張城瑞 于清源 王季紅 孫雨坤 宛 濤 余奕東 張永根*
(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,哈爾濱 150030;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院,呼和浩特 010010;3.鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院,鄂爾多斯 017000)
短期高精料飼養(yǎng)是提高反芻動(dòng)物育肥期生長(zhǎng)速率的一種常用手段。為此,尋找提高飼料效率的方法是實(shí)現(xiàn)促進(jìn)生長(zhǎng)的有效途徑。目前,在飼糧中添加具有促進(jìn)生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì),如植物提取物、中草藥、酶制劑、益生菌等是繼全面禁止飼用抗生素后最有效的方法之一。
丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是一種在胃腸道環(huán)境中具有較高耐受性的益生菌,其獨(dú)立的消化酶系統(tǒng)可分泌多種代謝產(chǎn)物,其中丁酸是其最主要的代謝產(chǎn)物之一,可作為宿主胃腸道的能量來源[1],促進(jìn)胃腸上皮組織發(fā)育并可鞏固其屏障功能[2],達(dá)到促生長(zhǎng)的目的[3]。此外,丁酸梭菌的其他代謝產(chǎn)物如磷壁酸因其高度黏附的特性,促進(jìn)其在機(jī)體內(nèi)定植;分泌酶類等提高飼糧在胃腸道的轉(zhuǎn)化率;小肽類物質(zhì)(細(xì)菌素)有助于促進(jìn)腸道益生菌的競(jìng)爭(zhēng)性黏附,占據(jù)黏附位點(diǎn)而抑制病原菌入侵[4]。丁酸梭菌可通過上述分泌物,調(diào)節(jié)體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和組成,改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),促進(jìn)家畜的生長(zhǎng)發(fā)育[2-3,5]。目前,有關(guān)人體和小鼠試驗(yàn)的研究報(bào)道,丁酸梭菌及其代謝產(chǎn)物具有提高抗氧化能力、緩解炎癥、調(diào)節(jié)腸道免疫功能和腸道屏障功能等作用[6-7]。在動(dòng)物生產(chǎn)中,在仔豬和家禽飼糧中添加丁酸梭菌,可改善腸道健康,進(jìn)而有效提高生長(zhǎng)性能[1-2,8]。此外,在犢牛和羔羊飼養(yǎng)試驗(yàn)中,添加丁酸梭菌可有效提高機(jī)體的抗氧化能力和免疫功能,與單胃動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果[9-10]相一致。目前,多數(shù)研究表明丁酸梭菌可在機(jī)體腸道中定植,具有改變腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)、鞏固腸道屏障功能以及加速新陳代謝等作用,從而改善家畜對(duì)飼糧的消化吸收且提高機(jī)體免疫力[2,6-8]。然而,有關(guān)丁酸梭菌在反芻動(dòng)物中的具體作用效果尚不明確,特別是丁酸梭菌在其特殊的消化系統(tǒng)中對(duì)胃腸道中菌群的影響尚不清楚。因此,本研究旨在向育肥山羊飼糧中添加丁酸梭菌,探究其對(duì)山羊生長(zhǎng)性能和直腸微生物區(qū)系的影響,為其在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
所有試驗(yàn)操作均依據(jù)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)的建議和操作指南進(jìn)行(NEAU-[2011]-9)。本試驗(yàn)于內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市鄂托克旗家庭牧場(chǎng)進(jìn)行。
按照體重[(22.00±2.09)kg]相近原則,選取16頭健康狀況良好的6月齡阿爾巴斯公山羊,隨機(jī)分為2組,每組8個(gè)重復(fù)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,丁酸梭菌組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加2.0×108CFU/kg丁酸梭菌(經(jīng)由飽和脂肪包被,活菌數(shù)≥1.0×109CFU/g)的試驗(yàn)飼糧。每日晨飼時(shí)將丁酸梭菌灌服至山羊口中,以確保全部攝入。試驗(yàn)進(jìn)行精粗分飼(精粗比=65∶35),在山羊?qū)⒋诛暳先繑z入后再投放精料,以確保每日飼糧的精粗比保持一致。根據(jù)山羊前1天的采食量來調(diào)節(jié)投料量,以滿足每天各料槽的剩料量介于5%~10%。粗料是由燕麥和苜蓿草(5∶5)組成的混合牧草,精料為無(wú)益生菌添加的商用顆粒料(由某飼料有限公司提供)。精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平、混合牧草營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示。預(yù)試期14 d,正試期56 d。試驗(yàn)山羊于1.5 m×2.0 m的圍欄中單欄飼養(yǎng),飼喂時(shí)間為每天06:00和18:00,試驗(yàn)期間所有山羊均可以自由采食和飲水。
