芒果采后炭疽病生防菌研究進(jìn)展

趙 佳，童 凱，李 東，鄧孟勝，雷 雨

（四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000）

素有“熱帶果王”美譽(yù)的芒果（Mangifera indica L.）因其風(fēng)味獨(dú)特、口感嫩滑、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高而深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。我國(guó)芒果種植主要分布在海南、廣西、云南、四川、貴州等省區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018 年我國(guó)芒果總產(chǎn)量226.81 萬(wàn)t，年產(chǎn)值超過(guò)100 億元[1]。

芒果炭疽病是由炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌引起的，是芒果生產(chǎn)中發(fā)生面積最廣、危害最嚴(yán)重的病害之一。研究發(fā)現(xiàn)，采后芒果果實(shí)的蒂部、中部和端部均可能潛伏一定數(shù)量的炭疽菌，炭疽菌多數(shù)在芒果果實(shí)發(fā)育期間侵入，隨著采后果實(shí)抗性的降低和可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的增加，病菌由潛伏狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏顟B(tài)，引起果實(shí)出現(xiàn)圓形或近圓形、褐色或黑色凹陷的病斑，病斑輕則呈點(diǎn)狀分布，重則連片發(fā)病，導(dǎo)致果實(shí)腐爛變質(zhì)，喪失商品價(jià)值[2]。每年我國(guó)芒果采后損失高達(dá)20%～30%，而發(fā)達(dá)國(guó)家也達(dá)到15%左右[3]。

芒果采后炭疽病的防治以化學(xué)防治為主，生產(chǎn)者主要依賴甲基硫菌靈、多菌靈、苯醚甲環(huán)唑等合成殺菌劑控制芒果炭疽病。然而，合成殺菌劑處理過(guò)的芒果有農(nóng)藥殘留且不易降解，易引發(fā)食品安全和環(huán)境問(wèn)題，其中一些已被芒果國(guó)際貿(mào)易條約禁止[4]。生物防治因具有殘留低、毒性小、無(wú)公害等優(yōu)點(diǎn)，逐漸得到廣泛應(yīng)用[5]。生防菌是生物防治的有效手段之一，目前已經(jīng)從植物和土壤中分離出許多具有拮抗作用的細(xì)菌、絲狀真菌和酵母菌，這些微生物對(duì)芒果采后炭疽菌具有明顯的抑制作用。本文對(duì)芒果采后炭疽病病原菌種類，主要生防菌的類別，病原菌的拮抗機(jī)制，以及如何增強(qiáng)生防菌的防治效果進(jìn)行綜述，以期為我國(guó)芒果采后炭疽病新型農(nóng)藥的制備與抗病資源的選育提供有價(jià)值的參考。

1 芒果炭疽病病原菌種類

20 世紀(jì)90 年代前，炭疽菌屬真菌的分類主要依賴于形態(tài)學(xué)方法[6-9]。形態(tài)學(xué)鑒定是Sutton 在von Arx分類研究的基礎(chǔ)上總結(jié)的一種傳統(tǒng)分類方式，以純培養(yǎng)條件下病原菌的菌落特征（顏色、質(zhì)地和生長(zhǎng)速率），分生孢子和附著孢的形態(tài)、大小，剛毛、菌核、厚垣孢子、有性型的有無(wú)及寄主范圍等方面進(jìn)行分類。通過(guò)形態(tài)學(xué)分類方法，芒果采后炭疽病病原菌多被鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）[10-11]。由于炭疽菌屬真菌可用于分類的形態(tài)指標(biāo)較少，且其菌落特征、孢子和附著孢的大小、形態(tài)仍存在不穩(wěn)定性，不能很好地區(qū)分炭疽菌的種和亞種，表現(xiàn)出極大的局限性。而對(duì)基因型分型的分子生物學(xué)分類則有力避免了上述問(wèn)題[12-13]。

