做縱向切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，用4-0手術(shù)尼龍線結(jié)扎頸總動(dòng)脈的近心端和遠(yuǎn)心端，并用眼科剪在中間剪斷，隨后逐層縫合，碘伏消毒；1周后，在右側(cè)進(jìn)行同樣的操作。假手術(shù)組不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，其余操作與造模大鼠保持一致。造模1周后，使用水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選造模成功大鼠，以假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期均值為參考值，若造模大鼠的逃避潛伏期與假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期之差占該鼠逃避潛伏期的比例＞20%則定為造模成功的CCH致VCI大鼠[14]。

2.3 分組及給藥

將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組及鐵筷子揮發(fā)油高、中、低劑量（80、40、20 mg/kg）組和丁苯酞（63 mg/kg）組，每組12只。各給藥組ig相應(yīng)藥物（5 mL/kg），假手術(shù)組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，共28 d。給藥結(jié)束后，每組隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行后續(xù)行為學(xué)和生化檢測(cè)，剩余4只大鼠進(jìn)行病理組織檢測(cè)。

2.4 行為學(xué)檢測(cè)

2.4.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

（1）定位航線實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的時(shí)候，將安全島放置在1個(gè)固定的象限即第II象限，將大鼠面向池壁放入水池，大鼠入水點(diǎn)順序：第1天，I→II→III→IV；第2天，II→III→IV→I；第3天，III→IV→I→II；第4天，IV→I→II→III；第5天，I→II→IV→III。第1天為適應(yīng)性訓(xùn)練不記錄成績(jī)，后4天記錄大鼠在120 s內(nèi)，從不同入水點(diǎn)爬上平臺(tái)消耗的時(shí)間，即逃避潛伏期。若大鼠在120 s內(nèi)爬上平臺(tái)，則讓大鼠在平臺(tái)停留15 s；若大鼠在120 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則可以適當(dāng)引導(dǎo)大鼠爬上平臺(tái)并停留15 s，逃避潛伏期相應(yīng)地記錄為120 s[15]。

（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：在定位航行實(shí)驗(yàn)第6天，撤除安全島平臺(tái)，將大鼠從IV象限面向池壁放入水中，記錄大鼠2 min內(nèi)跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)。

2.4.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 將大鼠放入箱內(nèi)底面中心，觀察大鼠在5 min內(nèi)的行為變化情況及其探索軌跡。每只動(dòng)物檢測(cè)結(jié)束后，需用酒精擦拭整個(gè)箱子，避免本次檢測(cè)對(duì)下一只動(dòng)物的影響與干擾。

2.4.3 Y迷宮實(shí)驗(yàn) 使用隔板封閉新異臂，讓大鼠在另外2個(gè)臂中自由探索8 min，大鼠初進(jìn)迷宮時(shí)所在的臂為起始臂，另一臂稱為其他臂，2 h后移開(kāi)隔板，讓大鼠在3個(gè)臂中自由探索10 min，記錄并比較大鼠在各個(gè)臂中停留的時(shí)間[16]。

2.5 取材

行為學(xué)測(cè)試完成后，麻醉大鼠，打開(kāi)大鼠腹腔，分離腹主動(dòng)脈，以7號(hào)采血針配合5 mL真空紅帽采血管進(jìn)行取血，靜置分離血清，分裝于EP管中，置于?80 ℃保存?zhèn)溆茫⊙戤吅笱杆俎D(zhuǎn)移至冰上取腦，分離海馬，置于?80 ℃保存，用于后續(xù)檢測(cè)；剩余的4只大鼠對(duì)其進(jìn)行灌注取腦，固定于4%多聚甲醛中用于后續(xù)病理組織檢測(cè)。

2.6 HE染色觀察皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化

腦組織于4%多聚甲醛固定48 h后，切取視交叉至乳頭體之間的部分，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），脫蠟至水，蘇木素染色5 min，分化10 s，伊紅染色1 min，封片，于顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。