表1 精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平、混合牧草營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))
1.2.1 生長(zhǎng)性能
每天準(zhǔn)確記錄山羊飼糧投入量和剩料量,計(jì)算每只山羊每天的采食量。于預(yù)試期第14天和試驗(yàn)第56天晨飼前稱量每只山羊的體重,并記錄數(shù)據(jù),計(jì)算平均日增重(ADG)和飼料效率(FCR)。
1.2.2 飼糧營(yíng)養(yǎng)成分、養(yǎng)分表觀消化率及氮代謝指標(biāo)
每周進(jìn)行飼糧樣品取樣,最后將樣品混合后進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析,所有樣品于55 ℃烘干48 h,待回潮24 h,粉碎后過40目篩。依據(jù)AOAC(2000)方法測(cè)定干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)以及粗灰分(Ash)的含量[11]。參照Van Soest等[12]方法測(cè)定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的含量,酸性不溶灰分(AIA)的含量依據(jù)《飼料中鹽酸不溶灰分的測(cè)定》(GB/T 23742—2009)測(cè)定。
于試驗(yàn)第17~19天、第45~47天、第63~65天每日07:00和19:00待山羊排便后收集糞便。將3次收集的糞便混合后平均分2份,一份添加10%硫酸固氮用于CP含量的測(cè)定,另一份用于其他常規(guī)養(yǎng)分含量的測(cè)定,均置于-20 ℃保存。相關(guān)養(yǎng)分含量的測(cè)定方法與飼糧相同。采用AIA法計(jì)算養(yǎng)分表觀消化率,計(jì)算公式如下:
養(yǎng)分表觀消化率(%)=100-[(M2n×M1m)/(M1n×M2m)]。
式中:M1m為飼糧中AIA含量(%);M2m為糞便中AIA含量(%);M1n為飼糧中某養(yǎng)分含量(%);M2n為糞便中養(yǎng)分含量(%)。
于試驗(yàn)第17~19天、第45~47天、第63~65天每日07:00和19:00通過刺激法采集山羊尿液。將3次收集的尿液混合均勻后平均分為2份,其中一份添加0.1%的硫酸固氮用于CP含量的測(cè)定,均置于-20 ℃保存。尿液中肌酐(CREA)含量使用商業(yè)試劑盒(南京建成生物工程研究所),按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。依據(jù)文獻(xiàn)[13-14]方法測(cè)定肌酐含量,然后估算尿量,且設(shè)定肌酐輸出量為29 mg/kg,以此計(jì)算糞氮和尿氮,計(jì)算公式如下:
糞氮(g/d)=[采食CP含量(g/d)-采食CP含量(g/d)×CP表觀消化率(%)]/6.25;尿氮(g/d)=尿量(L/d)×尿中CP含量(g/L)/6.25。
1.2.3 血漿生化指標(biāo)
于試驗(yàn)第70天晨飼前使用負(fù)壓肝素鈉管在山羊頸靜脈處采血,每只山羊采集15 mL。3 500×g離心15 min后將血漿分裝至1.5 mL離心管中,并置于-20 ℃保存。
血漿生化指標(biāo)尿素氮(UN)、CREA、葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、GLB、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量以及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性由北京華英生物技術(shù)研究所協(xié)助檢測(cè),試劑盒購(gòu)自北京中生北控生物科技股份有限公司,測(cè)定儀器型號(hào)為邁瑞B(yǎng)S-420全自動(dòng)生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。
1.2.4 直腸微生物豐度和多樣性