1994 年，Sherriff 等[14]將核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列分析引入了炭疽菌屬。截至2020 年7月，NCBI 中已經(jīng)登錄了近23000 條Colletotrichum的ITS 序列，其中芒果上發(fā)現(xiàn)的炭疽菌ITS 序列有1200 余條。隨著該研究方法應(yīng)用的深入，前人發(fā)現(xiàn)ITS 在種類較多、種間形態(tài)學(xué)差異較小的炭疽菌屬的研究中存在明顯局限性。2000 年，Taylor等[15]提出使用基于多基因譜系識(shí)別生物物種和系統(tǒng)學(xué)種概念。Crouch 等[13]將ITS 與鄰近DNA 裂解酶基因Apn2、交配型基因Mat1、氧化物歧化酶基因Sod2位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合分析，對(duì)復(fù)合群C.graminicola進(jìn)行了有效區(qū)分，并在該屬中發(fā)現(xiàn)6 個(gè)新種?；诙嗷蚍治龇椒ǎ叭税l(fā)現(xiàn)前述引起芒果炭疽病的兩大病原菌——C.gloeosporioides和C.acutatum，均為復(fù)合群，C.gloeosporioides可細(xì)分為31 個(gè)種1 個(gè)亞種[16-23]，而C. acutatum也包含了29 個(gè)種[24]。Lima 等[18]聯(lián)合肌動(dòng)蛋白基因ACT、鈣調(diào)蛋白基因CAL、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因GAPDH、β-微管蛋白基因TUB2和ITS 序列對(duì)巴西東北部芒果炭疽病病原菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了C. asianum、C. fructicola、C. tropicale、C. karstii，以及一個(gè)新種C.dianesei。2018 年以前，國(guó)內(nèi)報(bào)道的芒果炭疽病病原菌主要為C.gloeosporioides，采用的鑒定手段主要是基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)及ITS 序列。近兩年來(lái)，通過(guò)在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上引入多基因位點(diǎn)分析的方法，在芒果主產(chǎn)區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種芒果炭疽病致病菌。在廣西，發(fā)現(xiàn)C.asianum、C.siamense、C.fructicola、C.scovillei均能引起芒果炭疽病的發(fā)生，且前3 種病原菌為優(yōu)勢(shì)種群[25]；在海南，對(duì)臺(tái)農(nóng)芒果采后炭疽病的病原鑒定，發(fā)現(xiàn)其致病菌同廣西基本一致，只是未發(fā)現(xiàn)致病菌C.scovillei[26]；Li 等[27]對(duì)我國(guó)海南、云南、四川、貴州、廣東、福建等主要產(chǎn)區(qū)的芒果炭疽病進(jìn)行分離，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察并聯(lián)合ACT、幾丁質(zhì)合成酶I 基因CHS-I、GAPDH、TUB2，以及ITS 序列進(jìn)行分析，在獲得的200 余份致病菌中共鑒定出13 種炭疽菌，除上述在我國(guó)發(fā)現(xiàn)的4 種炭疽菌外，其他9種炭疽菌均是我國(guó)芒果炭疽病原的首次報(bào)道。目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的芒果炭疽病的病原菌有28 種，其中國(guó)內(nèi)已報(bào)道的有14 種（表1）。

表1 國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的芒果炭疽菌種類、地理來(lái)源及其鑒定所選用的基因Table 1 Species,geographical sources and selected genes of mango anthracnose reported in domestic and abroad

2 芒果采后炭疽病生防菌種類

生防菌是對(duì)寄主無(wú)害而對(duì)病原菌有明顯抑制作用的微生物。用于果蔬采后病害的生防菌主要有細(xì)菌、酵母菌及絲狀真菌。生防細(xì)菌是目前商業(yè)化生防制劑中應(yīng)用最廣泛的類別，與真核生防菌相比，其來(lái)源廣泛，繁殖迅速，但易受殺菌劑影響，且在果蔬加工過(guò)程中容易失活[45]。生防酵母菌一般通過(guò)營(yíng)養(yǎng)、空間競(jìng)爭(zhēng)發(fā)揮拮抗作用，易于定殖，防效譜廣且穩(wěn)定，近年來(lái)已逐漸成為采后病害生物防治的研究熱點(diǎn)[46]。由于生防絲狀真菌在果蔬上較難定殖，因此絲狀真菌往往是通過(guò)人工培養(yǎng)后，利用其發(fā)酵液進(jìn)行生物防治[47]。前人通過(guò)從不同植物的枝葉及生存的土壤中進(jìn)行分離篩選，現(xiàn)已獲得了部分對(duì)芒果采后炭疽病具有一定生防作用的菌株。表2 為目前在芒果采后炭疽病防治中已發(fā)現(xiàn)的生防菌及其作用機(jī)制。