2.7 Nissl染色觀察皮層及海馬CA1區(qū)尼氏小體數(shù)量

取“2.6”項(xiàng)下制備的腦組織切片，脫蠟至水，滴染亞甲藍(lán)染色液10 min，分化1 min，鉬酸銨溶液處理5 min，封片，于顯微鏡下觀察尼氏小體數(shù)量，采用Image Lab軟件計(jì)數(shù)。

2.8 TUNEL染色觀察皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

取“2.6”項(xiàng)下制備的大鼠腦組織切片，脫蠟至水，加入蛋白酶K作用30 min，加入封閉液孵育20 min，滴加生物素標(biāo)記液，37 ℃避光孵育60 min；滴加Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min；滴加DAB顯色，蘇木素染色1 min，封片，于顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，采用Image Lab軟件計(jì)數(shù)。

2.9 血清中BDNF水平及海馬組織中AchE、ChAT活性的檢測(cè)

取各組大鼠血清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中BDNF水平；取各組大鼠海馬組織，勻漿后，采用比色法測(cè)定海馬組織中AChE和ChAT活性。

2.10 Western blotting檢測(cè)海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K、Akt、p-Akt和Caspase-3的蛋白表達(dá)

取各組大鼠海馬組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在組織研磨儀中研磨，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，加入Loading Buffer，100 ℃煮沸使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封閉1 h，分別加入BDNF抗體（1∶500）、TrkB抗體（1∶5000）、p-TrkB抗體（1∶1000）、PI3K抗體（1∶1000）、Akt抗體（1∶5000）、p-Akt抗體（1∶1000）、Caspase-3抗體（1∶2000）和β-actin抗體（1∶5000），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次后，加入二抗（1∶10 000），孵育1 h，TBST洗滌后，加入顯影液，于凝膠成像儀中顯影。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠行為學(xué)的影響

3.1.1 水迷宮實(shí)驗(yàn) 如圖1-A、B和表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（＜0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（＜0.05），表明經(jīng)造模后大鼠學(xué)習(xí)記憶水平下降，產(chǎn)生認(rèn)知障礙，造模成功；經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)28 d后，與模型組比較，各給藥組大鼠逃避潛伏期均顯著縮短（＜0.05、0.01），鐵筷子揮發(fā)油中、高劑量組和丁苯酞組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯升高（＜0.05、0.01），表明鐵筷子揮發(fā)油可以改善造模大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

3.1.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 如圖1-C和表2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠跨格次數(shù)明顯減少（＜0.01），垂直得分降低（＜0.05）；與模型組比較，鐵筷子揮發(fā)油中劑量組和丁苯酞組大鼠跨格次數(shù)增加（＜0.05、0.01），表明鐵筷子揮發(fā)油可以改善大鼠自主活動(dòng)性，提高探索能力。

3.1.3 Y迷宮 如圖1-D和表3所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在新異臂探索時(shí)間縮短（＜0.05），但在起始臂的停留時(shí)間延長(zhǎng)（＜0.05），在其他臂的停留時(shí)間無(wú)顯著性差異，表明模型組大鼠對(duì)新奇事物的探索能力下降；與模型組比較，鐵筷子揮發(fā)油中劑量組大鼠在新異臂的探索時(shí)間增加（＜0.05），表明鐵筷子揮發(fā)油可提高大鼠探索新奇事物的能力。

A-定位航線實(shí)驗(yàn)軌跡圖 B-空間探索實(shí)驗(yàn)軌跡圖 C-曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)軌跡三維立體圖 D-Y迷宮活動(dòng)軌跡三維立體圖，箭頭所指為新異臂

表1 鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)的影響(, n = 8)