于試驗(yàn)期第69天,通過刺激法每組隨機(jī)抽取5頭山羊收集糞便,分裝到凍存管后立即置于液氮中凍存,轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室后置于-80 ℃冰箱保存,用于進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析直腸微生物。使用E.Z.N.A.?糞便DNA試劑盒(D4015,Omega,Inc.,美國(guó))提取不同樣本的DNA。用無(wú)核水作空白,總DNA用50 μL的洗脫緩沖液洗脫,保存在-80 ℃,送至由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)16S rDNA的擴(kuò)增片段V3~V4區(qū)設(shè)計(jì)通用引物序列:341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’,805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’),在引物的5’端對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行條形碼標(biāo)記,并對(duì)通用引物進(jìn)行測(cè)序。PCR擴(kuò)增在總體積25 μL的反應(yīng)混合液中進(jìn)行,其中包含25 ng模板DNA,12.5 μL PCR預(yù)混物,每個(gè)引物2.5 μL, PCR級(jí)水調(diào)節(jié)體積。PCR擴(kuò)增原核16S片段的條件:初始變性98 ℃保溫30 s;98 ℃變性10 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,循環(huán)32次;最后在72 ℃下拉伸10 min。擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。在整個(gè)DNA提取過程中,使用的是超純水,而不是樣品溶液,以排除假陽(yáng)性PCR結(jié)果作為陰性對(duì)照的可能性,PCR產(chǎn)物由AMPure XT beads(Beckman Coulter Genomics, Danvers,美國(guó))純化,Qubit(Invitrogen,美國(guó))定量。擴(kuò)增子池用于測(cè)序,擴(kuò)增子文庫(kù)的大小和數(shù)量分別在Agilent 2100生物分析儀(Agilent,美國(guó))和Illumina(Kapa Biosciences, Woburn,美國(guó))的文庫(kù)定量試劑盒上進(jìn)行評(píng)估。在NovaSeq PE250平臺(tái)上對(duì)庫(kù)進(jìn)行排序。
16S rDNA測(cè)序樣品在Illumina NovaSeq平臺(tái)上按照制造商的建議進(jìn)行測(cè)序,由LC-Bio提供。根據(jù)樣品獨(dú)特的條形碼,將配對(duì)端序列分配給樣品,并將建庫(kù)引入的barcode和引物序列去除。使用FLASH合并匹配端讀取。根據(jù)fqtrim(v0.94),在特定的過濾條件下對(duì)原始讀數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾,以獲得高質(zhì)量的clean標(biāo)簽。使用Vsearch軟件對(duì)嵌合序列進(jìn)行過濾(v2.3.4)。利用DADA2進(jìn)行解調(diào),得到特征表和特征序列。多樣性和多樣性通過歸一化到相同的隨機(jī)序列來計(jì)算。然后根據(jù)SILVA(release132)分類器,利用每個(gè)樣本的相對(duì)豐度對(duì)特征豐度進(jìn)行歸一化。Alpha多樣性用于分析樣本物種多樣性的復(fù)雜性,Chao1、Observedspecies、Goodscoverage、Shannon、Simpson指數(shù)是用QIIME2計(jì)算出來的。Beta多樣性由QIIME2計(jì)算,R包繪制。采用Blast進(jìn)行序列比對(duì),每個(gè)代表性序列用SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)特征序列進(jìn)行注釋。其他的圖是也使用R包實(shí)現(xiàn)(v3.5.2)。
本試驗(yàn)中生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分表觀消化率、血漿生化指標(biāo)數(shù)據(jù)均先用Excel 2019進(jìn)行整理,再通過SPSS 25統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析,試驗(yàn)結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示。P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著,0.05
