QuEChERS-UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定刺梨中11 種農(nóng)藥殘留

姚小龍，韓 磊，劉旭東，羅 躍，吳 瓊，安華明，吳小毛,*

（1.貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省植保植檢站，貴州 貴陽(yáng) 550001；3.貴州省果樹(shù)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025）

刺梨（Tratt.）學(xué)名繅絲花，屬薔薇科薔薇屬植物，又名山王果、刺莓果、佛朗果、茨梨、木梨子，別名刺菠蘿、送春歸、刺酸梨子、刺梨薔薇、九頭鳥(niǎo)、文先果、刺石榴（陜西），是一種稀有的、滋補(bǔ)健身的營(yíng)養(yǎng)珍果。刺梨主要以貴州、四川、云南、湖北、湖南分布面積大，產(chǎn)量多，其中貴州省的野生刺梨分布最多，也是該省特有的優(yōu)勢(shì)資源。刺梨果實(shí)富含多種維生素、氨基酸和微量元素以及胡蘿卜素、有機(jī)酸、黃酮、-谷甾醇、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等，其中，每100 g刺梨果肉中，含VC 2 054～2 725 mg、VP 5 980～12 895 mg、SOD活力32 100 U，遠(yuǎn)超過(guò)獼猴桃、柑橘、樹(shù)莓等水果，是當(dāng)之無(wú)愧的“VC之王”和“三王之果”，也是目前世界上第三代水果之冠。

近年來(lái)，隨著刺梨栽培面積的不斷擴(kuò)大，各種病害如刺梨白粉病、褐斑病、煙煤病、莖腐病、病毒病等，蟲(chóng)害如梨小食心蟲(chóng)、小實(shí)蠅、蚜蟲(chóng)、粉虱、介殼蟲(chóng)等，雜草如馬塘、酢漿草、牛筋草、狗尾草、馬齒莧等病蟲(chóng)草害問(wèn)題逐漸凸顯。雖然中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)并未登記有農(nóng)藥可在刺梨生產(chǎn)上使用，但通過(guò)對(duì)貴州刺梨主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行調(diào)研發(fā)現(xiàn)，果農(nóng)為了保產(chǎn)，常使用苯醚甲環(huán)唑、吡蟲(chóng)啉、吡唑醚菌酯、敵草隆、啶蟲(chóng)脒、多菌靈、腈菌唑、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、醚菌酯、嘧菌酯、三唑酮等殺蟲(chóng)劑、殺菌劑以及除草劑以達(dá)到快速防治病蟲(chóng)草的目的。在即將實(shí)施的GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)中也未規(guī)定有關(guān)刺梨的農(nóng)藥最大殘留限量，所以上述農(nóng)藥在刺梨生產(chǎn)上長(zhǎng)期施用，是否會(huì)有殘留，殘留量多少以及對(duì)刺梨的質(zhì)量安全會(huì)不會(huì)造成影響，都有待研究。因此，有必要開(kāi)展刺梨上常用農(nóng)藥快速分析方法的研究，為刺梨上農(nóng)藥的使用、監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

