響應(yīng)面法優(yōu)化椰蓉飼料發(fā)酵工藝及品質(zhì)評(píng)定

■吳軍龍 張曉夢(mèng) 王閆宇 張海文 李笑春 王學(xué)梅* 曹春雷

（1.海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，海南?？?570228；2.廣西科勝生物科技有限公司，廣西崇左 532200）

近年來，玉米、豆粕等飼料資源緊缺并且價(jià)格上漲[1]，粗飼料等非常規(guī)飼料資源的開發(fā)得到越來越多的關(guān)注。飼料資源受到制約從而影響畜牧業(yè)發(fā)展，微生物發(fā)酵飼料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展是解決飼料短缺的重要途徑之一[2]，同時(shí)也使得地源性資源成為研究的熱點(diǎn)[3]。椰蓉（coconut residue, CR）是椰肉經(jīng)榨汁后剩余的部分，含有脂肪、蛋白質(zhì)及大量的纖維素，椰蓉中油脂是一種植物性飽和油脂，其含有80%飽和脂肪酸以及20%不飽和脂肪酸[4]，其中月桂酸含量為60%[5]，己酸、辛酸、癸酸含量不超過20%，是制備低碳脂肪酸的原料來源之一[6]。椰子是海南特色熱帶木本油料作物，2017年椰子產(chǎn)量高達(dá)到2.33億個(gè)以上，而椰蓉作為一種食品加工副產(chǎn)物，具有很大的飼料開發(fā)應(yīng)用潛力和很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但因新鮮椰蓉水分和脂肪含量高，一般為干物質(zhì)的30%左右，有的甚至更高（因椰子來源不同而有差異），不易保存，容易氧化酸敗，因此如何延長(zhǎng)椰蓉保存期、避免氧化酸敗成為椰蓉利用考慮的重點(diǎn)。

發(fā)酵飼料是在人為可控制的條件下，利用微生物通過發(fā)酵降解部分多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等大分子，生成有機(jī)酸、可溶性多肽等小分子物質(zhì)[7-8]，形成營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好、活菌含量高的生物飼料，其有效成分包括菌體蛋白、酶類、生物活性小肽類、氨基酸、有機(jī)酸、活性益生菌等。發(fā)酵處理不僅可以通過降低抗?fàn)I養(yǎng)因子和分解毒素等來改善飼料品質(zhì)、提高飼料的消化利用率、延長(zhǎng)飼料保存期，還能通過調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)的微生態(tài)平衡，達(dá)到促生長(zhǎng)、抗腹瀉、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[8-9]。發(fā)酵品質(zhì)的優(yōu)劣受菌種、發(fā)酵底物、發(fā)酵溫度、水分、溶氧量等及發(fā)酵工藝等多種因素的影響。

本試驗(yàn)以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BS）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）為發(fā)酵菌種，椰蓉和豆粕作為發(fā)酵底物，采用兩步固態(tài)發(fā)酵方式，即先利用釀酒酵母和枯草芽孢桿菌復(fù)合菌種進(jìn)行有氧發(fā)酵，再加入植物乳桿菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵，通過中心組合設(shè)計(jì)（Box-Behnken Design，BBD）優(yōu)化發(fā)酵條件，以提高椰蓉發(fā)酵飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善其感官品質(zhì)，并能夠達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間保存椰蓉、更好地作為飼料原料利用的目的。該研究可為海南椰蓉生產(chǎn)高品質(zhì)畜禽飼料的開發(fā)與利用提供參考，為海南地源性飼料的研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 椰蓉、菌種

椰蓉購(gòu)于海南某椰子加工廠，豆粕購(gòu)于海南省?？谑屑Z油市場(chǎng)。釀酒酵母、植物乳桿菌使用海南大學(xué)熱帶動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室分離的菌株?？莶菅挎邨U菌由海南大學(xué)熱帶動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 藥品與試劑