由表2、表3可知,與對(duì)照組相比,添加丁酸梭菌對(duì)育肥山羊的平均日增重、總采食量以及飼料效率均無(wú)顯著影響(P>0.05),對(duì)養(yǎng)分表觀消化率和氮代謝指標(biāo)也沒有顯著影響(P>0.05)。
表2 丁酸梭菌對(duì)育肥山羊生長(zhǎng)性能的影響
表3 丁酸梭菌對(duì)育肥山羊養(yǎng)分表觀消化率和氮代謝的影響
由表4可知,與對(duì)照組相比,添加丁酸梭菌可顯著提高育肥期山羊血漿中GLU、TC、HDL和LDL的含量(P<0.05),對(duì)于血漿中AST活性以及TP和GLB含量有提高的趨勢(shì)(0.05
0.05)。
表4 丁酸梭菌對(duì)育肥山羊血漿生化指標(biāo)的影響
由表5可知,在育肥期山羊直腸微生物門水平中,與對(duì)照組相比,添加丁酸梭菌有提高Epsilonbacteraeota相對(duì)豐度的趨勢(shì)(0.05
0.05)。
表5 丁酸梭菌對(duì)育肥山羊直腸門水平微生物相對(duì)豐度的影響
由表6可知,在直腸微生物屬水平中,與對(duì)照組相比,添加丁酸梭菌可顯著提高克里斯滕森菌科_R-7群的相對(duì)豐度(P<0.05),顯著降低瘤胃菌科_UCG-014的相對(duì)豐度(P<0.05),有降低梭菌屬相對(duì)豐度的趨勢(shì)(0.05
表6 丁酸梭菌對(duì)育肥山羊直腸微生物屬水平相對(duì)豐度的影響
目前,有關(guān)丁酸梭菌的研究報(bào)道,飼糧中添加丁酸梭菌可提高畜禽的生長(zhǎng)性能。Han等[2]研究報(bào)道,仔豬飼糧中添加丁酸梭菌可增加空腸絨毛高度和隱窩深度,提高空腸對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,顯著提高仔豬的平均日增重。同時(shí),肉雞[8]與蛋雞[15]的研究結(jié)果表明,補(bǔ)充丁酸梭菌有助于促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育,并顯著提高家禽的飼料效率和平均日增重。此外,本實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明,飼糧中添加丁酸梭菌可顯著提高犢牛的平均日增重,并降低犢牛的腹瀉率[9]。以上結(jié)果均得益于丁酸梭菌在進(jìn)入機(jī)體胃腸道后,可分泌大量的短鏈脂肪酸和維生素類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),且有助于提高消化酶的活性[2,4,16],促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,進(jìn)而提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)在高精料飼糧的飼養(yǎng)模式下,各組山羊的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著差異,這與Zhang等[1]和何家俊等[17]的研究結(jié)果相似,飼糧中添加丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬和犢牛的生長(zhǎng)性能均無(wú)顯著影響。Mu等[18]研究報(bào)道,高精料飲食易影響瘤胃穩(wěn)態(tài),使部分酶活性下降以及菌群失衡,同時(shí)丁酸梭菌的活性易受到復(fù)雜環(huán)境的影響[19]。因此,這可能與瘤胃環(huán)境、飼養(yǎng)模式、物種以及丁酸梭菌的生物學(xué)特性有關(guān),未來需我們結(jié)合瘤胃發(fā)酵情況進(jìn)一步探究丁酸梭菌對(duì)山羊生長(zhǎng)性能的影響。
血漿生化指標(biāo)是反映機(jī)體健康狀況和代謝水平的重要指標(biāo)。反芻動(dòng)物飼糧中碳水化合物在瘤胃中發(fā)酵,可產(chǎn)生大量的揮發(fā)性脂肪酸,經(jīng)肝臟糖異生后轉(zhuǎn)化為GLU[20]。其中反芻動(dòng)物機(jī)體內(nèi)各組織器官對(duì)GLU的需求主要依賴于肝臟糖異生[21]。于泌乳奶牛與奶山羊而言,在體內(nèi)GLU不足的情況下,易發(fā)生能量負(fù)平衡,進(jìn)而引發(fā)機(jī)體代謝紊亂和部分疾病的產(chǎn)生[22-23]。本試驗(yàn)中,飼糧添加丁酸梭菌可提高血漿中GLU的含量,這表明在高精料飼糧中添加丁酸梭菌有助于提高瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn),從而加速肝臟糖異生的過程。這與何家俊等[17]的研究結(jié)果相一致。血漿中ALT、AST活性和TP含量可反映機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收以及診斷疾病,其中ALT和AST的活性是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞壞死的重要指標(biāo)。