目前，水果中常用的農(nóng)藥檢測(cè)方法有氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。常用的樣品前處理技術(shù)有QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）法、固相微萃取法、微波萃取法等，其中QuEChERS法從誕生之初就被用作果蔬中農(nóng)藥殘留的前處理方法，由于其快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，逐漸被推廣至更大的檢測(cè)范圍和基質(zhì)中，成為了農(nóng)藥殘留快速前處理技術(shù)的首選。如今QuEChERS法已廣泛應(yīng)用于色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析果蔬中農(nóng)藥殘留的研究。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析刺梨中多種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的研究，但根據(jù)實(shí)際調(diào)研結(jié)果看，有機(jī)氯類(lèi)農(nóng)藥在刺梨生產(chǎn)上并不常用，而且氣相色譜不易分析一些極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性差的農(nóng)藥，所以急需建立一種可靠性高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)范圍廣的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。同時(shí)由于刺梨樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有較多的維生素、SOD、有機(jī)酸以及刺梨苷和黃酮類(lèi)活性物質(zhì)，會(huì)對(duì)農(nóng)藥的提取產(chǎn)生干擾，提取率低，并會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)干擾而對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致刺梨中農(nóng)藥殘留的提取和凈化更復(fù)雜，所以常規(guī)的QuEChERS方法已不能滿(mǎn)足刺梨中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的需求。本研究擬在充分調(diào)研刺梨生產(chǎn)上常用典型農(nóng)藥的基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化QuEChERS前處理方法和測(cè)定條件，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）檢測(cè)，建立一種同時(shí)快速檢測(cè)刺梨中11 種常用農(nóng)藥的多殘留分析方法，能滿(mǎn)足刺梨農(nóng)藥多殘留分析檢測(cè)需求，為刺梨生產(chǎn)上常用典型農(nóng)藥的檢測(cè)、刺梨農(nóng)藥合理使用以及安全性監(jiān)測(cè)工作提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試11 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：苯醚甲環(huán)唑（純度＞98%）、吡蟲(chóng)啉（純度＞98%）、敵草?。兌龋?9%）、啶蟲(chóng)脒（純度＞99%）、多菌靈（純度＞99%）、腈菌唑（純度＞98%）、嘧菌酯（純度＞99%）、三唑酮（純度＞99%） 上海阿拉丁生化科技有限公司；吡唑醚菌酯（純度＞99%）、醚菌酯（純度＞97%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；氯蟲(chóng)苯甲酰胺（純度＞95%） 上海畢得醫(yī)藥科技有限公司。

C（40～60 μm）、-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）（40～60 μm） 天津博納艾杰爾科技有限公司；弗羅里硅土（Florisil）（100～200 目） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB） 上海阿拉丁生化科技有限公司；無(wú)水硫酸鎂（分析純） 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、甲醇、甲酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、冰醋酸（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氨水（分析純） 重慶川東化工有限公司；乙腈（分析純） 上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈（色譜純） 德國(guó)默克公司；甲酸（色譜純）上海麥克林生化科技有限公司；純凈水 娃哈哈集團(tuán)有限公司；0.22 μm濾頭 廣州彼西絡(luò)有限公司；1 mL注射器 江西益康醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司；2 mL樣品瓶美國(guó)Agilent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-MS/MS儀（包括1290 Infinity II超高效液相色譜儀和6470三重四極桿質(zhì)譜儀） 美國(guó)Agilent公司；MS200多管渦旋混勻儀 杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；1-16小型高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；CK2000高通量組織研磨儀 北京托摩根生物科技有限公司；BY-400B型離心機(jī) 北京白洋醫(yī)療器械有限公司；AL104分析天平上海梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱(chēng)取10.0 g經(jīng)粉碎后的刺梨樣品置于50 mL離心管，加入15 mL經(jīng)篩選的提取劑（乙腈）溶液振蕩提取10 min，然后依次加入1.0 g氯化鈉、4.0 g無(wú)水硫酸鎂，振蕩5 min，再4 000 r/min離心5 min。取1.5 mL上清液至裝有150 mg無(wú)水硫酸鎂＋經(jīng)篩選凈化劑（50 mg PSA＋5 mg GCB）的2 mL離心管中，2 000 r/min渦旋3 min，12 000 r/min離心5 min，用1 mL注射器抽取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

11 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品母液（100 μg/mL）：分別準(zhǔn)確稱(chēng)量（精確到0.001 g）11 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解，分別配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液，于4 ℃冰箱冷藏保存。

標(biāo)準(zhǔn)混合溶液（1 μg/mL）：準(zhǔn)確移取11 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)母液各0.1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，于4 ℃冰箱冷藏保存。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)：分別向1 mL容量瓶中加入1、5、10、20、40 μL 1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈定容至刻度，配制成0.001、0.005、0.01、0.02、0.04 μg/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)：分別向1 mL容量瓶中加入1、5、10、20、40 μL 1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用空白樣品提取液定容至刻度，配制成0.001、0.005、0.01、0.02、0.04 μg/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈，洗脫程序見(jiàn)表1；運(yùn)行時(shí)間：5 min。