枯草芽孢桿菌：選用LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃，150 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h，活菌數(shù)達(dá)到約1.93×108CFU/mL，備用。

釀酒酵母菌：選用酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD 液體培養(yǎng)基），置于28 ℃，恒溫250 r/min 搖床，培養(yǎng)12 h，活菌數(shù)達(dá)到約1.93×108CFU/mL，備用。

植物乳桿菌：選用乳酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基（MRS 液體培養(yǎng)基），置于37 ℃，厭氧、靜置培養(yǎng)12 h，活菌數(shù)達(dá)到約2.7×109CFU/mL，備用。

1.2 方法

1.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Design Exper 8.0 軟件進(jìn)行Box-Behnken Design（BBD）對(duì)微生物發(fā)酵椰蓉的影響顯著因子進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合因素效應(yīng)和試驗(yàn)中的實(shí)際情況。各因素及水平見表1和表2。

表1 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

表2 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2 發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過表1 的BBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置17 個(gè)處理（見表2）。椰蓉和豆粕配比為1∶1，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2 個(gè)平行。采用兩步固態(tài)發(fā)酵方式，先利用釀酒酵母和枯草芽孢桿菌復(fù)合菌進(jìn)行有氧發(fā)酵3、5 d，再加入植物乳桿菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵5、10、15 d，在有氧發(fā)酵階段每2 h翻動(dòng)1次底物，見表3。

表3 發(fā)酵條件試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 感官評(píng)定方法及標(biāo)準(zhǔn)

參照GB/T 10220—2012感官分析方法學(xué)總論[10]、GB/T 21172—2007 感官分析食品顏色評(píng)價(jià)的總則和檢驗(yàn)方法[11]，并結(jié)合椰蓉發(fā)酵的預(yù)試驗(yàn)制定了發(fā)酵椰蓉飼料感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，如表4所示。

1.3.2 常規(guī)養(yǎng)分

參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[12]，測(cè)定粗蛋白（CP，采用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定）、粗灰分（CA，采用灰化法進(jìn)行測(cè)定）、粗脂肪（EE，采用粗脂肪測(cè)定儀測(cè)定）、粗纖維（CF，采用纖維儀測(cè)定）、中性洗滌纖維（NDF，采用纖維儀測(cè)定）、酸性洗滌纖維（ADF，采用纖維儀測(cè)定）、總能（GE，采用氧彈量熱儀測(cè)定）、水分及干物質(zhì)（DM，采用烘箱干燥法測(cè)定）含量。

1.3.3 pH

取10 g 的發(fā)酵飼料樣品放入裝有90 mL 無菌水的錐形瓶中，攪拌均勻，置于4 ℃冰箱冷藏過夜，用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 飼料衛(wèi)生指標(biāo)

參照GB 13078—2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[13]。發(fā)酵飼料中大腸桿菌用麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)。發(fā)酵飼料中沙門氏菌用SS培養(yǎng)基培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)。發(fā)酵黃曲霉毒素B1采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒（江蘇科特生物科技有限公司），按說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)首先采用Excel 2010進(jìn)行初步整理，利用SAS 9.2 軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料的營(yíng)養(yǎng)成分分析及pH（見表5）

發(fā)酵前椰蓉、豆粕及椰蓉與豆粕混合物的常規(guī)養(yǎng)分和pH測(cè)定結(jié)果見表5。為后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)提供參考。

2.2 發(fā)酵飼料的品質(zhì)評(píng)定

2.2.1 發(fā)酵飼料感官品質(zhì)評(píng)定（見表6）

由表6可知，通過顏色、氣味、質(zhì)地等感官指標(biāo)對(duì)椰蓉發(fā)酵飼料品質(zhì)進(jìn)行評(píng)定，結(jié)果顯示在有氧發(fā)酵階段發(fā)酵飼料顏色和質(zhì)地方面沒有明顯差異，但是在氣味上差異明顯，處理1最好，其次是處理13，綜合顏色、氣味和質(zhì)地判斷有氧發(fā)酵3 d的飼料品質(zhì)整體優(yōu)于有氧發(fā)酵5 d。在厭氧發(fā)酵階段發(fā)酵飼料顏色變化不大，評(píng)分均在良好以上，綜合氣味和質(zhì)地以發(fā)酵10 d為最佳。從整個(gè)發(fā)酵期的感官評(píng)分來看，均沒有粘連和結(jié)塊等現(xiàn)象出現(xiàn)，綜合評(píng)分仍以處理1和處理13為最優(yōu)。