Table 1 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on escape latency and platform crossing times in rats with CCH-induced VCI (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)逃避潛伏期/s穿越平臺(tái)次數(shù)/次 給藥前給藥后給藥前給藥后 假手術(shù)—29.37±9.3426.63±11.647.13±0.839.25±1.39 模型—101.37±37.73**68.25±18.16**4.75±2.86*5.00±1.41** 鐵筷子揮發(fā)油80107.13±24.5030.87±17.60#4.12±1.888.00±3.02## 40106.25±27.2834.00±10.40##4.37±2.137.87±2.47# 20102.25±26.1048.13±24.49#4.62±2.264.75±2.37 丁苯酞63106.75±14.7333.13±12.04##4.50±1.698.75±2.05##

與假手術(shù)組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01，下表同

*< 0.05**< 0.01sham group;#< 0.05##< 0.01model group, same as below tables

表2 鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠跨格次數(shù)和垂直得分的影響(, n = 8)

Table 2 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on number of grid crossing and vertical score in rats with CCH induced VCI (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)跨格次數(shù)垂直得分 假手術(shù)—49.60±12.5313.50±5.26 模型—26.12±9.90**8.12±2.90* 鐵筷子揮發(fā)油8026.87±13.076.87±4.15 4051.62±17.88##10.87±5.02 2035.12±17.038.62±2.72 丁苯酞6343.75±10.68#8.12±2.90

3.2 鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2所示，假手術(shù)組大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，類圓形，邊界清晰、可見(jiàn)核仁，海馬CA1區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列緊密、整齊；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠細(xì)胞結(jié)構(gòu)變性，有些固縮成梭形、三角形，核仁消失，出現(xiàn)空泡，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列疏松；與模型組比較，鐵筷子揮發(fā)油高、中劑量組細(xì)胞結(jié)構(gòu)改善，只見(jiàn)少量的細(xì)胞固縮，海馬區(qū)細(xì)胞排列較為整齊，表明鐵筷子揮發(fā)油對(duì)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變性有一定的修復(fù)作用。

表3 鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠新異臂探索時(shí)間的影響(, n = 8)

Table 3 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on exploration time of new arm in rats with CCH-induced VCI (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)新異臂探索時(shí)間/%起始臂探索時(shí)間/%其他臂探索時(shí)間/% 假手術(shù)—56.32±15.9715.70±9.1227.35±21.78 模型—25.15±11.94*35.40±23.03*23.48±17.21 鐵筷子揮發(fā)油8032.50±16.5431.56±19.2825.93±12.64 4049.66±20.92#23.90±10.8426.27±12.70 2022.92±18.1327.30±29.0333.47±29.35 丁苯酞6339.76±27.9839.76±19.6324.02±12.23

箭頭指示神經(jīng)細(xì)胞固縮

3.3 鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)尼氏小體數(shù)量的影響

如圖3和表4所示，假手術(shù)組大鼠皮層及海馬CA1區(qū)尼氏小體數(shù)量豐富，海馬CA1區(qū)細(xì)胞層數(shù)多，尼氏小體間排列緊密、整齊；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮層及海馬中尼氏小體丟失嚴(yán)重，海馬CA1區(qū)細(xì)胞呈散落狀，細(xì)胞間距增大，尼氏小體數(shù)量明顯減少（＜0.01）；與模型組相比，鐵筷子揮發(fā)油高劑量組皮層尼氏小體的數(shù)量明顯增加（＜0.05），鐵筷子揮發(fā)油高、中劑量組和丁苯酞組海馬CA1區(qū)尼氏小體數(shù)量明顯增加（＜0.05），且細(xì)胞排列較為緊密、有序，表明鐵筷子揮發(fā)油可以提高腦組織中尼氏小體的數(shù)量，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞。

箭頭指示尼氏小體溶解消失

表4 鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)尼氏小體數(shù)量的影響(, n = 4)

Table 4 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on number of Nissl bodies in cerebral cortex and hippocampal CA1 region in rats with CCH-induced VCI (, n = 4)

