TGF-β1、α-SMA、Smad7在中藥復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯治療肺纖維化小鼠模型中的表達(dá)研究

鄭旭旭 李麗燕 方燕 李獻(xiàn)超

肺纖維化是成纖維細(xì)胞增殖，大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集，并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的一大類肺疾病終末期改變，也就是正常的肺泡組織被損壞后，經(jīng)過異常修復(fù)導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)異常[1，2]。肺纖維化患者常伴有呼吸困難、干咳、乏力、體重減輕等臨床癥狀[3,4]，且近年來，肺纖維化患者發(fā)病率逐漸增加，并以40～50 歲男性多發(fā)[5]，這可能與吸煙、衰老、基礎(chǔ)肺功能差等因素相關(guān)[6～8]。目前肺纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是肺纖維化發(fā)生發(fā)展多的關(guān)鍵致纖維化因子，平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）是反映肺纖維化疾病進(jìn)程的常見指標(biāo)，母親信號(hào)蛋白同源物7（mothers against decapentaplegic homolog 7，Smad7）是TGF-β1的主要抑制性蛋白，對(duì)肺損傷的修復(fù)有促進(jìn)作用[9～11]。另外，中醫(yī)認(rèn)為肺纖維化屬于肺氣虛、肺寒之癥，需補(bǔ)肺益氣、健脾化痰、活血化瘀等。中藥復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯具有補(bǔ)肺健脾益腎，止咳化痰平喘、降逆止咳之功效。本次研究旨在探討經(jīng)中藥復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯治療后，肺纖維化小鼠模型TGF-β1、α-SMA及Smad7表達(dá)的變化并初步探索其可能的原因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng) 清潔級(jí)成年SD 小鼠60 只[合格證號(hào)：SCXK（浙）2020-0052]，鼠齡10 周，體質(zhì)量（190±20）g，采用籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)。標(biāo)準(zhǔn)光照，飼料喂養(yǎng)，自由攝食，室溫20 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度45%～55%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。本次研究時(shí)間為2021年12 月。

1.2 中藥復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯 組方：麻黃5 g、杏仁10 g、白術(shù)10 g、茯苓10 g、石膏30 g、玉竹10 g、石斛10 g、枇杷葉9 g、百部10 g、訶子10 g、地龍10 g、桃仁15 g、甘草5 g。全方共奏補(bǔ)肺生津、理氣止咳的功效。將上述藥物煎制、復(fù)渣，兩次藥液混合，再將其濃縮為每毫升含生藥2.925 g、5.85 g、11.7 g 的藥液，裝瓶低溫冷藏備用，應(yīng)用時(shí)以蒸餾水調(diào)配。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及構(gòu)模 將60 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為正常組，模型組，復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組，醋酸潑尼松組，每組10 只。第8 天，除正常組外，其余組小鼠腹腔注射4%水合利醛0.1 ml/10 g 麻醉，氣管內(nèi)一次性滴入博來霉素5 mg/kg建立肺纖維化模型[12]，正常組給予等量0.9%氯化鈉注射液。

小鼠造模后均予標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由攝水，正常組及模型組給予0.9%氯化鈉注射液0.1 ml/10 g灌胃，復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組給藥劑量經(jīng)人與小鼠體表面積比值折算，低劑量為2.925 g/kg，中劑量為5.85 g/kg，高劑量為11.7 g/kg，每次給予藥物體積為0.1 ml/10 g 灌胃，醋酸潑尼松組小鼠給予醋酸潑尼松5 mg/kg，各組小鼠每日給藥1 次，持續(xù)28 d，28 d后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般情況 記錄各組小鼠造模及用藥前后的一般情況：包括精神狀態(tài)、飲食情況、皮毛及體重變化等。

1.4.2 肺組織病理觀察 蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）：小鼠肺組織用4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋切片，脫蠟后蘇木精染色，水洗后用1%鹽酸酒精分化，沖洗，再脫水，透明，中性樹脂封片，鏡下觀察，圖像采集分析。Masson 染色：包埋同HE 染色，取肺組織蠟塊，脫蠟、乙醇脫水，根據(jù)Masson 試劑盒操作，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照。

1.4.3 免疫組化法觀察肺組織TGF-β1、α-SMA、Smad7 蛋白表達(dá) 各組隨機(jī)取3 只小鼠制作肺組織切片，切片脫蠟，高壓熱修復(fù)抗原，去除內(nèi)源性過氧化物酶，加一抗1∶200，4 ℃過夜，磷酸緩沖鹽溶液水洗，加二抗1∶500，37 ℃孵育30 min，沖洗。二氨基聯(lián)苯胺顯色，乙醇脫水，二甲苯透明，中樹膠封固，鏡下拍照讀片，圖片分析。