表6 發(fā)酵飼料感官評(píng)定的結(jié)果

2.2.2 發(fā)酵飼料常規(guī)養(yǎng)分及pH（見表7、表8）

在感官評(píng)分結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)有氧發(fā)酵3 d 和厭氧發(fā)酵10 d的飼料進(jìn)行常規(guī)養(yǎng)分及pH的檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果見表7 和表8。椰蓉與豆粕混合物經(jīng)過發(fā)酵，其水分、粗蛋白、粗脂肪及pH各組間存在不同程度的差異。

有氧發(fā)酵3 d，發(fā)酵飼料中粗蛋白水平處理1 組最高，且與處理2、3、4、11 和處理14 差異不顯著（P＞0.05），與其他組間差異顯著（P＜0.05）；處理12顯著低于其他處理組（P＜0.05），處理6、8、17 間差異不顯著（P＞0.05），但與其他處理差異顯著（P＜0.05）。在有氧發(fā)酵3 d的基礎(chǔ)上再持續(xù)厭氧發(fā)酵10 d后，處理13的粗蛋白水平最高，且與處理1、2、3、5 差異不顯著（P＞0.05），與其他處理組差異顯著（P＜0.05）；處理9、11、12 粗蛋白水平較低，且三者之間差異不顯著（P＞0.05），與其他處理組差異顯著（P＜0.05）。

由表7 和表8 可知，對(duì)于發(fā)酵飼料pH 來說，有氧發(fā)酵3 d 處理6 的pH 最高，與處理1、7、13、16 差異顯著（P＜0.05），與其他處理組差異不顯著（P＜0.05）。在有氧發(fā)酵3 d 的基礎(chǔ)上再持續(xù)厭氧發(fā)酵10 d 后處理1、13的pH顯著低于其他處理組（P＜0.05）。

表7 有氧發(fā)酵3 d椰蓉發(fā)酵飼料常規(guī)養(yǎng)分及pH

表8 有氧發(fā)酵3 d再持續(xù)厭氧發(fā)酵10 d椰蓉發(fā)酵飼料常規(guī)養(yǎng)分及pH

有氧發(fā)酵3 d，處理1、5、6、13、15、17間粗脂肪水平差異不顯著（P＞0.05），而處理6、13、17 粗脂肪含量顯著高于其他處理組（P＜0.05）；在有氧發(fā)酵3 d 的基礎(chǔ)上再持續(xù)厭氧發(fā)酵10 d后處理4、17粗脂肪含量顯著低于其他處理組（P＜0.05），二者間差異也顯著（P＜0.05）；處理2 與處理1、5、7、10、14、16 間差異不顯著（P＞0.05），與其他處理差異顯著（P＜0.05）。

由表7和表8可知，有氧發(fā)酵3 d后處理6、12、17中水分含量顯著低于其他處理組（P＜0.05），但3 組間差異不顯著（P＞0.05）；處理4、5、7、8、10、14、16間差異不顯著（P＞0.05），與處理1、2、3、9、11、13、15差異顯著（P＜0.05）。在有氧發(fā)酵3 d的基礎(chǔ)上再持續(xù)厭氧發(fā)酵10 d后，各處理水分含量變異加大，處理13水分含量最高且與其他處理組差異顯著（P＜0.05），處理7、12、14、16間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 衛(wèi)生指標(biāo)（見表9和表10）