組別劑量/(mg·kg?1)尼氏小體數(shù)量 海馬CA1區(qū)皮層 假手術(shù)—90.75±5.37195.00±16.83 模型—44.00±5.35**109.00±10.42** 鐵筷子揮發(fā)油8058.00±4.39#156.50±22.64# 4054.50±7.04#117.00±19.88 2039.50±6.61108.00±12.35 丁苯酞6359.25±3.86#120.75±28.06

3.4 鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

如圖4和表5所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮層及海馬CA1區(qū)中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，鐵筷子揮發(fā)油高、中劑量組和丁苯酞組大鼠皮層及海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡率均顯著降低（＜0.05），表明鐵筷子揮發(fā)油可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞具有保護(hù)作用。

箭頭指示凋亡細(xì)胞

表5 鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(, n = 4)

Table 5 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on neuronal apoptosis in cerebral cortex and hippocampal CA1 region in rats with CCH-induced VCI (, n = 4)

組別劑量/(mg·kg?1)細(xì)胞凋亡率/% 海馬CA1區(qū)皮層 假手術(shù)—25.12±4.5030.37±5.85 模型—76.60±9.38**89.10±5.50** 鐵筷子揮發(fā)油8040.28±3.10#55.32±4.54# 4054.28±3.02#74.28±9.36# 2080.59±4.0986.42±5.31 丁苯酞6350.67±5.34#65.12±9.97#

3.5 苗藥鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠血清中BDNF水平及海馬組織中AChE、ChAT活性的影響

如表6所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中BDNF水平和海馬組織中ChAT活性均顯著降低（＜0.05），海馬組織中AChE活性顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，鐵筷子揮發(fā)油高劑量組和丁苯酞組大鼠海馬組織中ChAT活性均顯著升高（＜0.05）；鐵筷子揮發(fā)油高、中劑量組和丁苯酞組大鼠血清中BDNF水平顯著升高（＜0.05、0.01），海馬組織中AChE活性顯著降低（＜0.05），表明鐵筷子揮發(fā)油可以通過(guò)提高血清中BDNF水平，調(diào)節(jié)海馬組織中AChE和ChAT的活性而發(fā)揮作用。

表6 鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠血清中BDNF水平及海馬組織中AChE、ChAT活性的影響(, n = 8)

Table 6 Effect of volatile oil of Chimonanthi Radix on BDNF level in serum and AChE, ChAT activities in hippocampus in rats with CCH-induced VCI (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)BDNF/(pg·mL?1)AChE/(U·mg?1)ChAT/(U·g?1) 假手術(shù)—319.20±72.810.373 8±0.057 3122.86±30.01 模型—182.92±52.44*0.538 9±0.135 9**77.73±20.21* 鐵筷子揮發(fā)油80267.64±47.42#0.419 5±0.076 1#108.54±35.12# 40301.19±92.58##0.448 4±0.052 6#85.50±26.90 20202.17±58.530.504 4±0.101 680.86±16.71 丁苯酞63264.60±66.01#0.411 9±0.080 8#109.50±26.62#

3.6 鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K、Akt、p-Akt和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，鐵筷子揮發(fā)油高、中劑量組大鼠海馬組織中BDNF和p-TrkB蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；鐵筷子揮發(fā)油高劑量組大鼠海馬組織中TrkB、PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05）。

4 討論

人口老齡化是世界發(fā)展大勢(shì)，2018年我國(guó)65歲及以上的老年人達(dá)到1.67億，占我國(guó)總?cè)丝跀?shù)的11.9%，預(yù)計(jì)2020—2035年中國(guó)老年人口將實(shí)現(xiàn)大幅增長(zhǎng)[17]。CCH高發(fā)于中老年人群，當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)，腦灰質(zhì)和腦白質(zhì)產(chǎn)生缺血性損傷從而誘發(fā)VCI[18]。

A-假手術(shù)組 B-模型組 C-鐵筷子揮發(fā)油高劑量組 D-鐵筷子揮發(fā)油中劑量組 E-鐵筷子揮發(fā)油低劑量組 F-丁苯酞組 與假手術(shù)組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

