糞菌移植及其在豬上的應(yīng)用研究進展

張 卓 蔣 謙 劉作華 齊仁立*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410000；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部養(yǎng)豬科學(xué)重點實驗室，重慶 402460)

人和動物的消化道內(nèi)寄居著數(shù)量龐大的微生物群(細(xì)菌為主)，它們與宿主形成穩(wěn)定的共生關(guān)系。腸道菌群失衡或有害菌侵襲會影響宿主健康，導(dǎo)致多種腸道疾病和代謝疾病的發(fā)生。糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是指將健康供體或自體糞便菌群整體移植到受體消化道，快速、徹底地改變或者重塑后者腸道微生態(tài)系統(tǒng)，以期改善受體腸道健康，增強腸道功能或產(chǎn)生與供體相似的代謝特征[1-3]。追溯FMT的起源，我國晉代葛洪所著的《肘后備急方》中即有對“黃湯”治療腹瀉、發(fā)熱患者的記載。直到1958年，這種歷史悠久的菌群移植技術(shù)再次投入治療人類偽膜性腸炎[4]。迄今，F(xiàn)MT已成為有效治療復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection，CDI)等人類腸道疾病的個性化治療方案[5-7]。與使用單一或復(fù)合益生菌相比，F(xiàn)MT介導(dǎo)的腸道菌群變化更具時效性和系統(tǒng)性[8-10]。目前，國內(nèi)外已經(jīng)建成2個大型的非營利性糞菌庫(中華糞菌庫和Openbiome)，F(xiàn)MT異地救援性治療分別在中國和北美等地區(qū)廣泛開展[11]。

1 FMT的關(guān)鍵技術(shù)點

1.1 供體的篩選

用于菌群移植的供體糞便通常分為異體來源和自體來源。異體FMT是當(dāng)前應(yīng)用的主流，便于實現(xiàn)一對多的治療，且普遍較自體FMT具有更好的療效[12-13]。篩選異源糞便時需要考慮供體生理、心理等方面因素，及時排除具有用藥史、疾病史和感染史的捐贈者，以期減少或預(yù)防不良事件的發(fā)生。自體FMT的優(yōu)點在于排斥性更小，更適用于患者在消化系統(tǒng)手術(shù)后自身菌群重塑和恢復(fù)[14]。

1.2 菌懸液的制備與保存

糞便菌懸液的制備過程主要包括糞便的收集、稀釋、離心、過濾、純化等[15]。根據(jù)糞便狀態(tài)，制備后的菌懸液可分為新鮮糞便菌懸液、冷凍勻質(zhì)糞便菌懸液和發(fā)酵糞便菌懸液[16]，不同處理方式會導(dǎo)致懸液中細(xì)菌的活力、數(shù)量和代謝物成分產(chǎn)生巨大差異。從成本和便捷性考慮，當(dāng)前多數(shù)研究選擇使用新鮮糞便菌懸液進行FMT。此外，由于絕大多數(shù)腸道菌群屬于厭氧菌[17-18]，要求整個制備過程在厭氧環(huán)境下規(guī)范操作進行。

1.3 FMT的遞送途徑

目前在醫(yī)學(xué)上開展FMT有多種方式，包括上消化道移植(口服、鼻胃管或者胃鏡給菌)、中消化道移植(鼻腸管和經(jīng)內(nèi)鏡腸管給菌)和下消化道移植(腸鏡、灌腸、直腸軟探針遞送等)[19-21]。在人類各種炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)治療中，以口服糞菌膠囊和應(yīng)用灌腸的方式是最為簡單和最容易接受的，且具有很高的治愈率[22-25]。

1.4 受體的術(shù)前準(zhǔn)備

受體在接受FMT前需實時監(jiān)控自身的健康狀態(tài)，根據(jù)實際情況考慮在輸送糞菌液前是否接受抗生素、洗腸等處理，并基于遞送途徑口服抑制胃酸分泌或抑制腸蠕動的藥物，以達到更好的移植效果[25-28]。由于不同個體對于外源菌的接受程度不一，F(xiàn)MT施展頻次和劑量也需要充分考慮。然而目前這些方面還缺乏足夠的研究，沒有形成共識。

2 FMT在豬上的應(yīng)用研究進展

基于FMT在人類醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用思路，在動物養(yǎng)殖領(lǐng)域試圖將FMT技術(shù)移植到畜禽生產(chǎn)中，通過導(dǎo)入外源“健康”或“功能”菌群，加速腸道菌的定植或改善腸道功能，進而提高畜禽健康水平與生產(chǎn)性能[29]。我國是世界上生豬養(yǎng)殖和消費規(guī)模最大的國家，研究和建立適合豬的FMT技術(shù)對于提高豬養(yǎng)殖技術(shù)水平，推動養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展具有重要意義和價值。