表2 芒果采后炭疽病生防菌種類及作用機(jī)制Table 2 Antagonistic species and mechanisms of mango postharvest anthracnose

2.1 生防細(xì)菌

細(xì)菌種類繁多，繁殖速度快，在植物和環(huán)境中廣泛存在，可人工培養(yǎng)，這些特性對(duì)細(xì)菌占領(lǐng)空間和生存競(jìng)爭(zhēng)十分有利。因此，有關(guān)采后生防細(xì)菌的報(bào)道很多，而芒果炭疽菌生防細(xì)菌主要為芽孢桿菌Bacillusspp.。Balderas-Ruíz 等[54]報(bào)道了從墨西哥芒果樹上分離得到的貝萊斯芽孢桿菌83 能有效控制芒果炭疽病。汪遠(yuǎn)等[48]從紅樹植物秋茄體內(nèi)分離得到解淀粉芽孢桿菌，該菌株對(duì)芒果采后主要病害病原菌C.gloeosporioides具有較強(qiáng)抑制作用，對(duì)采后芒果炭疽病防效達(dá)到60%以上。謝穎等[55]從海南大羽蘚葉片中分離的綠芽孢桿菌對(duì)芒果炭疽病最大抑菌率達(dá)83%。此外，楊苑等[57]對(duì)抗生素溶桿菌進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，抑制率達(dá)53.7%。趙超等[58]從芒果葉片與果實(shí)中分離篩選出C.gloeosporioides的生防菌，發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌對(duì)芒果采后炭疽病防效為80.05%，防效明顯。Hernandez Montiel 等[60]發(fā)現(xiàn)感染海洋細(xì)菌嗜根寡養(yǎng)單胞菌KM02的芒果的炭疽病發(fā)病率降低了89%，病斑直徑減小了92%。

2.2 生防酵母菌

在生防菌中，酵母是控制采后病害的潛力拮抗菌，具有拮抗效果好、抗逆性強(qiáng)、繁殖快速、不產(chǎn)生抗生素、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。許春青[61]發(fā)現(xiàn)，季也蒙畢赤酵母與炭疽菌對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)抑菌帶明顯，該菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)芒果炭疽菌的生長(zhǎng)及其分生孢子的萌發(fā)有抑制作用，對(duì)采后芒果離體葉片的防效達(dá)75%。Tian等[62]研究了美極梅奇酵母對(duì)臺(tái)農(nóng)芒果炭疽病的防治效果，發(fā)現(xiàn)在芒果傷口處接種酵母菌和病原菌，于25 ℃貯藏條件下培養(yǎng)12 d，抑制率達(dá)78.82%。Konsue等[71]研究發(fā)現(xiàn)，Papiliotrema aspenensisDMKU-SP67可以控制膠孢炭疽菌生長(zhǎng)，將炭疽病的發(fā)病率降低了94.1%，與使用苯菌靈效果相當(dāng)。此外，膜醭假絲酵母、漢遜德巴利酵母、東方伊薩酵母等酵母菌也被證明對(duì)芒果炭疽菌有拮抗作用[59-60,63]。

2.3 生防絲狀真菌

除細(xì)菌和酵母菌外，用于采后芒果炭疽病生物防治的生防菌還有絲狀真菌。絲狀真菌來(lái)源豐富，能夠代謝產(chǎn)生多種具有抗性的物質(zhì)，利用其發(fā)酵液防治芒果病害的研究很多，在芒果炭疽病防治中起重要作用。張?jiān)r仙[69]報(bào)道了青霉屬（Penicillium）的瓦克青霉（T-141 株）、特異青霉（Penicillium notatum）和產(chǎn)黃青霉（Peniciuium chrysogenus）能通過(guò)產(chǎn)生青霉素而起到防治芒果炭疽病的作用。黃雪蓮等[67]發(fā)現(xiàn)，綠色木霉菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物及非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物均有抑菌作用，對(duì)芒果炭疽菌的抑菌率達(dá)70%以上。De Los Santos-Villalobos 等[66]報(bào)道了棘孢木霉T8a 在體內(nèi)外均能抑制膠孢炭疽菌，且該菌產(chǎn)生的纖維素酶比幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶更具有生物防治作用。