目前，常采用BCCAO法制備CCH模型，經(jīng)BCCAO造模后，大鼠全血黏度中切、低切偏高，血漿黏度增加，出現(xiàn)血液流變學(xué)障礙，學(xué)習(xí)記憶能力受損[19]。大鼠具有Willis循環(huán)，與人類腦血管解剖較為接近，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后大鼠可通過(guò)基底動(dòng)脈和基底動(dòng)脈環(huán)調(diào)節(jié)血流，逐漸形成側(cè)枝循環(huán)所，產(chǎn)生一種慢性腦低灌注狀態(tài)。但是一次性阻斷會(huì)導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)血流量急性減少，與慢性低灌注的損傷不太吻合，且動(dòng)物死亡率較高，因此本研究采用改良的BCCAO即間隔1周后結(jié)扎另一側(cè)頸總動(dòng)脈的方法制備CCH模型，來(lái)探究苗藥鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠的作用及機(jī)制。

Morris水迷宮已被廣泛用于評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物對(duì)空間位置感和方向感的學(xué)習(xí)、記憶能力。水迷宮可利用嚙齒類動(dòng)物怕水但善于游泳的天性迫使動(dòng)物學(xué)習(xí)[20]，本研究共進(jìn)行2次水迷宮實(shí)驗(yàn)，第1次是通過(guò)與假手術(shù)組比較，篩選出具有學(xué)習(xí)、記憶障礙的CCH致VCI大鼠（即具有認(rèn)知功能障礙的大鼠）；第2次是給藥后對(duì)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)，探究鐵筷子揮發(fā)油對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力是否有改善作用，評(píng)價(jià)其對(duì)大鼠認(rèn)知能力的影響。結(jié)果顯示，造模后的大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)降低，表明CCH可損害大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，導(dǎo)致VCI的產(chǎn)生；給藥后，與模型組比較，各劑量鐵筷子揮發(fā)油均可以縮短大鼠的逃避潛伏期，其中高、中劑量組還可提高大鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)。CCH誘導(dǎo)的VCI不僅體現(xiàn)在學(xué)習(xí)記憶方面，還有注意力、定向力和執(zhí)行力方面的障礙[21]，因此本研究還采用了曠場(chǎng)和Y迷宮2種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)探究苗藥鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠的作用，結(jié)果顯示，鐵筷子揮發(fā)油可以增加模型大鼠的跨格次數(shù)，提高大鼠對(duì)新異臂的探索能力。通過(guò)上述3種行為學(xué)檢測(cè)，可以初步看出鐵筷子揮發(fā)油可以改善CCH致VCI大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高大鼠探索能力以及提高其對(duì)新鮮事物的喜好。

長(zhǎng)期的腦灌注不足極易對(duì)大腦皮層及海馬產(chǎn)生影響，丁利靜等[22]發(fā)現(xiàn)采用BCCAO構(gòu)建的CCH大鼠皮層及海馬中神經(jīng)細(xì)胞損傷嚴(yán)重，發(fā)生了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變性；牟靜靜[23]發(fā)現(xiàn)CCH致認(rèn)知功能障礙的大鼠中，海馬CA1區(qū)和額葉皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)大量脫失、組織結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)元細(xì)胞大量凋亡脫失。大腦皮層作為最高級(jí)的神經(jīng)中樞，在外界信息的整理和翻譯中發(fā)揮著重要的作用，一旦產(chǎn)生損傷會(huì)對(duì)日常的認(rèn)知記憶產(chǎn)生影響。同樣，海馬更是記憶儲(chǔ)存的重要場(chǎng)所，其中CA1區(qū)對(duì)缺血缺氧等損傷最為敏感，CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷、缺失也會(huì)造成記憶的損壞。HE染色結(jié)果表明，模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，核仁消失，有些甚至固縮為梭形和三角形，海馬中的神經(jīng)細(xì)胞較假手術(shù)組排列稀疏、紊亂，表明皮層及海馬中的神經(jīng)細(xì)胞受損，也再次確認(rèn)了CCH致VCI大鼠造模成功，而鐵筷子揮發(fā)油可以修復(fù)皮層及海馬中神經(jīng)細(xì)胞的損傷。為了進(jìn)一步探究神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度及鐵筷子揮發(fā)油對(duì)腦組織的保護(hù)作用，又采用Nissl染色和TUNEL染色發(fā)現(xiàn)鐵筷子揮發(fā)油可以抑制模型大鼠皮層及海馬CA1區(qū)尼氏小體的減少和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。