表9 沙門氏菌和大腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果

由表9和表10可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中均未檢測(cè)出沙門氏菌和大腸桿菌。國(guó)家關(guān)于豆粕黃曲霉毒素B1的含量最高限量為30 μg/kg，本試驗(yàn)中各處理組發(fā)酵椰蓉黃曲霉毒素含量均未超標(biāo)。

表10 黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫檢測(cè)結(jié)果（μg/kg）

2.2.4 椰蓉發(fā)酵飼料粗蛋白的Box-Behnken Design結(jié)果

2.2.4.1 粗蛋白二元回歸方程的方差分析結(jié)果（見表11～表13）

表11 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

經(jīng)回歸擬合后，得到以粗蛋白（Y1）為響應(yīng)值的回歸方程。

Y1=33.12+0.28A-1.40B-0.55C-0.95AB-3.91AC-1.54BC-2.83A2+0.021B2-0.82C2

由表12可知，模型的P＜0.05，表明該模型二次方顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.060 2），表明了模型中并沒有異常數(shù)據(jù)。從表13 可知，回歸方程復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.902 5，校正相關(guān)系數(shù)為0.777 3，變異系數(shù)為4.53%，信噪比為8.651，說明該回歸方程擬合程度良好。各因素對(duì)粗蛋白影響大小順序：水分含量＞菌種比＞菌種添加量。通過對(duì)回歸方程的方差分析得出：一次項(xiàng)B顯著（P＜0.05），A、C不顯著（P＞0.05），二次項(xiàng)A2極顯著（P＜0.01），B2、C2不顯著（P＞0.05），交互項(xiàng)AC極顯著（P＜0.01），AB、BC不顯著（P＞0.05），說明該回歸方程能夠很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。

表12 粗蛋白二元回歸方程的各項(xiàng)方差分析結(jié)果

表13 粗蛋白方差分析結(jié)果

2.2.4.2 椰蓉發(fā)酵飼料的粗蛋白最優(yōu)條件確定和模型驗(yàn)證（見圖1～圖3）

為了對(duì)粗蛋白結(jié)果有一個(gè)更加直觀的理解，基于二次回歸模型繪出影響飼料粗蛋白的等高線和三維圖，三維圖中出現(xiàn)橢圓意味著兩個(gè)變量之間具有較強(qiáng)的相互作用，說明各因素之間相互作用較大，三維圖中出現(xiàn)圓形意味著兩個(gè)變量之間相互作用不顯著，說明各因素之間相互作用不大。

由圖1可知，當(dāng)菌種比為代碼0時(shí)，隨著菌種添加量的增加，粗蛋白先升高后有所降低，隨著水分含量的增加，粗蛋白出現(xiàn)小幅度的降低，基本保持穩(wěn)定。