2.1 FMT有效改變仔豬腸道菌群

施用FMT的主要目的是想要快速而有效的改變受體的腸道微生物區(qū)系。處于發(fā)育早期的幼齡仔豬腸道菌群還沒有完全成熟，且操作更方便，所以目前在豬上進行的FMT研究多集中于新生仔豬或斷奶仔豬。

仔豬在出生過程中和出生后腸道迅速定植微生物，主要來源是母體、糞便、乳汁、環(huán)境等[30-31]。出生后第1周，仔豬腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量極速增加，并呈現(xiàn)從需氧菌到厭氧菌的轉(zhuǎn)變[32-33]。當(dāng)前，許多研究選擇在仔豬出生后立即開始實施FMT，能夠盡可能減少內(nèi)源腸道菌的影響，讓植入菌群快速成為受體動物腸道內(nèi)的“主力軍”[34-35]。不同的研究表明，通過FMT方式可加速新生仔豬腸道菌的定植，明顯增加受體腸道細(xì)菌的多樣性，在自身原有基礎(chǔ)上進一步的提高優(yōu)勢菌(通常是有益共生菌)的豐富度和占比，同時減少致病菌的數(shù)量，降低環(huán)境、母體、哺乳、免疫等復(fù)雜因素對仔豬早期腸道菌群的擾亂[36-38]。Hu等[36]研究表明，將成年金華豬的糞便微生物移植給新生仔豬，顯著增加仔豬結(jié)腸中乳桿菌屬(Lactobacillus)、普氏菌屬(Prevotella)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)等相對豐度，降低了梭桿菌科(Fusobacteriaceae)相對豐度，并加速了屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)等專性厭氧菌的定植進程。Cheng等[37]發(fā)現(xiàn)，施用FMT后仔豬腸道有益菌豐度增加，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)等致病菌相對豐度下降，觸發(fā)由腸道微生物相關(guān)的腸道黏膜保護性自噬，從而維持了腸屏障的完整性。杜蕾[38]前期在新生無菌(germ free, GF)豬上的研究發(fā)現(xiàn)，GF仔豬腸道和免疫系統(tǒng)(如腸系膜淋巴)明顯發(fā)育遲緩，但是在仔豬出生后2周內(nèi)進行FMT都能夠有效促進或恢復(fù)腸道和免疫系統(tǒng)的發(fā)育，且移植時間越早越好。

斷奶階段是FMT另一關(guān)鍵時期，由于斷奶應(yīng)激和飼料類型的轉(zhuǎn)變，通常斷奶仔豬的腹瀉率明顯增加，腸道疾病發(fā)病率和死淘率顯著提高。但此時斷奶仔豬的內(nèi)源腸道菌群已經(jīng)趨近成熟，F(xiàn)MT的效果會受到一定的影響。一些研究試圖通過FMT來改善斷奶仔豬的腸道健康，削弱斷奶應(yīng)激對腸道生態(tài)系統(tǒng)的損害[39-40]。Hu等[39]研究發(fā)現(xiàn)，單獨施用FMT或者FMT結(jié)合使用谷物乳桿菌(Lactobacillusfrumenti)、加氏乳桿菌LA39(LactobacillusgasseriLA39)等益生菌，均可以使受體仔豬腸道菌群組成趨向于受體發(fā)生變化，增加腸道丙酸和丁酸代謝菌的相對豐度，顯著降低斷奶仔豬腹瀉率。

2.2 FMT對豬生長和健康的影響

2.2.1 FMT增強宿主代謝功能

宿主對于食物中營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收在很大程度上依賴于腸道菌群[41-42]。除了分解宿主自身不能消化利用的纖維等營養(yǎng)素，腸道菌群還能產(chǎn)生多種維生素、氨基酸、有機酸等營養(yǎng)物質(zhì)。多數(shù)情況下，F(xiàn)MT介導(dǎo)的菌群移植整體增加豬的腸道菌群多樣性和豐富度，可提高宿主對營養(yǎng)組分的消化利用率[43-45]。例如，通過FMT引入的大量桿菌屬(Bacillus)可以促進初級膽汁酸向次級膽汁酸的轉(zhuǎn)變，這對飼糧中的脂質(zhì)吸收和利用很有幫助[46]。此外，F(xiàn)MT引入的優(yōu)勢菌，如乳桿菌屬、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)等明顯促進短鏈脂肪酸(SCFAs)的產(chǎn)生，除了為后腸提供能量，還可以作為信號分子調(diào)控機體代謝平衡和能量穩(wěn)態(tài)[47]。