1.4.4 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）檢測TGF-β1、α-SMA、Smad7 mRNA 表達(dá) 提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR 擴(kuò)增。cDNA 合成采用20 μl 體系，實(shí)時(shí)定量PCR 采用20 μl 體系，將預(yù)混好的試劑加入8 聯(lián)管內(nèi)，封好放入儀器內(nèi)，設(shè)置反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。所用引物見表1。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀況 實(shí)驗(yàn)觀察期間，各組小鼠均存活。正常組小鼠精神狀態(tài)良好，飲食正常，皮毛有光澤，體重穩(wěn)定；模型組、復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組小鼠構(gòu)建模型后精神萎靡，進(jìn)食減少，皮毛黯淡無光，體重降低；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組用藥后精神逐漸恢復(fù)，進(jìn)食量逐漸增加，皮毛光澤度增加，體重也逐漸上升，與正常組小鼠基本相同。

2.2 肺組織病理觀察見封二圖1、圖2

圖1 各組小鼠肺組織病理圖（HE染色，×200倍）

圖2 各組小鼠肺組織病理圖（Masson染色，×200倍）

由封二圖1、2 可見，構(gòu)建肺纖維化模型后，小鼠肺組織中可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，給予復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量及醋酸潑尼松治療后，肺組織形態(tài)改善，肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤減少，纖維化程度逐漸緩解，與模型組比較差異顯著，且復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯高劑量組及醋酸潑尼松組改變較復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中劑量組更為明顯。

2.3 各組肺組織TGF-β1、α-SMA、Smad7 蛋白免疫組化見表2

表2 各組肺組織TGF-β1、α-SMA、Smad7蛋白陽性率比較/%

由表2 可見，各組間肺組織TGF-β1、α-SMA、Smad7 蛋白陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=119.045、72.426、60.147，P均＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，正常組TGF-β1 蛋白陽性率與模型組及復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=16.88、13.49、9.93，P均＜0.05）；模型組TGF-β1 蛋白陽性率與復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=5.11、9.29、15.15、15.02，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低劑量組TGF-β1 蛋白陽性率與中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=4.51、11.39、11.23，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯中劑量組TGF-β1 蛋白陽性率與高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=7.58、7.38，P均＜0.05），呈劑量依賴性。

正常組α-SMA 蛋白陽性率與模型組及復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=13.89、10.23、4.42，P均＜0.05）；模型組α-SMA 蛋白陽性率與復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分 別=3.74、7.93、12.91、13.13，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低劑量組α-SMA 蛋白陽性率與中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=4.45、9.22、9.45，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯中劑量組α-SMA 蛋白陽性率與高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=3.61、3.82，P均＜0.05），呈劑量依賴性。

正常組Smad7 蛋白陽性率與模型組及復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=-11.33、8.68、6.52，P均＜0.05）；模型組Smad7 蛋白陽性率與復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=4.42、8.92、14.78、12.67，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低劑量組Smad7 蛋白陽性率與中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=-3.86、10.40、9.44，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯中劑量組Smad7 蛋白陽性率與高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=-7.32、6.94，P均＜0.05）。

2.4 各組肺組織TGF-β1、α-SMA、Smad7 mRNA 表達(dá)比較見表3

表3 各組肺組織TGF-β1、α-SMA、Smad7 mRNA表達(dá)比較

由表3 可見，各組間肺組織TGF-β1、α-SMA、Smad7 mRNA 表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=249.82、177.16、466.39，P均＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，正常組TGF-β1 mRNA 與模型組及復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=22.52、16.47、14.74，P均＜0.05）；模型組TGF-β1 mRNA 與復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分 別=8.42、13.79、21.50、21.28，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低劑量組TGF-β1 mRNA 與中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=5.51、15.11、14.88，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯中劑量組TGF-β1 mRNA 與高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=12.81、12.30，P均＜0.05），呈劑量依賴性。正常組α-SMA mRNA 與模型組及復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=20.00、13.08、8.80，P均＜0.05）；模型組α-SMA mRNA 與復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分 別=8.14、12.77、18.79、19.88，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低劑量組α-SMA mRNA與中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=4.85、11.73、12.76，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯中劑量組α-SMA mRNA與高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=7.38、8.21，P均＜0.05），呈劑量依賴性。正常組Smad7 mRNA 與模型組及復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=-38.59、25.24、12.54，P均＜0.05）；模型組Smad7 mRNA 與復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=11.64、17.19、58.24、47.95，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低劑量組Smad7 mRNA 與中、高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=8.47、31.73、28.74，P均＜0.05）；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯中劑量組Smad7 mRNA 與高劑量組、醋酸潑尼松組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t分別=13.52、13.11，P均＜0.05）。