圖1 菌種添加量和水分含量交互作用對(duì)粗蛋白影響的響應(yīng)面和等高線

由圖2可知，當(dāng)水分含量為代碼0的時(shí)候，隨著菌種比的增加，粗蛋白也隨之增加。隨著菌種添加量的增加，粗蛋白隨之增加。

圖2 菌種添加量和菌種比交互作用對(duì)粗蛋白影響的響應(yīng)面和等高線

由圖3可知，當(dāng)菌種添加量為代碼0時(shí)，隨著菌種比的增加，粗蛋白也增加。隨著水分含量的增加，粗蛋白隨之增加。

圖3 水分含量和菌種比交互作用對(duì)粗蛋白影響的響應(yīng)面和等高線

2.2.5 椰蓉發(fā)酵飼料粗脂肪的Box-Behnken Design結(jié)果

2.2.5.1 粗脂肪二元回歸方程的方差分析結(jié)果（見表14、表15）

經(jīng)回歸擬合后，得到以粗脂肪（Y2）為響應(yīng)值的回歸方程。

Y2=28.52+0.16A-0.2B-0.51C-0.44AB+0.37AC-1.00BC+0.32A2+0.72B2-0.49C2

由表14和表15可知，模型的P＜0.01，表明該模型二次方極顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.320 0），表明了模型中并沒有異常數(shù)據(jù)，從表15可知，回歸方程復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.924 5，校正相關(guān)系數(shù)為0.827 5，變異系數(shù)為1.28%，信噪比為12.088，說明該回歸方程擬合程度良好。各因素對(duì)粗脂肪的影響大小順序：菌種比＞水分含量＞菌種添加量。通過對(duì)回歸方程的方差分析得出：一次項(xiàng)C極顯著（P＜0.01），A、B不顯著，二次項(xiàng)B2極顯著（P＜0.01），C2顯著（P＜0.05），A2不顯著（P＞0.05），交互項(xiàng)AB顯著（P＜0.05），BC極顯著（P＜0.01），AC不顯著（P＞0.05），說明該回歸方程能很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。

表14 粗脂肪二元回歸方程的方差分析結(jié)果

表15 粗脂肪方差分析結(jié)果

2.2.5.2 椰蓉發(fā)酵飼料的粗脂肪最優(yōu)條件確定和模型驗(yàn)證（見圖4～圖6）

圖4 菌種添加量和水分含量交互作用對(duì)粗脂肪影響的響應(yīng)面和等高線

圖6 水分含量和菌種比交互作用對(duì)粗脂肪影響的響應(yīng)面和等高線

為了對(duì)粗脂肪結(jié)果有一個(gè)更加直觀的理解，基于二次回歸模型繪出影響飼料粗脂肪的等高線和三維圖。

由圖4可知，當(dāng)菌種比為代碼0時(shí)，粗脂肪隨著水分含量的增加出現(xiàn)先小幅度降低后增加，粗脂肪隨著菌種添加量的增加而增加，等高線圖為橢圓，說明菌種添加量和水分含量互作顯著。

由圖5可知，當(dāng)水分含量為代碼0時(shí)，粗脂肪隨著菌種比例的升高而降低。隨著菌種添加量的增加，粗脂肪減少趨勢(shì)平緩不明顯，有小幅度的減少。

圖5 菌種添加量和菌種比交互作用對(duì)粗脂肪影響的響應(yīng)面和等高線

由圖6可知，當(dāng)菌種添加量為代碼0時(shí)，隨著菌種比的增加，粗脂肪也隨之增加。隨著水分比例的升高，粗脂肪也隨著升高。

根據(jù)軟件Design-Expert 對(duì)椰蓉發(fā)酵飼料中的粗蛋白和粗脂肪的模型計(jì)算，選取模型中最優(yōu)發(fā)酵條件，得出最佳菌種添加量為代碼0.69，水分比例為代碼-1，菌種比例為代碼0.08，在此條件下粗蛋白含量為33.90%，粗脂肪含量為30.10%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面方法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行椰蓉飼料發(fā)酵，并考慮實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的不同條件下能耗的問題，將發(fā)酵工藝修正為：菌種添加量為代碼1，水分含量為代碼-1，菌種比為代碼0，在此條件下重復(fù)3 次，實(shí)際測(cè)得粗蛋白含量為35.25%，粗脂肪含量為31.56%。因此，響應(yīng)面模型所得的優(yōu)化椰蓉發(fā)酵飼料工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有較好的生產(chǎn)與應(yīng)用。

