冷藏蠶豆鮮莢優(yōu)勢腐敗菌的分離與鑒定

宋居易，張 欣，劉 暢，陳 惠

（江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 南通 226000）

蠶豆（Vicia fabaL.）系豆科豌豆屬一年生或越年生草本植物，為世界排名第三的食用豆類作物[1]。蠶豆籽粒營養(yǎng)價(jià)值很高[2]，江蘇沿江地區(qū)及滬、浙等地是我國鮮食蠶豆的重要產(chǎn)地[3]，該地區(qū)有食用鮮蠶豆的消費(fèi)習(xí)俗，且市場需求量較大。然而，蠶豆鮮莢的產(chǎn)業(yè)受許多因素的制約（如上市時(shí)間多集中在5月，氣溫較高，不耐貯藏，貨架期短）而難以進(jìn)一步發(fā)展，故短期內(nèi)極易形成供大于求的局面，從而致使銷售價(jià)格過低[4]，農(nóng)民增產(chǎn)不增收。如何延長蠶豆鮮莢貨架期，成為鮮食蠶豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展中需待解決的重要問題。

優(yōu)勢腐敗菌（Dominant spoilage organism,DSO）是指在果蔬采摘、加工、貯藏過程中使其品質(zhì)劣變起主導(dǎo)作用的微生物[5]。蠶豆鮮莢在收獲后，由于溫度、自身所含酶的作用，以及微生物的快速繁殖、入侵導(dǎo)致腐爛，呼吸和蒸騰作用加劇，并產(chǎn)生纖維化現(xiàn)象，使其食用價(jià)值嚴(yán)重降低。目前，關(guān)于蠶豆鮮莢由于受到貯藏溫度[6-7]和自身所含酶（如多酚氧化酶和過氧化物酶等）[8-11]的作用導(dǎo)致品質(zhì)劣變的研究較多，但是關(guān)于蠶豆鮮莢優(yōu)勢腐敗菌的研究報(bào)道較少。優(yōu)勢腐敗菌與蠶豆鮮莢貨架期有很大相關(guān)性，是其質(zhì)量監(jiān)控的重點(diǎn)，因此特定腐敗菌的確定對靶向抑制蠶豆變質(zhì)和延長其貨架期具有較大意義。

前期試驗(yàn)顯示，10 ℃下對蠶豆鮮莢進(jìn)行貯藏保鮮不僅貯藏品質(zhì)較好，而且成本低。因此，本研究從10 ℃貯藏條件下腐敗的蠶豆鮮莢樣品中分離數(shù)量優(yōu)勢的菌株，通過形態(tài)學(xué)結(jié)合16S rDNA 和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）測序法進(jìn)行菌種鑒定，并以菌落總數(shù)和蠶豆鮮莢感官評定為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，研究優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力，旨在為蠶豆鮮莢保鮮技術(shù)的開發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

蠶豆鮮莢：由江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基，北京索萊寶公司；基因組DNA 提取試劑盒，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LS-30 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DNP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCL-1300 型垂直流潔凈工作臺(tái)，北京賽伯樂實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CX41 顯微鏡，日本奧林巴斯公司；GB303 電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蠶豆鮮莢腐敗菌的分離純化

蠶豆鮮莢經(jīng)低聚乙烯袋包裝后，10 ℃下貯藏直至腐敗，參考潘夢詩等[12]的方法取樣分離菌株，將菌液稀釋到合適的濃度，吸取0.1 mL 涂布于相應(yīng)菌株篩選培養(yǎng)基上，放入恒溫箱中培養(yǎng)。待菌落長成后，挑選多而不同的菌落，劃線獲得純化的單菌落，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 腐敗菌的鑒定

采用顯微鏡對篩選的菌株進(jìn)行初步的形態(tài)觀察。采用分子生物學(xué)16S rDNA 和ITS 菌種鑒定的方法，對腐敗菌進(jìn)行鑒定。參照顧春濤等[13]的方法進(jìn)行DNA提取，回收目標(biāo)PCR 產(chǎn)物，測序比對，運(yùn)用Geneious軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 測定項(xiàng)目與方法

1.2.3.1 腐敗菌致腐能力

在經(jīng)消毒處理的操作臺(tái)上，將分離純化后的各菌株活化后，分別制成適宜濃度的菌液，把蠶豆鮮莢分別浮于其中接種，初始接種量均為104～105CFU/g，處理后的蠶豆鮮莢于10 ℃條件下保存。以未接種腐敗菌的蠶豆鮮莢為對照，以菌落總數(shù)和蠶豆鮮莢感官評分為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，研究腐敗菌的致腐能力。