3 討論

肺纖維化是臨床常見的慢性、進(jìn)行性肺間質(zhì)疾病，具有較高的致死性，最終會(huì)引起肺組織的結(jié)構(gòu)損壞[13]。目前，臨床尚未明確肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，且未有治療該病的特效藥物，這給臨床肺纖維化的防治帶來巨大挑戰(zhàn)。中醫(yī)上，肺纖維化屬于“肺痿”范疇，肺纖維化的發(fā)病原因與心腎陽虛密切相關(guān)，而血瘀阻滯也貫穿肺纖維化發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程[14]。也有研究指出，肺虛是肺纖維化產(chǎn)生的病源，同時(shí)患者會(huì)有痰液、瘀血產(chǎn)生[15，16]。由此可見，“氣虛血瘀”為其重要的病機(jī)，中醫(yī)認(rèn)為可嘗試以益氣活血為基本法則進(jìn)行治療。中藥復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯中麻黃、杏仁理氣宣肺；白術(shù)、茯苓健脾補(bǔ)肺；石膏、玉竹、石斛清肺潤燥；枇杷葉、百部、訶子收澀止咳；地龍祛風(fēng)通絡(luò)；桃仁活血祛瘀；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏補(bǔ)肺生津、理氣止咳的功效。本研究旨在探討經(jīng)中藥復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯治療后，肺纖維化小鼠模型TGF-β1、α-SMA 及Smad7 表達(dá)的變化并初步探索其可能的原因。

本研究通過對(duì)小鼠氣管內(nèi)一次性滴入博來霉素構(gòu)建肺纖維化模型，觀察小鼠一般情況發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠精神狀態(tài)良好，飲食、進(jìn)水正常，皮毛有光澤，體重恒定無明顯變化；而模型組、復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組，醋酸潑尼松組小鼠構(gòu)建模型后精神萎靡，進(jìn)食、飲水減少，皮毛黯淡無光，體重降低；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量組，醋酸潑尼松組用藥后精神逐漸恢復(fù)，進(jìn)食、飲水量逐漸增加，皮毛光澤度逐漸恢復(fù)，體重也穩(wěn)步增加，其中復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯高劑量組、醋酸潑尼松組與正常組小鼠基本相同。實(shí)驗(yàn)中通過HE 染色及Masson 染色來觀察肺組織，研究發(fā)現(xiàn)，模型組較正常組出現(xiàn)了明顯的肺組織及肺泡結(jié)構(gòu)破損、炎癥細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞聚集以及藍(lán)色膠原纖維堆積，這表明了博來霉素可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的肺纖維化病理特征，經(jīng)復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯低、中、高劑量及醋酸潑尼松治療后，肺泡結(jié)構(gòu)有不同程度的改善，肺泡間質(zhì)增厚減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，藍(lán)色膠原纖維堆積減少，并且各組中復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯高劑量組及醋酸潑尼松組改變最為明顯，這證實(shí)復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯對(duì)肺纖維化具有較好的治療效果，能夠改善肺纖維化病理損傷，減輕肺組織炎癥反應(yīng)。

臨床上認(rèn)為TGF-β1 是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的重要細(xì)胞因子，它在肺纖維化的進(jìn)展過程中占據(jù)重要地位，能夠促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生并到特定位置，從而對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，使得上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生[17]，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是肺纖維化發(fā)病的重要原因，而α-SMA 增高是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的形成的標(biāo)志[18，19]。Smad7 是TGF-β1 信號(hào)通路的抑制因子，能阻止Smad2/3 發(fā)生磷酸化，負(fù)性調(diào)控TGF-β1/Smad 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]。本研究通過免疫組化及RT-qPCR 法檢測TGF-β1、α-SMA、Smad7 蛋白及mRNA 表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組TGF-β1、α-SMA 蛋白及mRNA 表達(dá)升高，Smad7 蛋白及mRNA 表達(dá)降低。經(jīng)復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯干預(yù)后，TGF-β1、α-SMA 蛋白及mRNA 表達(dá)降低，Smad7 蛋白及mRNA 表達(dá)增加，復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯高劑量組TGF-β1、α-SMA 蛋白及mRNA 表達(dá)低于中劑量組，中劑量組TGF-β1、α-SMA 蛋白及mRNA 表達(dá)低于低劑量組；復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯高劑量組Smad7 蛋白及mRNA 表達(dá)高于中劑量組，中劑量組Smad7 蛋白及mRNA 表達(dá)高于低劑量組，證實(shí)復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯呈現(xiàn)劑量依賴性，其中高劑量組各指標(biāo)水平最接近正常組及醋酸潑尼松組。

綜上所述，復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯能夠改善肺纖維化，減輕炎癥反應(yīng)，這可能是通過調(diào)節(jié)控制TGF-β1、α-SMA、Smad7 表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。本研究僅在小鼠體內(nèi)進(jìn)行研究，在人體內(nèi)是否有同樣效果還需進(jìn)一步探索，另外關(guān)于其具體的機(jī)制通路還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。