3 生防菌防治機(jī)理

由于生防菌、病原菌和寄主三者均為活的有機(jī)體，因此三者相互接觸后，會(huì)發(fā)生復(fù)雜的的拮抗、誘抗作用。生防菌對(duì)病原菌抑制作用可分為兩種形式：一是直接作用；二是間接作用。具體防治機(jī)理如圖1所示。

3.1 直接作用

直接作用是生防菌通過(guò)自身或胞外分泌物抑制病原菌，包括營(yíng)養(yǎng)或空間競(jìng)爭(zhēng)、分泌拮抗物質(zhì)、重寄生等。研究表明，生防菌在作用于芒果最初的24 h 內(nèi)可迅速生長(zhǎng)，這個(gè)時(shí)間段主要的作用方式是營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和空間排斥。而生防菌分泌抑制或殺死芒果炭疽菌的代謝物是最常見(jiàn)的防治方式。拮抗物質(zhì)主要包括抗生素、拮抗蛋白或細(xì)胞壁降解酶類。芽孢桿菌是最普遍的生防菌之一，該菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)包括脂肽類抗生素[53]、細(xì)菌素[49]、細(xì)胞壁降解酶及一些未鑒定的拮抗蛋白[48,73]，可以造成芒果炭疽病菌菌絲扭曲、膨大、畸形，從而抑制芒果炭疽病菌的生長(zhǎng)。海洋放線菌發(fā)酵產(chǎn)物分離的化合物會(huì)破壞芒果炭疽病菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。巨大芽孢桿菌的抑菌機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)炭疽菌孢子體內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平及菌絲體內(nèi)丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）含量，破壞其線粒體和細(xì)胞膜而達(dá)到抑菌效果[51]。低毒分枝病毒可能會(huì)下調(diào)與真菌致病力相關(guān)的基因表達(dá)（如銅胺氧化酶和Fe/S 蛋白）來(lái)減弱病原菌的致病性，并抑制其生長(zhǎng)。此外，許春青[61]發(fā)現(xiàn)，季也蒙畢赤酵母能夠吸附到芒果炭疽菌菌絲上，可能存在重寄生作用。

3.2 間接作用

間接作用主要是生防菌通過(guò)自身或分泌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抵御病原的酶或其他活性物質(zhì)。美極梅奇酵母、枯草芽孢桿菌除了與膠孢炭疽菌爭(zhēng)奪碳源和生存空間、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，還能促進(jìn)植物相關(guān)防御酶的活性，如β-1，3-葡聚糖酶（β-1,3-gluca-nase，GLU）和幾丁質(zhì)酶（CHT），它們能破壞芒果炭疽菌的細(xì)胞壁而達(dá)到防治作用[62,74]。任建國(guó)等[70]報(bào)道了鏈霉菌與芽孢桿菌能通過(guò)誘導(dǎo)芒果植株苯丙氨酸解氨酶（Phenylalllanine ammonialyase，PAL）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）和過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）的活性來(lái)提高芒果對(duì)炭疽菌的抗性。此外，熒光假單胞菌也能通過(guò)誘導(dǎo)芒果的抗性來(lái)阻止病原真菌的入侵[57]。

隨著高效生防菌的不斷挖掘及拮抗機(jī)理研究的深入，近年來(lái)已報(bào)道多種實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的菌株。在南非，由枯草芽孢桿菌開(kāi)發(fā)的生防制劑Avogreen 被用于鱷梨炭疽病的防治[75]。美國(guó)開(kāi)發(fā)的生防制劑Blight Ban A506，以熒光假單胞菌作為拮抗菌，對(duì)蘋果、梨和草莓等水果的多種病害具有防治效力[76]。在荷蘭與德國(guó)，以梅奇酵母為主要成分的生防制劑Shemer 被廣泛應(yīng)用于果蔬灰霉病和青霉病的防治[77]。

4 增強(qiáng)生防菌生防效力的途徑

生防菌在芒果采后炭疽病的控制中雖已表現(xiàn)出良好的防效，但活體拮抗菌是生防制劑主要成分，拮抗菌活性及其代謝的酶類易受溫度、pH 和濕度等環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致其防治芒果采后炭疽病的效果不如化學(xué)農(nóng)藥穩(wěn)定。此外，與化學(xué)農(nóng)藥相比，生防菌研發(fā)成本較高，生效慢，使用期限較短，不如化學(xué)農(nóng)藥方便。因此，通過(guò)各種方式提高生防菌的生防效力和穩(wěn)定性，將有助于提高生防制劑的商業(yè)化。研究表明，生防菌配合化學(xué)藥物，生防菌與熱處理結(jié)合，以及通過(guò)基因工程改造措施均能有效提高生防菌防治效力。

