靈芝酸A多克隆抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附測定法的建立

袁耀武，田益玲，李升云，楊心怡，馬曉飛

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001）

靈芝通常是指多孔菌科真菌赤芝或紫芝的子實(shí)體，在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，靈芝是一種名貴的中藥材。由于含有多種功效因子，靈芝往往被加工成干片、粉劑及膠囊等多種保健品，或經(jīng)過提取制成口服液及醫(yī)用注射液等制劑。然而由于生長環(huán)境及品種差異，不同來源的靈芝中各種功效因子含量存在較大差異，再考慮加工條件及人為摻假等因素，使得靈芝保健品市場中各類產(chǎn)品魚龍混雜，質(zhì)量良莠不齊。因此，提供一種能夠衡量靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的快速檢測方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。在靈芝的多種功效因子中，靈芝三萜是其中之一，屬于高度氧化的羊毛甾烷衍生物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易在加工過程中降解。靈芝酸A在靈芝三萜中所占比例最大，是靈芝三萜類標(biāo)志物之一，而且靈芝酸A具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、緩解哮喘及抗疲勞等多種生物學(xué)活性，這些活性基本上能夠體現(xiàn)靈芝在傳統(tǒng)中藥方劑里的功效?；谏鲜鲈颍梢詫㈧`芝酸A作為衡量靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一進(jìn)行精準(zhǔn)測定，從而對靈芝產(chǎn)品質(zhì)量作出快速評估。目前，靈芝酸A的檢測方法有可見光比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜法以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)?？梢姽獗壬ê妥贤夥止夤舛确y定靈芝酸A的缺點(diǎn)是特異性及靈敏度均較低，高效液相色譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的缺點(diǎn)是儀器專業(yè)化程度高，檢測時間和運(yùn)行成本都比較高。與上述方法相比，酶聯(lián)免疫吸附測定法反應(yīng)條件溫和又具有較高的靈敏度，對儀器專業(yè)化要求也不高，在小分子物質(zhì)定量測定中得到了廣泛的應(yīng)用。Sakamoto等利用抗靈芝酸A的單克隆抗體，構(gòu)建了靈芝酸A的酶聯(lián)免疫吸附測定法，該方法用于靈芝酸A測定得到了較高的靈敏度。Yusakul等還嘗試制備抗靈芝酸A的單鏈可變區(qū)片段，用于構(gòu)建靈芝酸A的酶聯(lián)免疫吸附測定法。酶聯(lián)免疫吸附測定法是基于抗原-抗體反應(yīng)的測定方法，特異性抗體是測定的關(guān)鍵因素，單克隆抗體與單鏈可變區(qū)片段具備較高的特異性，但是制備過程較為復(fù)雜，與上述抗體制備技術(shù)相比較，多克隆抗體的制備則相對簡單，然而由于多抗中含有多種獨(dú)特型抗體，靶向分散缺乏特異性，如果包被原選擇不當(dāng)，靶向其他區(qū)域的抗體會影響到小分子目標(biāo)物的檢測。本研究嘗試制備低成本的抗靈芝酸A多克隆抗體，經(jīng)過靶向分析后，選擇合適的包被原，構(gòu)建基于多克隆抗體的靈芝酸A酶聯(lián)免疫吸附測定法并通過對市場中靈芝樣品的測定驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動物

靈芝粉、靈芝孢子粉，來自中國各省市市場。

雞卵清白蛋白、牛血清白蛋白 美國Sigma-Aldrich公司；靈芝酸A 上海源葉生物科技有限公司；酶標(biāo)板廣州潔特生物過濾股份有限公司；羊抗兔IgG-HRP、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）北京索萊寶科技有限公司；四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF） 上海麥克林生化科技有限公司；1-羥基苯并三唑、,-二異丙基碳二亞胺 上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司。

新西蘭大白兔購自河北實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)符合動物倫理要求。

1.2 儀器與設(shè)備

DNM-9602型酶標(biāo)儀 北京普朗新公司；WZ80-2微孔板恒溫振蕩器 杭州佑寧儀器有限公司；1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；0.45 μm有機(jī)微孔濾膜上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 偶聯(lián)蛋白的合成

靈芝酸A與牛血清白蛋白偶聯(lián)物（bovine serum albumin-active ester method-ganoderic acid A，BSAAEM-GAA）的合成：采用活化酯法。取牛血清白蛋白500 mg，用8 mL溶解液（2%碳酸氫鈉溶液∶四氫呋喃＝1∶1）溶解。取靈芝酸A 100 mg、1-羥基苯并三唑140 mg、,-二異丙基碳二亞胺140 mg、四氫呋喃1 mL，以上試劑0～5 ℃攪拌1 h，形成活化酯。取上述活化酯溶液總質(zhì)量的20%至牛血清白蛋白溶液中，室溫反應(yīng)2～4 h。將溶液冷凍干燥48 h得粉末。將粉末用50 mL純化水溶解，0.45 μm濾膜過濾，除去不溶物，收集濾液。將濾液用3 kDa分子質(zhì)量截留的滲透膜滲透10 h，每2 h換純化水1 次。將滲透處理后的溶液再次冷凍干燥72 h，得固體粉末，即為BSA-AEM-GAA。

