頂空氣相色譜法測定阿尼芬凈關(guān)鍵原料對戊氧基三聯(lián)苯甲酸中的殘留溶劑

安蘭蘭，張 晴，仲偉潭，祝仕清，李 敏，馬 巖

(華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050000)

阿尼芬凈(Anidulafungin)是第三代棘白霉素類半合成抗真菌藥，由美國Vicuron制藥公司研制，于2006年在美國上市[1]。阿尼芬凈的獨(dú)特結(jié)構(gòu)(圖1)使其較其它棘白霉素類抗真菌藥具有更大的分布容積和更廣譜的抗菌活性。阿尼芬凈不經(jīng)肝代謝和腎消除，用藥安全，耐受性好，在臨床上具有良好的應(yīng)用前景[1-3]。

圖1 阿尼芬凈的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of Anidulafungin

對戊氧基三聯(lián)苯甲酸(圖2)是合成阿尼芬凈的關(guān)鍵起始原料，其合成工藝[4]中需使用正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、二甲苯(對二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯)、二甲基亞砜、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑。根據(jù)《化學(xué)藥物殘留溶劑研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》，應(yīng)對對戊氧基三聯(lián)苯甲酸中有機(jī)溶劑殘留量進(jìn)行檢測與控制。鑒于此，作者根據(jù)ICH Q3C(R8)、《中華人民共和國藥典》通則[5]及相關(guān)文獻(xiàn)[6-10]建立測定對戊氧基三聯(lián)苯甲酸中殘留溶劑的頂空氣相色譜法(headspace gas chromatography，HS-GC)，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

圖2 對戊氧基三聯(lián)苯甲酸的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formula of p-pentyloxytribenzoic acid

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

對戊氧基三聯(lián)苯甲酸，天津狄克特公司；1-羥基苯并三氮唑(HOBT)，純度99.0%，蘇州昊帆公司；四氫呋喃對照品(分析純)，純度99.0%，天津瑞金特化學(xué)品有限公司；乙酸乙酯對照品(分析純)，純度99.5%，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；正己烷對照品、二甲基亞砜對照品均為色譜純，純度99.5%，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙基苯對照品、對二甲苯對照品、鄰二甲苯對照品、間二甲苯對照品均為色譜純，純度99.5%，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；吡咯烷酮(色譜純)。

7890A型氣相色譜儀、7697型頂空進(jìn)樣器(氫火焰離子化檢測器，F(xiàn)ID)，Agilent公司；LabSolutions色譜工作站，日本島津公司；XA205型電子天平(精密度十萬分之一)，瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 溶液的配制

空白溶液：精密稱取HOBT 0.094 g，置于20 mL頂空瓶中，加入吡咯烷酮5 mL，壓蓋密封。

混合對照溶液：分別精密稱取適量正己烷對照品、四氫呋喃對照品、乙基苯對照品、對二甲苯對照品、鄰二甲苯對照品，以吡咯烷酮制成含正己烷2.42 mg·mL-1、四氫呋喃6.00 mg·mL-1、乙基苯3.07 mg·mL-1、對二甲苯2.53 mg·mL-1、鄰二甲苯1.63 mg·mL-1的混合溶液；分別精密稱取適量乙酸乙酯對照品和二甲基亞砜對照品，加入適量混合溶液，以吡咯烷酮制成含正己烷145 μg·mL-1、乙酸乙酯2.5 mg·mL-1、四氫呋喃360 μg·mL-1、乙基苯184 μg·mL-1、對二甲苯152 μg·mL-1、鄰二甲苯98 μg·mL-1、二甲基亞砜2.5 mg·mL-1的混合對照母液；精密量取混合對照母液適量，以吡咯烷酮稀釋10倍，得含正己烷14.5 μg·mL-1、乙酸乙酯250 μg·mL-1、四氫呋喃36 μg·mL-1、乙基苯18.4 μg·mL-1、對二甲苯15.2 μg·mL-1、鄰二甲苯9.8 μg·mL-1、二甲基亞砜250 μg·mL-1的混合對照溶液；精密量取5 mL混合對照溶液，置于20 mL頂空瓶中，壓蓋密封。

供試溶液：分別精密稱取對戊氧基三聯(lián)苯甲酸0.25 g、HOBT 0.094 g，置于20 mL頂空瓶中，加入吡咯烷酮5 mL，壓蓋密封。

1.3 色譜條件

色譜柱采用以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷(DB-624)為固定液的毛細(xì)管柱(30 m×530 μm,3 μm)；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min；以10 ℃·min-1升溫至95 ℃，保持6 min；以15 ℃·min-1升溫至140 ℃，保持7 min；以30 ℃·min-1升溫至240 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度240 ℃；載氣為高純氮?dú)猓缓愣魉?.5 mL·min-1；分流比20∶1；FID溫度250 ℃，補(bǔ)充載氣30 mL·min-1；頂空瓶平衡溫度130 ℃，平衡時(shí)間40 min；進(jìn)樣定量管1 000 μL，進(jìn)樣時(shí)間0.5 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適用性和專屬性

取吡咯烷酮5 mL置于頂空瓶中，分別加入適量目標(biāo)溶劑正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、間二甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜，壓蓋密封，進(jìn)行HS-GC分析，保留時(shí)間分別為7.823 min、8.799 min、9.374 min、16.691 min、16.938 min、16.957 min、18.020 min、18.784 min。由于間二甲苯、對二甲苯的保留時(shí)間相近，其色譜峰不能有效分離，而對二甲苯的控制限度低，故以對二甲苯的限度控制間二甲苯及對二甲苯的加和量。