表1 UPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for UPLC

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：帶有安捷倫噴射流技術(shù)的電噴霧電離源；離子掃描模式：正離子掃描模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式；鞘氣溫度和流速：250 ℃和11.0 L/min；噴嘴電壓：500 V；毛細(xì)管電壓：4 000 V；霧化氣壓力：45 psi；干燥氣溫度和流速：300 ℃和5 L/min；干燥氣、霧化氣、碰撞氣、鞘氣均為高純氮?dú)狻?/p>

1.3.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

1.3.4.1 提取

稱(chēng)取10.0 g勻漿空白刺梨樣品置于50 mL離心管（每個(gè)處理3 個(gè)平行），添加標(biāo)準(zhǔn)物靜置30 min后，加入15 mL提取劑溶液振蕩提取10 min，然后加入1.0 g氯化鈉，4.0 g無(wú)水硫酸鎂，振蕩5 min，然后4 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm檢測(cè)，通過(guò)計(jì)算11 種農(nóng)藥的回收率考察提取效果。接著再以0.1%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、0.1%冰醋酸-乙腈、1%冰醋酸-乙腈、1%氨水-乙腈作為提取劑，考察常用緩沖劑對(duì)農(nóng)藥提取率的影響，實(shí)驗(yàn)步驟同上。

1.3.4.2 凈化

在優(yōu)化的提取條件下，提取完成之后離心，取1.5 mL上清液至裝有150 mg無(wú)水硫酸鎂和不同凈化材料的2 mL離心管中，先2 000 r/min渦旋3 min，再12 000 r/min離心5 min，用1 mL注射器抽取上清液過(guò)0.22 μm濾膜檢測(cè)，通過(guò)計(jì)算11 種農(nóng)藥的回收率考察不同凈化材料對(duì)農(nóng)藥的吸附情況。

1.4 數(shù)據(jù)分析與圖表繪制

所有數(shù)據(jù)均在Agilent公司的MassHunter Data Acquisition 10.0軟件下采集，采用MassHunter Quantitative Analysis 10.0軟件進(jìn)行定量分析，采用Qualitative Analysis 10.0軟件進(jìn)行定性分析，采用Python編程語(yǔ)言配合Matplotlib第三方庫(kù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

優(yōu)化碎裂電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間、加速電壓等儀器條件設(shè)置，篩選能產(chǎn)生高響應(yīng)、特異離子對(duì)的質(zhì)譜條件，采用正離子掃描和MRM模式的方式一針進(jìn)樣完成對(duì)所有目標(biāo)物的檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2，優(yōu)化后11 種農(nóng)藥的MRM定量離子色譜圖如圖1所示。

表2 11 種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters of 11 pesticides

圖1 11 種農(nóng)藥定量離子色譜圖Fig. 1 Chromatograms of quantitative ion pairs of 11 pesticides

2.2 樣品前處理優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 提取

表3 不同提取方法的11 種農(nóng)藥總體回收率Table 3 Total recoveries of 11 pesticides with different extraction methods

考察乙腈、甲醇、乙酸乙酯和二氯甲烷4 種提取劑的提取效率，結(jié)果顯示乙腈的提取效率較其他提取劑好，平均回收率能達(dá)到99%（表3）。從表3可以看出，添加緩沖劑后，11 種農(nóng)藥的平均回收率在63%～74%之間，說(shuō)明在提取劑中加入一些緩沖劑如甲酸、冰醋酸和氨水等并不能提高乙腈的提取率，因此最終確定提取劑為乙腈。

2.2.2 凈化

表4 不同凈化劑凈化后的11 種農(nóng)藥總體回收率Table 4 Total recoveries of 11 pesticides with different sorbents