2.2.2 FMT改善腸道屏障和分泌功能

細(xì)菌的定植能夠直接影響宿主腸道發(fā)育和健康[48]。研究表明，F(xiàn)MT介導(dǎo)的一些功能性細(xì)菌(如梭菌屬、Clostridium)引入可以利用芳香族氨基酸(如色氨酸)產(chǎn)生多種抗炎性代謝物(如吲哚丙酸、吲哚乙酸等)減少腸道炎癥發(fā)生[49]，增加腸道黏膜分泌性免疫球蛋白A(sIgA)陽性細(xì)胞密度和杯狀細(xì)胞數(shù)量，并提高黏蛋白2(MUC2)、β-防御素-2(BD-2)、Toll樣受體(TLR)2/4的表達，刺激免疫細(xì)胞的成熟和活化[50-51]。本實驗室前期在仔豬上的菌群移植試驗也表明，供體豬結(jié)腸菌移植可有效提高仔豬回腸的緊密連接蛋白閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)的表達，提高結(jié)腸黏膜層厚度和MUC2的表達[52]。近期，本實驗室分析了菌群移植對仔豬腸道分泌功能的影響，試驗結(jié)果表明，菌群移植介導(dǎo)的腸道菌群變化能夠影響到腸分泌細(xì)胞(EECs)的數(shù)量和功能，胃腸道產(chǎn)生的饑餓素、膽囊收縮素等多種激素和小肽的表達量都發(fā)生明顯的改變；這些激素和細(xì)胞因子可通過“腸-腦軸”作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)控宿主食欲和能量穩(wěn)態(tài)[53]。

2.2.3 FMT降低免疫損傷

隨著仔豬飲食由母乳向植物性固體飼料的轉(zhuǎn)變，斷奶后短期內(nèi)乳酸菌屬數(shù)量持續(xù)下降，負(fù)責(zé)固體飼料消化和利用的擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)數(shù)量的減少，這可能是仔豬出現(xiàn)斷奶應(yīng)激的原因[54]。Xiang等[40]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌與母源FMT聯(lián)用能夠引起受體仔豬腸道乳酸菌屬(Lactobacillus)等優(yōu)勢菌的占位優(yōu)勢擴大，毛螺菌科(Lachnospiraceae)、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)等致病菌的相對豐度顯著降低；血漿中炎癥因子含量明顯下降，削弱了由斷奶應(yīng)激造成的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。黃金華等[55]研究報道，基礎(chǔ)飼糧中添加7%的健康哺乳母豬糞菌液能夠顯著降低斷奶仔豬的下痢率，從而提高斷奶仔豬的成活率。

2.3 FMT導(dǎo)致的負(fù)面影響

雖然多數(shù)研究都報道了FMT處理對腸道菌群干預(yù)的有效性。但值得注意的是，F(xiàn)MT處理帶來的并不完全都是有益效果，一些研究也指出，F(xiàn)MT會產(chǎn)生額外的負(fù)面影響。Mccormack等[56]發(fā)現(xiàn)，給予新生仔豬灌喂8 mL的供體豬糞便菌懸液，會嚴(yán)重?fù)p害仔豬的腸道形態(tài)，導(dǎo)致仔豬體重減輕，并且4次灌喂后這種負(fù)面影響明顯大于僅1次灌喂。其原因在于完整的糞便菌群中含有大量致病菌，如鏈球菌屬(Streptococcus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)等。Diao等[57]比較了3種供體豬(藏豬、大白豬和榮昌豬)FMT對同一批受體仔豬的影響效果。研究發(fā)現(xiàn)，藏豬FMT改善了仔豬的生長性能，增強仔豬腸道消化吸收酶的活性，但是大白豬和榮昌豬FMT則破壞仔豬的腸道菌群平衡，一定程度上損害腸道健康。這也提示實施FMT時，選擇適合的豬種和對應(yīng)的生理階段是需要加以考慮的。本實驗室前期的研究也發(fā)現(xiàn)，將同一頭健康成年豬的糞便菌群和結(jié)腸菌群分別移植給2組新生仔豬，產(chǎn)生的效果有明顯的差異：FMT更有利于仔豬的日增重和脂肪沉積，結(jié)腸菌移植更有利于腸道發(fā)育和腸道健康；并且FMT在一定程度上引起了受體仔豬腸道的炎癥反應(yīng)，增加白細(xì)胞介素-1(IL-1)等促炎因子的產(chǎn)生[52]。很明顯，由于FMT是不加選擇的整體移植，難免會導(dǎo)入一些對健康不利的細(xì)菌或者細(xì)菌代謝物(如脂多糖、細(xì)菌毒素等)，這可能會引起機體過度免疫反應(yīng)或者腸道炎癥的發(fā)生。因此，合理、謹(jǐn)慎地挑選供體動物及細(xì)菌來源，規(guī)范FMT的操作流程和處理方式對于菌群移植的成功非常重要。表1列舉了部分較為典型的仔豬FMT試驗研究。