BDNF主要在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)中合成，低水平的BDNF與認(rèn)知功能障礙高度相關(guān)，上調(diào)BDNF會(huì)對(duì)許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病產(chǎn)生有益的影響[24-25]。成熟的BDNF在腦內(nèi)和外周血清中均有分布，其中在海馬及大腦皮層中含量極高，大腦中的BDNF可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入外周血清，并與血清中BDNF的變化呈正相關(guān)。因此本研究首先通過(guò)ELISA法對(duì)大鼠血清中BDNF水平進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中BDNF水平顯著下降，這也驗(yàn)證了CCH大鼠VCI產(chǎn)生的原因確與BDNF的減少有關(guān)，鐵筷子揮發(fā)油可提高大鼠血清中BDNF水平。不僅如此，外源性BDNF還能提高膽堿能樣神經(jīng)元的功能，增加海馬突觸體釋放乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）[26]。已有研究表明BDNF對(duì)中樞膽堿能神經(jīng)元有刺激生長(zhǎng)作用，能促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元突起向中樞生長(zhǎng)，也可延長(zhǎng)離體培養(yǎng)胚胎大鼠腦中膈膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的存活時(shí)間，并增加AChE和ChAT的活性[27]。因此本研究對(duì)大鼠海馬組織中AChE、ChAT的活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明模型組大鼠海馬組織中ChAT活性降低，AChE活性升高。ChAT是合成ACh的關(guān)鍵酶，AChE可酶解ACh，鐵筷子揮發(fā)油可通過(guò)提高ChAT活性、降低AChE活性來(lái)協(xié)調(diào)ACh的平衡，改善認(rèn)知功能的障礙。BDNF作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的一員，可通過(guò)一種特定的酪氨酸激酶受體即TrkB，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）突觸可塑性的形成和神經(jīng)元細(xì)胞的存活中發(fā)揮著有益的作用[28]。通過(guò)激動(dòng)劑或促突觸分子級(jí)聯(lián)（如蛋白激酶C-BDNF途徑）激活BDNF/TrkB信號(hào)，可改善突觸喪失和促進(jìn)神經(jīng)再生[29]。BDNF與TrkB結(jié)合后還可激活PI3K/Akt信號(hào)通路，PI3K/Akt信號(hào)通路在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)神經(jīng)元存活方面發(fā)揮著重要的作用[30-31]，Akt磷酸化后可抑制Caspase，從而抑制細(xì)胞凋亡[32]。本研究通過(guò)檢測(cè)BDNF/TrkB/PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)來(lái)探究鐵筷子揮發(fā)油改善CCH致VCI大鼠的作用機(jī)制，結(jié)果表明模型組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組均顯著降低，Caspase-3作為Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最終的執(zhí)行酶，其表達(dá)顯著提高；鐵筷子揮發(fā)油高劑量組可顯著提高模型大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平，降低Caspase3蛋白表達(dá)水平，表明鐵筷子揮發(fā)油的治療機(jī)制可能與激活BDNF/TrkB/PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，苗藥鐵筷子揮發(fā)油對(duì)CCH致VCI大鼠的認(rèn)知功能有改善作用，其作用機(jī)制與改善神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、提高腦中尼氏小體數(shù)量、抑制細(xì)胞凋亡、上調(diào)血清BDNF水平和海馬組織ChAT活性、降低海馬組織AChE活性有關(guān)，此外，還與激活BDNF/TrkB/PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。CCH作為一種低灌注狀態(tài)，其不同時(shí)間段檢測(cè)的結(jié)果也可能不同，因此若能將在不同時(shí)間段檢測(cè)其相關(guān)細(xì)胞因子的含量，將為進(jìn)一步深入研究鐵筷子揮發(fā)油的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)，也為鐵筷子揮發(fā)油在腦血管方面的應(yīng)用提供方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of volatile oil ofon vascular cognitive impairment rats induced by chronic cerebral hypoperfusion