QuEChERS方法常用凈化材料有C、PSA、Florisil和GCB。C可用來(lái)除脂，PSA可用來(lái)消除各種果蔬的有機(jī)酸、色素及一些糖和脂肪酸，GCB可用來(lái)去除甾體、葉綠素等色素，但對(duì)含苯官能團(tuán)的化合物有較強(qiáng)吸附作用，降低其回收率。因此，本研究考察C、PSA、Florisil和GCB四種凈化材料單獨(dú)使用與組合使用對(duì)待測(cè)物回收率的影響。除PSA外，其他凈化劑均對(duì)少數(shù)農(nóng)藥有一定的吸附，尤其是含GCB的凈化劑影響最大，導(dǎo)致個(gè)別農(nóng)藥回收率偏低（表4）。從表4還可看出，通過(guò)將回收率最高的PSA與不同質(zhì)量的GCB混合使用后發(fā)現(xiàn)，隨著GCB的質(zhì)量減少，回收率不斷上升，當(dāng)GCB質(zhì)量為5 mg時(shí)回收率最為理想，達(dá)到了86%，同時(shí)上清液比只添加PSA的上清液更加澄清。盡管50 mg PSA與5 mg GCB復(fù)合凈化的回收率（86%）不如PSA單獨(dú)凈化高（97%），但沒(méi)有添加GCB凈化劑的樣品含有較多色素，加大了色譜柱和檢測(cè)器被污染的風(fēng)險(xiǎn)，綜合考量，本實(shí)驗(yàn)最終選擇50 mg PSA＋5 mg GCB作為凈化劑。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 線(xiàn)性范圍、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

基于已優(yōu)化的分析條件，用空白刺梨樣品的提取液將1.3.2節(jié)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.02、0.04 μg/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，經(jīng)UPLC-MS/MS測(cè)定后，以每種農(nóng)藥定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，農(nóng)藥基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，11 種農(nóng)藥在0.001～0.04 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（）均大于0.99，以信噪比=3估算檢出限（limits of detection，LOD），以=10確定定量限（limits of quantitation，LOQ），11 種農(nóng)藥LOD為1.31～8.56 μg/kg，LOQ為4.13～43.57 μg/kg，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 11 種農(nóng)藥的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、離子抑制率、LOD及LOQTable 5 Linear equations, correlation coefficients, ion suppression percentages, LODs and LOQs of 11 pesticides

基質(zhì)效應(yīng)是使用LC-MS/MS檢測(cè)殘留應(yīng)盡量避免。參照文獻(xiàn)[41-44]報(bào)道，離子抑制率計(jì)算公式為：

式中：為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率；為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率。

當(dāng)離子抑制率為0時(shí)，表示無(wú)基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)離子抑制率大于0時(shí)，表示樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的測(cè)定存在基質(zhì)增強(qiáng)作用；當(dāng)離子抑制率小于0時(shí)，表示樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的測(cè)定存在基質(zhì)抑制作用。通過(guò)比較11 種農(nóng)藥在刺梨基質(zhì)中的離子抑制率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：刺梨樣品基質(zhì)對(duì)除吡蟲(chóng)啉外的所有農(nóng)藥均是較為顯著的基質(zhì)抑制效應(yīng)（表5），離子抑制率的絕對(duì)值均大于0.1，因此為消除基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的影響，需采取基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行校正。

2.3.2 方法準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果

在刺梨樣品中添加11 種目標(biāo)農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量均分別100、1 000、5 000 μg/kg。由表6可知，11 種農(nóng)藥的平均添加回收率在84.5%～103.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（=6）在1.2%～8.5%之間，方法具有較好的回收率和重復(fù)性，滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留分析的要求。

表6 11 種農(nóng)藥在刺梨中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 6 Recoveries and RSDs of 11 pesticides in spiked R. roxburghii

3 結(jié) 論

建立了同時(shí)檢測(cè)刺梨中11 種常用農(nóng)藥殘留的UPLC-MS/MS方法。該方法靈敏度高、重復(fù)性好，經(jīng)過(guò)系列方法學(xué)驗(yàn)證，11 種常用農(nóng)藥的方法LOD在1.31～8.56 μg/kg之間，LOQ在4.13～43.57 μg/kg之間，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（）在0.991 2～0.999 9之間；平均添加回收率在84.5%～103.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（=6）在1.2%～8.5%之間。該方法準(zhǔn)確、快速、操作簡(jiǎn)單、凈化效果好，對(duì)于推進(jìn)政府監(jiān)管部門(mén)執(zhí)法、提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本、推進(jìn)第三方檢測(cè)市場(chǎng)整體技術(shù)進(jìn)步等具有重要的實(shí)踐意義和社會(huì)效益，可應(yīng)用于刺梨農(nóng)藥使用和安全性監(jiān)測(cè)工作中。