3 討論

3.1 發(fā)酵椰蓉飼料感官評(píng)定

本試驗(yàn)整個(gè)發(fā)酵過程，采用兩步固態(tài)發(fā)酵，即先利用釀酒酵母與枯草芽孢桿菌復(fù)合菌對(duì)發(fā)酵底物進(jìn)行有氧發(fā)酵，然后在此基礎(chǔ)上加入植物乳桿菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵。從顏色、氣味和質(zhì)地等感官指標(biāo)評(píng)定，前期有氧發(fā)酵3 d整體優(yōu)于有氧發(fā)酵5 d的處理；繼續(xù)厭氧發(fā)酵10 d優(yōu)于繼續(xù)厭氧發(fā)酵5 d和15 d的處理。發(fā)酵時(shí)間是影響發(fā)酵品質(zhì)的重要因素，有研究表明適宜的發(fā)酵時(shí)間不僅能夠很好地消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子[14]，也不會(huì)因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致底物大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗、菌種生長(zhǎng)過慢，并出現(xiàn)自溶現(xiàn)象[15]?；蛞虬l(fā)酵時(shí)間不足而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)率降低[16]，控制適宜的發(fā)酵時(shí)間既能保證發(fā)酵底物與菌體間的充分作用，又能避免發(fā)酵成本高的問題。綜合本試驗(yàn)感官評(píng)定結(jié)果可知，有氧發(fā)酵3 d，再繼續(xù)厭氧發(fā)酵10 d，發(fā)酵產(chǎn)物感官評(píng)價(jià)達(dá)到優(yōu)。

3.2 發(fā)酵椰蓉飼料衛(wèi)生指標(biāo)及pH

本試驗(yàn)中無論有氧還是厭氧對(duì)發(fā)酵飼料pH都有顯著影響。pH是評(píng)價(jià)發(fā)酵過程的重要指標(biāo)[17]。pH升高的原因可能是因?yàn)檠挎邨U菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生蛋白酶，降解發(fā)酵底物中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生胺類物質(zhì)，甚至產(chǎn)生一些氨等物質(zhì)使得產(chǎn)物pH 升高[18]，pH 降低的原因是乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生一些乳酸、乙酸等有機(jī)酸使發(fā)酵產(chǎn)物pH 降低[19]。改善飼料品質(zhì)，可提高飼料適口性、風(fēng)味和消化率[20]。同時(shí)，還能有效抑制致病菌生長(zhǎng)，保證飼料的安全性，但是從椰蓉原料脂肪含量高的這一特點(diǎn)來說，既要有適當(dāng)?shù)娜樗岱e累，又要控制好酸度，酸度不能過低，否則會(huì)導(dǎo)致脂肪酸敗，發(fā)酵品質(zhì)下降。發(fā)酵條件控制得好壞是控制發(fā)酵飼料致病菌、毒素含量的關(guān)鍵，衛(wèi)生指標(biāo)也是評(píng)價(jià)發(fā)酵飼料品質(zhì)的重要參考，本試驗(yàn)沒有檢測(cè)出沙門氏菌、大腸桿菌，并且黃曲霉毒素B1含量也符合國(guó)標(biāo)要求。

3.3 水分對(duì)發(fā)酵椰蓉飼料品質(zhì)的影響

發(fā)酵飼料最終的水分由底物原有的部分水、微生物代謝產(chǎn)生的水及發(fā)酵條件要求額外添加的水分構(gòu)成。發(fā)酵底物水分含量是固態(tài)發(fā)酵成功與否的重要影響因素，水分含量過高影響耗氧微生物對(duì)空氣的利用，但是能夠增加菌體的生長(zhǎng)，使得營(yíng)養(yǎng)成分也增加[21]。如發(fā)酵底物的含水量過低，菌體生長(zhǎng)受到抑制，使得耗氧微生物分解抗?fàn)I養(yǎng)因子受到阻礙，導(dǎo)致產(chǎn)生活性酶能力降低。林標(biāo)聲等[22]在飼料中添加復(fù)合發(fā)酵菌劑（酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌）進(jìn)行常規(guī)飼料的密封發(fā)酵，研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵底物的含水量越高，微生物生長(zhǎng)越快，發(fā)酵效果越好，選定最適含水量為34%～36%，既能保證微生物的快速生長(zhǎng)，又能降低生產(chǎn)操作成本。本試驗(yàn)綜合各項(xiàng)指標(biāo)可知，采用復(fù)合菌種發(fā)酵椰蓉飼料的最佳含水量為36%～40%，這與前人研究結(jié)果一致[23-24]。