3 FMT在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 豬FMT的安全性及標(biāo)準(zhǔn)化建立

從目前的醫(yī)學(xué)報道來看，使用FMT治療IBD具有較高的安全性。也有個別病案報道，一些病人接受 FMT之后會出現(xiàn)輕微的發(fā)熱、腹脹、腹痛、便秘等反應(yīng)，但這些不良反應(yīng)在短期都能夠得到緩解和消失[13,59-60]。這種現(xiàn)象被認(rèn)為是殘留的致病菌和移植過程中內(nèi)鏡操作出現(xiàn)的不良反應(yīng)。相比于人類臨床醫(yī)學(xué)中FMT的相關(guān)報道，在實際豬生產(chǎn)中可以建立更簡便的FMT方案[61]。即排除在動物上應(yīng)用FMT的心理障礙及倫理道德紛爭后，在篩選合格的供受體豬同時，對分離菌群、量化移植細(xì)菌、規(guī)范移植流程等方面進行標(biāo)準(zhǔn)化，這對于實際生產(chǎn)具有重要意義?？紤]到豬的生產(chǎn)周期、淘汰年限等方面因素，在實際生產(chǎn)中幾乎不可能參照人類醫(yī)學(xué)臨床研究那樣進行長期的隨訪，因此嚴(yán)格把控供體健康和菌源的安全性成了FMT在豬生產(chǎn)中應(yīng)用的基本保障。

在篩選供體豬時必須仔細(xì)挑選生長性能(體重、體長、體表潔凈度、日增重、采食量等)較為優(yōu)秀的個體，進一步通過血清、糞便檢測排除攜帶各類病源的個體[62-63]。此外，可提前針對性的對供體豬進行：1)益生元或者益生菌干預(yù)以提高腸道菌群豐富度和代謝功能；2)給予抗生素和驅(qū)蟲藥處理以清除自身攜帶的致病菌和寄生蟲作為額外補充方案。

菌液制備和移植過程中的風(fēng)險控制也是極其重要的環(huán)節(jié)。Zhang等[64]提出了洗滌菌群移植的概念：基于自主研發(fā)的自動菌群凈化系統(tǒng)，將制備好的糞菌懸液進行微濾，之后進行3次以上的離心和重懸[15,61]。該方法可去除菌懸液中的糞便顆粒、寄生蟲蟲卵、真菌、病毒及其代謝物等成分，有效降低了FMT臨床應(yīng)用不良事件的發(fā)生率。雖然目前在畜牧領(lǐng)域還沒有相似的報道，但借鑒此改進方法對豬用FMT菌液進行適度的凈化和純化，去除有害的特殊組分(菌、代謝物、殘渣碎片等)，進一步提高安全性是非常有必要的。同時，嚴(yán)格把控制備環(huán)境參數(shù)，如使用合適的細(xì)菌保護劑、穩(wěn)定劑，優(yōu)化冷凍或干燥處理條件，延長菌液的儲存時間和有效性，避免菌懸液污染和失活是必不可少的。劉敏等[65]比較了不同制備方式(靜置和離心)和不同保存方式(液氮凍存、-80 ℃凍存、液氮24 h+-80 ℃凍存)對菌液的影響。研究發(fā)現(xiàn)離心法獲得細(xì)菌活性低于靜置法；將靜置法制備好的豬糞便菌懸液-80 ℃冷凍保存1周，與新鮮糞菌懸液在細(xì)菌活性與菌群組成上沒有顯著差異。這些結(jié)果為大樣本、長距離豬FMT的應(yīng)用提供了重要技術(shù)參考。