靈芝酸A與雞卵清白蛋白偶聯(lián)物（ovalbumin-active ester method-ganoderic acid A，OVA-AEM-GAA）的合成：采用活化酯法，與BSA-AEM-GAA的合成方法相同，將雞卵清白蛋白替換牛血清白蛋白即可。

偶聯(lián)物前體BSA-AEM-及OVA-AEM-的合成：與BSAAEM-GAA的合成方法相同，過程中不添加靈芝酸A。

1.3.2 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體的制備

選取健康雄性日本大耳白試驗(yàn)兔兩只，以BSAAEM-GAA作為免疫原，進(jìn)行4 輪免疫接種，每輪接種質(zhì)量濃度為2 mg/mL，每次注射0.5 mL。第1輪接種與弗氏不完全佐劑混合使用，采用皮下多點(diǎn)注射，間隔14 d后進(jìn)行第2、3、4輪免疫接種，采用耳靜脈注射，每輪間隔7 d。第4輪接種7 d后，心臟采血，得到抗靈芝酸A免疫血清，通過A蛋白親和層析柱純化至IgG并濃縮至原始體積，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體總效價的測定

采用間接酶聯(lián)免疫吸附方法對BSA-AEM-GAA多克隆抗體總效價進(jìn)行測定。BSA-AEM-GAA作為包被原，包被質(zhì)量濃度為20 μg/mL。抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體樣本的遞進(jìn)稀釋梯度為1∶5，各稀釋度做3 個重復(fù)孔，1∶100稀釋的陰性樣本作對照。反應(yīng)于微孔板恒溫振蕩器中進(jìn)行，一抗與酶標(biāo)二抗的反應(yīng)條件均為800 r/min、37 ℃、20 min。顯色底物為TMB工作液，顯色時間10 min。終止顯色后，用酶標(biāo)儀在450/630 nm雙波長處測定各實(shí)驗(yàn)孔吸光度。讀值大于或等于0.2，且與陰性孔讀值的比值大于等于2.1的結(jié)果判斷為陽性孔，陽性孔最大稀釋倍數(shù)即為血清效價。

1.3.4 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體的靶向分析

分別以BSA、OVA-AEM-GAA、OVA-AEM-、BSAAEM- 4 種物質(zhì)包被酶標(biāo)板，包被質(zhì)量濃度均為20 μg/mL?？傂r為1∶78 125的抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體用樣品稀釋液1∶100稀釋，分為3 個組：BSA吸收處理組（多抗溶液中加入等量的質(zhì)量濃度為2 mg/mL的BSA溶液，振蕩反應(yīng)1 min）、GAA處理組（多抗溶液中加入等量的質(zhì)量濃度為20 μg/mL的GAA溶液，振蕩反應(yīng)1 min）及未處理組（多抗溶液中加入等量的PBST溶液，振蕩反應(yīng)1 min）。采用間接酶聯(lián)免疫吸附法對多克隆抗體進(jìn)行測定，分析其中抗體的靶向區(qū)域，每組做3 個重復(fù)孔，1∶100稀釋的陰性樣本作對照，其他反應(yīng)條件同于1.3.3節(jié)。

1.3.5 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體中靈芝酸A特異性抗體效價的測定

OVA-AEM-GAA作為包被原，包被質(zhì)量濃度為20 μg/mL，其他操作與1.3.3節(jié)相同。

1.3.6 方法的建立、劑量反應(yīng)關(guān)系曲線的擬合及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

合成抗原OVA-AEM-GAA經(jīng)pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至質(zhì)量濃度20 μg/mL，100 μL/孔包被酶標(biāo)版，37 ℃反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后PBST溶液洗板3 遍。靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品用樣品稀釋液3 倍遞進(jìn)稀釋，分為0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24、72、220、660 μg/L及2 000 μg/L 11 個標(biāo)準(zhǔn)劑量組。分別取50 μL各質(zhì)量濃度的靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入酶標(biāo)版對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)孔中，每個質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品均做3 個孔?？笲SA-AEM-GAA多抗用樣品稀釋液稀釋為靈芝酸A特異性抗體效價為1∶25，向上述各孔中加入多抗溶液50 μL。酶標(biāo)板置于微孔板恒溫振蕩器中，800 r/min、37 ℃反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后PBST溶液洗板3 遍。于上述各孔中加入100 μL 1∶1 000（酶標(biāo)記物體積∶樣品稀釋液體積）稀釋的羊抗兔IgG-HRP（工作效價為1∶500～1∶2 000），置于微孔板恒溫振蕩器中，800 r/min、37 ℃反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后PBST溶液洗板3 遍。于上述各孔中加入100 μL TMB底物工作液，37 ℃反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后上述各孔中加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀在450/630 nm雙波長測定各實(shí)驗(yàn)孔吸光度。計算組內(nèi)重復(fù)孔吸光度的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）計算每一劑量組相對吸光度，相對吸光度/%＝/×100，其中，為某一質(zhì)量濃度靈芝酸A反應(yīng)孔的平均吸光度，為0 μg/L靈芝酸A反應(yīng)孔的平均吸光度。通過Excel工具欄中的數(shù)據(jù)分析選項(xiàng)，進(jìn)行單因素方差分析，確定吸光度與0 μg/L及2 000 μg/L劑量組差異顯著的劑量組，利用與上述兩個劑量組均差異顯著的劑量組數(shù)據(jù)繪制相對吸光度與靈芝酸A質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線，得到回歸方程并計算靈芝酸A的IC、IC、IC及IC。以IC～I(xiàn)C之間質(zhì)量濃度作為該測定方法的線性范圍，以IC對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限。然后將IC與IC之間的質(zhì)量濃度分5 個劑量組，制備靈芝酸A測定的工作曲線。