生防菌與外源化合物配合使用進(jìn)一步提高生防效力，是目前芒果采后炭疽病防治的研究熱點(diǎn)。這些化合物主要包括低濃度殺菌劑、有機(jī)活性物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽等。Govender 等[50]對(duì)咪鮮胺與生防菌聯(lián)合處理、生防菌單獨(dú)處理在芒果包裝線上防治芒果炭疽病的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理生防效力明顯高于單獨(dú)處理。此外，前人發(fā)現(xiàn)水楊酸、氯化鈣與生防菌配合使用效力提升顯著。低濃度水楊酸（SA）對(duì)拮抗菌和病原菌的生長(zhǎng)影響不大，但對(duì)PPO、PAL、GLU 等相關(guān)防御酶活性有一定誘導(dǎo)作用，可以通過(guò)誘導(dǎo)植物的防御能力，增強(qiáng)生防效力[78]。馮衛(wèi)華等[79]使用1.0 mmol/L 水楊酸與綠色木霉菌聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)該組合對(duì)芒果炭疽病的防效明顯增強(qiáng)。氯化鈣是通過(guò)抑制病原菌的生長(zhǎng)，并在一定程度上促進(jìn)生防菌的增殖和芒果的自身防御力來(lái)提高生防效力。陳敏等[80]發(fā)現(xiàn)，40 g/L CaCl2可有效提升季也蒙畢赤酵母對(duì)芒果采后炭疽病的生防效果，其中40 g/L CaCl2與1×108CFU/mL 季也蒙畢赤酵母懸浮液的復(fù)合處理比單一處理更能有效抑制芒果果實(shí)采后炭疽病的發(fā)生。此外，水楊酸溶液、CaCl2溶液和美極梅奇酵母懸浮液的組合也具有協(xié)同作用，能提高對(duì)芒果果實(shí)病害的控制和貯藏效果[81]。

生防菌與熱處理結(jié)合能提高生防效力，該方法操作簡(jiǎn)單、成本低，是芒果采后炭疽病防治最常用的方式之一。前人發(fā)現(xiàn)，在半商業(yè)條件下，咪鮮胺、芽孢桿菌與熱水聯(lián)合處理防治芒果炭疽病比化學(xué)制劑的效果更好[50]。Jomduang 等[63]報(bào)道了東方伊薩酵母與熱處理結(jié)合可以增強(qiáng)對(duì)芒果炭疽病的防效。此外，對(duì)生防菌進(jìn)行遺傳改造是一個(gè)新的發(fā)展方向。Jones 等[82]將抗菌肽A 的編碼基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisia），轉(zhuǎn)化酵母有效地抑制了刺盤孢的孢子萌發(fā)，并顯著減輕了由該菌引起的番茄炭疽病。然而，目前利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)防治芒果采后炭疽病的研究較少，對(duì)芒果的防治效果有待進(jìn)一步研究，且改造的菌株應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，必須經(jīng)過(guò)后續(xù)的安全驗(yàn)證。

5 總結(jié)與展望

近年來(lái)，人們已經(jīng)從多種途徑中分離出芒果炭疽病生防菌，且其易培養(yǎng)，繁殖快，防效顯著，因此其作為生防制劑的研究?jī)r(jià)值日益受到關(guān)注。目前，生防菌抑菌效果易受環(huán)境影響，且控病機(jī)制還未完全揭示，因此生防菌的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用仍存在較大困難。生防菌與外源化合物聯(lián)用、生防菌配合物理保鮮方式以及生防菌進(jìn)行遺傳改造是其應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)的重要途徑，這不僅可以加強(qiáng)拮抗菌的生防效力和穩(wěn)定性，還可產(chǎn)生保鮮防腐的柵欄效應(yīng)。雖然目前我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)仍是化學(xué)制劑占主導(dǎo)地位，但隨著國(guó)際貿(mào)易條約的限制以及國(guó)家和人民對(duì)環(huán)境污染和食品安全的愈加重視，以拮抗菌為主的生防制劑必將迎來(lái)更快更深入的發(fā)展。