目前在人類臨床研究和不同的動物試驗中，給菌的頻次、劑量等參數(shù)都難以統(tǒng)一。Hu等[39]的試驗中，給仔豬灌服細(xì)菌量為108CFU/mL(2 mL)菌懸液的抗腹瀉效果比灌服細(xì)菌量為109CFU/mL(2 mL)的菌懸液時更強。Mccormack等[56]的試驗表明，單次灌喂細(xì)菌量為1.2×109CFU/mL(8 mL)的糞菌懸液可能會破壞新生仔豬腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，進而引發(fā)動物腹瀉、生長發(fā)育阻滯、炎癥反應(yīng)等。這些結(jié)果提示應(yīng)該根據(jù)受體豬的日齡和體況優(yōu)化FMT方案，無論是口服或者灌腸都需避免單次給菌劑量(懸液體積或總細(xì)菌量)過大、頻率過高、菌液溫度過低造成的生理應(yīng)激，減小FMT造成的負(fù)面影響。

3.2 豬FMT的個性化設(shè)計

由于在豬上開展FMT研究通常都是數(shù)十頭以上的群體試驗，同批次的菌液數(shù)量、穩(wěn)定性、投送難度、經(jīng)濟成本等都需要考慮。目前最常見的方法是簡單的使用新鮮糞便制成懸液直接灌胃給受體豬[66]，然而這種操作方法僅適用于仔豬，難以在成年豬上開展。未來如果在規(guī)?；i場開展菌群移植的生產(chǎn)應(yīng)用，同批次的接種量將會達到數(shù)百至上萬頭豬只規(guī)模。開發(fā)出安全、標(biāo)準(zhǔn)化的給藥途徑必須能夠滿足生產(chǎn)數(shù)量的需求。這必須通過機械設(shè)備進行自動化的后腸灌注或者利用微囊包被技術(shù)制備糞菌膠囊然后口服投遞才能應(yīng)對[67]，但是目前相關(guān)技術(shù)還不成熟，需要進一步的建立和完善。最終我們期望能夠建立起一整套類似仔豬免疫程序的菌群移植程序，通過快捷、安全、有效的途徑完成菌群移植，促進仔豬早期腸道發(fā)育和腸道微生態(tài)系統(tǒng)的完整，甚至改善仔豬的生長和生產(chǎn)性能。然而糞菌懸液制備的不可重復(fù)性和理想供體豬稀缺的問題始終存在。此外，建立標(biāo)準(zhǔn)、安全、豐富的動物糞菌庫可能是解決菌源問題的根本途徑。

在未來，可以針對以下幾點改善豬FMT的應(yīng)用效果：1)根據(jù)不同品種、生理階段或體型大小，確定較為適宜的施用劑量、細(xì)菌數(shù)量、頻次、溫度等主要參數(shù)。2)研究和開發(fā)糞便細(xì)菌厭氧分離裝置、微囊包被技術(shù)、菌液洗滌純化技術(shù)、細(xì)菌微發(fā)酵技術(shù)、自動化灌喂或者灌腸設(shè)備等，建立標(biāo)準(zhǔn)化的菌群供給方式。3)根據(jù)不同生產(chǎn)目標(biāo)開展差異化的FMT研究。例如，使用健康母體、異體成年豬或抗腹瀉率高的地方豬進行FMT，調(diào)控新生仔豬、斷奶仔豬的腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，改善腸道健康[57-67]；選用不同生長指標(biāo)和代謝特征的豬種或個體，以獲取較為理想的供體特性來解決實際生產(chǎn)需要；利用生理狀態(tài)良好的近緣(自身原有凍存健康菌或同欄健康豬)進行FMT，恢復(fù)由于腸道菌群紊亂導(dǎo)致妊娠母豬的難產(chǎn)、便秘、缺乳及食欲調(diào)控等問題。4)結(jié)合益生菌、益生元、后生元等其他微生物調(diào)控方案進行復(fù)合式的FMT干預(yù)方法。

4 小 結(jié)

目前的研究表明，在畜禽生產(chǎn)中使用FMT這一新型“器官移植”方法可以有效、快速改變和提升動物腸道健康和消化功能。但是也存在標(biāo)準(zhǔn)不一、技術(shù)粗放、安全風(fēng)險高等缺陷。未來，根據(jù)豬的飲食習(xí)慣和生理特點，建立更加標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的FMT操作規(guī)程，在提高FMT安全性、有效性、便利性的同時，降低使用成本和操作難度，特別是針對豬的不同生理階段(如妊娠母豬)和不同養(yǎng)殖目的(如提高瘦肉率)制定規(guī)范化或個性化的FMT方案是需要努力的方向。