1.2.3.2 菌落總數(shù)

參照GB 4789.2—2016[14]中的方法進(jìn)行測定。

1.2.3.3 感官評定

由6 名有經(jīng)驗(yàn)的人員組成感官評定小組?？偡衷?2 分以下表示蠶豆鮮莢開始腐敗，總分9 分以下表示蠶豆鮮莢不可食用。蠶豆鮮莢感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 蠶豆鮮莢感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria of fresh pods of broad bean

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，利用Origin 9.1 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆鮮莢貯藏過程中腐敗菌的分離結(jié)果

由圖1 所示，采用平板劃線法進(jìn)行分離和純化，共分離出5 株細(xì)菌（B1～B5）和2 株真菌（F1～F2）。

圖1 蠶豆鮮莢10 ℃貯藏條件下的腐敗菌Fig.1 Spoilage microorganism in fresh broad bean pods stored at 10 ℃

2.2 腐敗菌的鑒定結(jié)果

腐敗菌的菌落形態(tài)特征如表2 所示。對5 株細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色后，發(fā)現(xiàn)菌株B1、B2、B3、B4為革蘭氏陰性菌，菌株B5為革蘭氏陽性菌（圖2）。

表2 蠶豆鮮莢腐敗菌的形態(tài)學(xué)特征Table 2 Morphological characteristics of spoilage organism in fresh broad bean pods

圖2 蠶豆鮮莢5 株細(xì)菌（B1～B5）和2 株真菌（F1～F2）顯微形態(tài)圖Fig.2 Micromorphology diagram of 5 strains(B1～B5)of bacteria and 2 strains(F1～F2)of fungi in fresh broad bean pods

結(jié)合分子生物學(xué)方法，對目標(biāo)菌進(jìn)行基因組DNA提取、擴(kuò)增，結(jié)果如圖3 所示。5 株細(xì)菌在1500 bp 左右均出現(xiàn)穩(wěn)定、清晰的較強(qiáng)條帶，說明細(xì)菌均被成功擴(kuò)增。真菌F1和F2在250～500 bp 左右出現(xiàn)較強(qiáng)的目標(biāo)條帶，表明其也被成功擴(kuò)增。

圖3 蠶豆鮮莢腐敗菌的PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretic diagram of PCR products of spoilage organism in fresh pods of broad bean

將上述條帶回收后進(jìn)行序列測序，通過GenBank中的BLAST 軟件進(jìn)行比對，獲得與其同源性較高的相似序列，使用Geneious 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果顯示：B1與成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans），B2與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），B3與韓國假單胞菌（Pseudomonas koreensis），B4與水生拉恩菌（Rahnella aquatilis），B5與高山芽孢桿菌（Bacillus altitudinis），F(xiàn)1與 枝 胞 屬 菌Cladosporium xanthochromaticum，F(xiàn)2與球孢白僵菌（Beauveria bas-siana）的親緣關(guān)系最近，同源性較高。

圖4 蠶豆鮮莢腐敗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of spoilage microorganism in fresh broad bean pods

2.3 優(yōu)勢腐敗菌致腐能力測定結(jié)果

如圖5A 所示，冷藏蠶豆鮮莢接種優(yōu)勢腐敗菌后，菌落總數(shù)均隨著貯藏時(shí)間的延長呈增加趨勢，對照組增加較為緩慢，貯藏4 d 時(shí)，韓國假單胞菌、成團(tuán)泛菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌落總數(shù)均已超過蔬菜初期腐敗所規(guī)定的6.0（lg（CFU/g））[15]，貯藏至第8 天時(shí)，除對照外，其他7 株菌菌落總數(shù)均超過標(biāo)準(zhǔn)[15]。貯藏至第10 天時(shí)，菌株B3、B1、B2、B4、B5、F1、F2的菌落總數(shù)分別達(dá)到8.54、8.07、7.74、7.56、7.02、6.88、6.80（lg（CFU/g）），均高于對照組。

由圖5B 可知，接種7 株菌后的蠶豆鮮莢感官評分均隨貯藏時(shí)間的延長呈下降趨勢，且均低于對照組。貯藏至第6 天時(shí)，接種韓國假單胞菌和成團(tuán)泛菌的蠶豆鮮莢感官評分分別為7.27 分和8.91 分，蠶豆鮮莢已不可食用；第8 天時(shí)，接種不同菌株的蠶豆鮮莢感官評分分別為：嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌7.01 分，水生拉恩菌7.41 分，高山芽孢桿菌8.71 分，枝孢屬菌8.91分，球孢僵白菌8.99 分，均已不可食用；對照組蠶豆鮮莢貯藏至第10 天時(shí)，感官評分為9.87 分，已開始腐敗。結(jié)合圖5A 中的菌落總數(shù)可知，致腐能力較強(qiáng)的腐敗菌為B3、B1、B2和B4，較弱的為B5、F1、F2。