研究表明,病毒性肝炎、藥物以及毒素等會(huì)引發(fā)慢性肝病,并增加血液中ALT和AST的活性[24];TP含量高于65 g/L時(shí),極有可能出現(xiàn)慢性炎癥[25]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,飼糧添加丁酸梭菌后血漿ALT、AST活性和TP含量呈上升趨勢(shì),這表明丁酸梭菌有助于提高山羊體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝水平。然而,高精料飲食含大量可發(fā)酵的碳水化合物,在短期內(nèi)易使瘤胃pH下降以及菌群失衡,加劇瘤胃內(nèi)毒素的累積[26-27],并將其通過瘤胃上皮轉(zhuǎn)運(yùn)至血液中,影響機(jī)體正常的生理功能。這意味著生產(chǎn)中使用高精料快速育肥時(shí)伴有增加肝臟損害的風(fēng)險(xiǎn)。
血漿中TC、HDL和LDL是反映脂代謝的有效指標(biāo)。益生菌具有降低血漿中TC含量的作用。Mohan等[28]的研究顯示,在蛋雞飼糧中添加益生菌可有效降低血漿中TC的含量。Jiang等[29]研究發(fā)現(xiàn),飼喂植物乳桿菌299v的犢牛血漿中TC含量顯著低于對(duì)照組,是因?yàn)槿樗峋陨砜煞纸釺C。相反,本試驗(yàn)中丁酸梭菌顯著提高了血漿中TC、HDL和LDL的含量。此外,Sanders[30]研究表示,參與乙酰CoA合成TC過程中,甲戊酸的中間體是肝臟合成的β-羥基-β-甲基戊二酰CoA,益生菌對(duì)其具有抑制作用,這與脂肪動(dòng)員酶的活性有關(guān)。因此,飼糧中添加丁酸梭菌在正常范圍內(nèi)可促進(jìn)脂質(zhì)代謝,但由于HDL與LDL之間的拮抗作用,從而未能影響育肥期山羊的生長(zhǎng)性能。
反芻動(dòng)物消化道內(nèi)菌群的生命活動(dòng)與其生長(zhǎng)性能密切相關(guān)。本試驗(yàn)中,瘤胃球菌科_UCG-014、理研菌科_RC9腸道群以及未分類毛螺菌科等有益菌是山羊直腸中的優(yōu)勢(shì)菌群,這與犢牛試驗(yàn)的研究結(jié)果[31]相似。一些研究報(bào)道,瘤胃球菌科成員均可充分降解機(jī)體消化道內(nèi)的碳水化合物,并將其轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸[32]。盡管本試驗(yàn)的結(jié)果顯示,添加丁酸梭菌使得瘤胃球菌科_UCG-014的相對(duì)豐富顯著下降,但其在山羊直腸微生物區(qū)系中占比小,對(duì)其他瘤胃球菌科的影響略輕。Zhou等[33]研究顯示,瘤胃球菌科_UCG-014相對(duì)豐度與機(jī)體內(nèi)白細(xì)胞介素(IL)-1β的釋放呈正相關(guān),有增加損害機(jī)體器官及組織的風(fēng)險(xiǎn)。此外,本試驗(yàn)?zāi)c道中克里斯滕森菌科_R-7群的相對(duì)豐度顯著增加。Li等[34]研究表明,克里斯滕森菌科_R-7群相對(duì)豐度的增加能促進(jìn)腸道上皮屏障的完整性,抑制有害菌入侵。腸道組織是體內(nèi)最大的免疫器官,且微生物群在促進(jìn)腸道發(fā)育和功能完善方面至關(guān)重要,上述結(jié)果表明,添加丁酸梭菌與增強(qiáng)山羊腸道免疫功能有關(guān),但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。然而,育肥期山羊直腸中梭菌屬的相對(duì)豐度有下降的趨勢(shì),與單胃動(dòng)物的研究結(jié)果不一致,Zhang等[1]在仔豬飼糧中添加丁酸梭菌不會(huì)改變糞便梭菌或丁酸梭菌的含量,這可能與丁酸梭菌在瘤胃內(nèi)作用有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表示,直腸中彎曲桿菌屬的相對(duì)豐度有增加的趨勢(shì)。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道,彎曲桿菌屬是引起腸道細(xì)菌性腸炎的常見菌之一[35-36]。直腸中有害菌增殖,競(jìng)爭(zhēng)腸道養(yǎng)分,影響益生菌在腸道中的相對(duì)豐度。因此,我們還需結(jié)合丁酸梭菌在山羊瘤胃中的代謝狀況以及對(duì)于瘤胃菌群的影響,進(jìn)一步闡明丁酸梭菌對(duì)山羊生長(zhǎng)性能的影響。
綜上所述,高精料飼糧中添加丁酸梭菌可有效提高山羊血漿中GLU和HDL的含量,并可通過上調(diào)有益菌的相對(duì)豐度改善直腸微生物區(qū)系結(jié)構(gòu),但丁酸梭菌對(duì)育肥期山羊的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響。