DING Xiao-li1, 2, 3, XUE Ding-jia1, 2, DENG Wan-juan1, 2, HAN Cai-yao1, 2, LIU Xiao-long1, 2, LI Yuan1, QIAN Hai-bing1, 2

1. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China 2. Guizhou Provincial Key Laboratory of TCM Prescription and Pharmacology, Guiyang 550025, China 3. Longyan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Longyan 364030, China

To explore the effect and mechanism of volatile oil of Miao medicine Tiekuaizi () on chronic cerebral hypoperfusion (CCH)-induced vascular cognitive impairment (VCI) in rats.CCH model was established by modified bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) method, rats with successful modeling were randomly divided into model group, volatile oil ofhigh-, medium-and low-dose (80, 40, 20 mg/kg) groups and butylphthalide (63 mg/kg) group, and sham operation group was set up. Rats were given corresponding drug for 28 d , water maze test was used to test the learning and memory ability of rats in each group; Open field test and Y-maze test were used to test the autonomous activity and novelty exploration ability of rats in each group; Hematoxylin-eosin (HE) staining, Nissl staining, TUNEL staining were used to observe the changes in structure of nerve cells, Nissl bodies and number of apoptotic cells in cerebral cortex and hippocampus CA1 area of rats in each group; Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) level in serum was detected by ELISA; Colorimetric method was used to detect the activities of acetylcholinesterase (AChE) and cholineacetyltransferase (ChAT) in hippocampus of rats in each group; Western blotting was used to detect BDNF, tyrosine kinase receptor B (TrkB), phosphorylated TrkB (p-TrkB), phosphatidylin-ositol-3-kinase (PI3K), protein Kinase B (Akt), p-Akt and cysteine ??aspartate protease-3 (Caspase-3) protein expressions in hippocampus of rats in each group.Compared with model group, escape latency of rats in volatile oil ofgroup was shortened (< 0.05, 0.01), number of crossing platform and grid crossings were increased (< 0.05, 0.01), time spent in new arm was prolonged (< 0.05, 0.01), degeneration of nerve cell structure was improved, number of Nissl bodies in brain tissue was increased (< 0.05), cell apoptosis was decreased (< 0.05), BDNF level in serum and ChAT activity of in hippocampus were increased (< 0.05, 0.01), AChE activity in hippocampus was decreased (< 0.05), BDNF, TrkB, p-TrkB, PI3K and p-Akt protein expression levels in hippocampus were significantly increased (< 0.05, 0.01), Caspase-3 protein expression level was decreased (< 0.05).Miao medicine volatile oil ofcan improve CCH-induced cognitive impairment in VCI rats, and its mechanism may be related to the activation of BDNF/TrkB/PI3K/Akt signaling pathway.

volatile oil of; chronic cerebral hypoperfusion; vascular cognitive impairment; brain-derived neurotrophic factor; tyrosine kinase receptor B; PI3K/Akt signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)17 - 5389 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.015

2022-04-17

貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)-ZK[2022]一般471）；貴州省國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合外G字[2010]7012號(hào)）

丁曉麗（1996—），碩士研究生，從事中藥及民族藥的基礎(chǔ)研究與開(kāi)發(fā)。Tel: 18300850421 E-mail: 1285485794@qq.com

錢海兵，博士，教授，從事中藥及民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用研究。Tel: 13984350701 E-mail: 279753407@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]