圖5 不同腐敗菌對蠶豆鮮莢菌落總數(shù)（A）和感官評分（B）的影響Fig.5 Effect of different dominant spoilage organism on total colony count(A)and sensory score(B)of fresh pods of broad bean

根據(jù)貯藏腐敗時(shí)的菌落數(shù)量優(yōu)勢和致腐能力較強(qiáng)兩方面確定優(yōu)勢腐敗菌的原則[16]，最終確定B1菌株（成團(tuán)泛菌）和B3菌株（韓國假單胞菌）為10 ℃貯藏條件下蠶豆鮮莢的優(yōu)勢腐敗菌。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)分離得到的數(shù)量優(yōu)勢腐敗細(xì)菌主要為Pantoea agglomerans、Pseudomonas koreensis、Stenotrophomonas maltophilia、Rahnella aquatilis和Bacillus altitudinis。腸桿菌科在新鮮農(nóng)產(chǎn)品中含量豐富[17]，成團(tuán)泛菌為腸桿科菌中的一員，其為新鮮綠豆芽、菠菜和胡椒微生物群的主要成員[18]。Keshria 等[19]在對綠豆芽腐敗菌的研究中發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬、泛菌屬細(xì)菌是其優(yōu)勢腐敗菌。假單胞菌屬是在土壤中發(fā)現(xiàn)的一種高度異質(zhì)性的腐生菌，其包括人類和動(dòng)植物的條件致病菌、有機(jī)物及植被分解者[20-21]。有研究表明[22]，假單胞菌屬成員在蘿卜芽、苜蓿、綠豆和西蘭花芽中含量豐富，如熒光假單胞菌和黃綠假單胞菌[23]。嗜麥芽窄食單胞菌、芽孢桿菌屬和拉恩氏菌屬在其他研究中也是優(yōu)勢腐敗菌[24-26]。而在其他一些研究中，腸桿科菌中的歐文氏菌屬是主要的優(yōu)勢腐敗菌[27-29]。本試驗(yàn)分離得到的數(shù)量優(yōu)勢腐敗真菌為Cladosporium xanthochromaticum和Beauveria bassiana。Cladosporium xanthochromaticum在某些食物中也是常見的優(yōu)勢腐敗菌[30]。

由于在冷藏條件下，細(xì)菌比真菌容易生長，更容易成為優(yōu)勢菌，所以細(xì)菌比真菌更易導(dǎo)致冷藏新鮮蔬菜和瓜果的采后腐敗[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，韓國假單胞菌和成團(tuán)泛菌是冷藏蠶豆鮮莢的優(yōu)勢腐敗菌。韓國假單胞菌和成團(tuán)泛菌腐敗能力強(qiáng)可能是因?yàn)橐韵聝蓚€(gè)原因：①它們可以產(chǎn)生過氧化氫酶、氧化酶（大多數(shù)）和催化蛋白質(zhì)水解和脂解反應(yīng)的酶，從而導(dǎo)致冷藏新鮮產(chǎn)品的腐敗[31]；②它們可以攻破植物防御機(jī)制[32]，利用植物營養(yǎng)素，如果膠酶、聚半乳糖醛酸酶（PG）和果膠甲酯酶（PME）等對植物果膠進(jìn)行降解、液化，進(jìn)而導(dǎo)致植物腐爛。植物組織遭到破壞后，導(dǎo)致更多的細(xì)菌和真菌進(jìn)入，從而加快和加重腐敗。

本研究從在10 ℃條件下放置腐敗的蠶豆鮮莢表面分離得到的數(shù)量優(yōu)勢腐敗菌為Pantoea agglomerans、Stenotrophomonas maltophilia、Pseudomonas koreensis、Rahnella aquatilis、Bacillus altitudinis、Cladosporium xanthochromaticum和Beauveria bassiana。對蠶豆鮮莢的致腐能力大小排序?yàn)镻seudomonas koreensis＞Pantoea agglomerans＞Stenotrophomonas maltophilia＞Rahnella aquatilis＞Bacillus altitudinis＞Cladosporium xanthochromaticum＞Beauveria bassiana。Pseudomonas koreensis和Pantoea agglomerans為10 ℃貯藏條件下蠶豆鮮莢的特定優(yōu)勢腐敗菌。以上結(jié)果可為蠶豆鮮莢生物保鮮技術(shù)的研究提供理論依據(jù)。