取空白溶液、混合對照溶液、供試溶液進(jìn)樣分析，其頂空氣相色譜圖如圖3所示。

由圖3可知，在色譜條件下，各組分均能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，達(dá)到藥典要求，理論塔板數(shù)為68 353(以正己烷峰計(jì))。表明，其它組分對測定無干擾，該方法專屬性強(qiáng)。

1.正己烷 2.乙酸乙酯 3.四氫呋喃 4.乙基苯

2.1.2 線性關(guān)系

配制混合對照溶液，稀釋，使各目標(biāo)溶劑最高濃度分別為其限度的200%，最低濃度分別為其定量限。以各目標(biāo)溶劑濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程，結(jié)果見表1。

由表1可知，7種目標(biāo)溶劑的濃度與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。

表1 回歸方程及線性范圍(n=6)

2.1.3 定量限及檢測限

配制混合對照溶液，逐級稀釋，連續(xù)進(jìn)樣測定6次。按信噪比S/N≥10計(jì)算定量限，信噪比S/N≥3計(jì)算檢測限。測得正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜的定量限分別為0.036 μg·mL-1、0.38 μg·mL-1、0.18 μg·mL-1、0.74 μg·mL-1、0.62 μg·mL-1、0.80 μg·mL-1、20.11 μg·mL-1，檢測限分別為0.015 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.06 μg·mL-1、0.37 μg·mL-1、0.31 μg·mL-1、0.30 μg·mL-1、7.54 μg·mL-1。

2.1.4 精密度

配制混合對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣測定6次。測得正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜峰面積的RSD值(n=6)分別為4.2%、4.3%、3.8%、5.1%、5.1%、5.3%、4.5%，均小于10%。表明該方法精密度較好。

2.1.5 重復(fù)性

取對戊氧基三聯(lián)苯甲酸(批號20190608)適量，配制6份供試溶液，進(jìn)行HS-GC分析。供試溶液中僅檢出微量的對二甲苯、鄰二甲苯，殘留量分別為0.0038%、0.0024%，RSD值(n=6)分別為 3.1%、4.4%，均小于5%。表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.6 加標(biāo)回收率

分別精密稱取對戊氧基三聯(lián)苯甲酸(批號20190608)0.25 g、HOBT 0.094 g，共10份，其中1份加入5 mL吡咯烷酮，作為空白溶液；另外9份分別加入低(50%)、中(100%)、高(150%)3個(gè)水平的混合對照溶液5 mL，每個(gè)加標(biāo)水平各3份；以混合對照溶液作為對照，進(jìn)行HS-GC分析，按外標(biāo)法計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率結(jié)果(n=9)/%

由表2可知，7種目標(biāo)溶劑的平均加標(biāo)回收率分別為89.23%、95.80%、94.74%、95.82%、92.45%、92.80%、104.47%，RSD值分別為4.1%、3.7%、3.2%、5.2%、4.4%、4.3%、3.4%。

2.1.7 穩(wěn)定性

配制6份混合對照溶液，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h進(jìn)樣，進(jìn)行HS-GC分析。測得正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜峰面積的RSD值(n=6)分別為4.2%、4.3%、3.8%、5.1%、5.1%、5.3%、4.5%，均小于10%。表明混合對照溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 實(shí)際樣品測定

取3批對戊氧基三聯(lián)苯甲酸樣品，配制供試溶液，進(jìn)行HS-GC分析，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中殘留溶劑含量，結(jié)果見表3。

表3 不同批次樣品測定結(jié)果/%

由表3可知，3批對戊氧基三聯(lián)苯甲酸樣品中僅檢出少量的對二甲苯和鄰二甲苯，殘留量分別為0.004%、0.002%，均低于限度要求，其它溶劑未檢出。

2.3 討論

2.3.1 溶劑的選擇

由于對戊氧基三聯(lián)苯甲酸溶解性較差，分別考察了其在水、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、吡咯烷酮溶液、N,N-二甲基甲酰胺-吡咯烷酮混合溶液、HOBT-吡咯烷酮混合溶液、碳酸鈉溶液、氫氧化鈉溶液中的溶解性，發(fā)現(xiàn)對戊氧基三聯(lián)苯甲酸在HOBT-吡咯烷酮混合溶液中能完全溶解，且對測定沒有干擾，而在其它溶劑中均不能完全溶解。因此，選用HOBT-吡咯烷酮混合溶液作為溶劑。

2.3.2 頂空條件的優(yōu)化

分別考察了頂空平衡溫度(120 ℃、130 ℃、140 ℃)、平衡時(shí)間(30 min、40 min、50 min)對樣品測定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平衡溫度為130 ℃時(shí)，平衡時(shí)間超過40 min后，頂空瓶中氣液兩相已達(dá)到平衡，為縮短分析時(shí)間，選擇頂空平衡溫度130 ℃、平衡時(shí)間40 min。

由于正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜等7種目標(biāo)溶劑的極性相差較大，因此采用了3次程序升溫過程，能較好地分離目標(biāo)溶劑，大大縮短了分析時(shí)間，滿足了檢測要求。

3 結(jié)論

建立了同時(shí)測定阿尼芬凈關(guān)鍵原料對戊氧基三聯(lián)苯甲酸中7種殘留溶劑(正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜)的頂空氣相色譜法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，7種殘留溶劑的濃度與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上；7種殘留溶劑的平均加標(biāo)回收率分別為89.23%、95.80%、94.74%、95.82%、92.45%、92.80%、104.47%，RSD值分別為4.1%、3.7%、3.2%、5.2%、4.4%、4.3%、3.4%。該方法操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性高、專屬性強(qiáng)，可用于對戊氧基三聯(lián)苯甲酸中殘留溶劑的測定，為對戊氧基三聯(lián)苯甲酸的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。