3.4 菌種比對(duì)發(fā)酵飼料影響

微生物-微生物的相互作用是復(fù)雜的，但被認(rèn)為是獲得所需產(chǎn)品特性的關(guān)鍵[25-26]。本試驗(yàn)在3種菌互作下，使發(fā)酵飼料具有濃郁的椰香味、醇香味及淡淡的酸香味，提高了椰蓉的風(fēng)味。史玉寧等[27]利用啤酒酵母菌和乳酸菌為復(fù)合菌株發(fā)酵豆粕發(fā)現(xiàn)，接種量為10%，含水量為38%，啤酒酵母菌∶乳酸菌=2∶1，粗蛋白含量提高12.27%，發(fā)酵豆粕中的不良影響因子大大降低，動(dòng)物適口性提高，有利于動(dòng)物的消化與利用。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)菌種添加比為（釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌）∶植物乳桿菌為（2∶2）∶1 和（2∶3）∶1時(shí)，椰蓉發(fā)酵飼料的蛋白質(zhì)水平提高，pH 下降，風(fēng)味得到改善，本試驗(yàn)研究與徐力等[28]研究一致。添加復(fù)合菌種能夠?qū)l(fā)酵底物中的大分子蛋白質(zhì)分解成小分子蛋白質(zhì)或者活性肽[29]。對(duì)豆粕的研究表明[30-31]，經(jīng)過復(fù)合微生物發(fā)酵處理過的豆粕，能夠降解發(fā)酵底物中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，還可以分解成利于動(dòng)物消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性因子。乳酸菌和其他優(yōu)勢(shì)菌株的大量繁殖，一些細(xì)菌分泌具有脂肪酶活性的物質(zhì)，使脂肪緩慢分解及發(fā)生氧化作用，生成與醛、酮、醇及短鏈脂肪酸等物質(zhì)[32-34]，其揮發(fā)會(huì)導(dǎo)致總脂肪相對(duì)含量降低。發(fā)酵過程是菌種種類、比例、發(fā)酵條件、發(fā)酵底物特性等多因素綜合作用的結(jié)果。

綜上所述，發(fā)酵過程為有氧發(fā)酵3 d、厭氧發(fā)酵10 d，水分含量為36%、菌種添加量為10%、菌種比為：酵母菌∶枯草芽孢桿菌∶植物乳桿菌為（2∶2）∶1和水分含量為40%、菌種添加量為8%、酵母菌∶枯草芽孢桿菌∶植物乳桿菌為（2∶3）∶1，得到具有濃郁的椰香味、醇香味及淡淡的酸香味，顏色接近原料，質(zhì)地松散的高品質(zhì)發(fā)酵飼料。選取粗蛋白和粗脂肪作為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合菌種發(fā)酵椰蓉飼料的工藝進(jìn)行優(yōu)化，可知最佳優(yōu)化發(fā)酵條件為有氧發(fā)酵3 d同時(shí)厭氧發(fā)酵10 d，菌種添加量10%，水分含量為36%，菌種比為釀酒酵母菌∶枯草芽孢桿菌∶植物乳桿菌為（2∶2）∶1，該工藝下得到發(fā)酵椰蓉粗蛋白含量為35.25%，粗脂肪含量為31.56%。

4 結(jié)論

綜合感官、常規(guī)養(yǎng)分水平、pH、響應(yīng)面分析結(jié)果及生產(chǎn)實(shí)踐，推薦椰蓉與豆粕混合發(fā)酵工藝為水分含量為36%、菌種添加量為10%、菌種比為酵母菌∶枯草芽孢桿菌∶植物乳桿菌為（2∶2）∶1，經(jīng)過有氧發(fā)酵3 d，厭氧發(fā)酵10 d 所優(yōu)化得到的椰蓉發(fā)酵飼料工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有良好的實(shí)際生產(chǎn)與應(yīng)用價(jià)值。