1.3.7 可重復(fù)性驗(yàn)證與回收率的測定

稱取0.25 g靈芝孢子粉，置于10 mL樣品管中，加入無水乙醇5 mL，浸泡24 h，離心后收集上清液，用樣品稀釋液5 倍遞進(jìn)稀釋，取適當(dāng)稀釋度的試樣液作為待測液，用1.3.6節(jié)建立的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行測定，同時測定靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品，繪制回歸曲線。根據(jù)試樣孔的相對吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得試樣液對應(yīng)的靈芝酸A質(zhì)量濃度再乘以樣品稀釋倍數(shù)則為樣品中靈芝酸A的含量。得到孢子粉中靈芝酸A的含量后，以其含量大約1 倍劑量（70 mg/kg）的靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品加入到靈芝樣品中，同法處理后進(jìn)行5 個批次的測定，得出樣品加標(biāo)回收率。

1.3.8 樣品中靈芝酸A的測定

從市場中收集22 份靈芝粉劑產(chǎn)品：11 種破壁靈芝孢子粉（BGSP1～BGSP11）、6 種靈芝粉（GP1～GP6）及5 種靈芝孢子粉（GSP1～GSP5）。采用1.3.6節(jié)及1.3.7節(jié)樣品處理及測定方法進(jìn)行測定，計算靈芝酸A的含量，并進(jìn)行方差分析。將上述22 種產(chǎn)品采用高效液相色譜法進(jìn)行靈芝酸A測定，對2 種方法的測定結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體總效價的測定結(jié)果

如表1所示，出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度為1∶78 125，效價以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的樣本最高稀釋度表示，因此抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體總效價為1∶78 125，結(jié)果說明免疫原的免疫接種取得了成功?？傂r是衡量動物對免疫原整體應(yīng)答效果的指標(biāo)，并不能反映出針對半抗原的應(yīng)答效果，針對半抗原的應(yīng)答效果需要測定半抗原特異性抗體的效價。

表1 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體總效價的測定結(jié)果Table 1 Result of determination of total titer of polyclonal antibody against BSA-AEM-GAA

2.2 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體的靶向分析

由表2可知，抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體能夠與包被原BSA-AEM-出現(xiàn)陽性反應(yīng)，而與包被原OVA-AEM-反應(yīng)陰性，說明其中不存在靶向圖1中3號位的抗體，但是可能存在靶向圖1中1號位及2號位的抗體，與包被原BSA的陽性反應(yīng)證實(shí)了靶向圖1中1號位抗體的存在。經(jīng)過BSA吸收處理的多抗與包被原BSA的反應(yīng)陰性，但是與包被原BSA-AEM-的反應(yīng)依然陽性，也證實(shí)了靶向圖1中2號位抗體的存在?？笲SA-AEM-GAA多抗與包被原OVA-AEM-GAA出現(xiàn)陽性反應(yīng)，但是與OVA-AEM-呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，因此可以推斷多克隆抗體中存在靶向圖1中4號位或5號位的抗體。經(jīng)過GAA吸收處理的多抗與包被原OVA-AEM-GAA的反應(yīng)陰性，證實(shí)了靶向圖1中5號位抗體的存在，也否定了靶向4號位抗體的存在。因此，在經(jīng)過靶向分析后，明確了抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體中含有靶向BSA、GAA以及BSA與聯(lián)接部結(jié)合點(diǎn)等區(qū)域的抗體。

表2 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體的靶向分析結(jié)果Table 2 Target analysis of polyclonal antibody against BSA-AEM-GAA

圖1 抗偶聯(lián)抗原的多克隆抗體中各獨(dú)特型抗體靶向位置示意圖Fig. 1 Target location of each idiotypic antibody in polyclonal antibody against conjugated antigen

2.3 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗體中靈芝酸A特異性抗體效價的測定結(jié)果

如表3所示，多抗樣本出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度為1∶3 125。由表3可知，以O(shè)VA-AEM-GAA作為包被原，抗BSA-AEM-GAA多抗樣品中只有抗靈芝酸A抗體能夠參與反應(yīng)，因此抗BSA-AEM-GAA多抗中靈芝酸A特異性抗體效價為1∶3 125。靈芝酸A特異性抗體效價與總效價相比明顯降低，但其含量足以用于靈芝酸A的酶聯(lián)免疫吸附測定，說明本實(shí)驗(yàn)對靈芝酸A免疫原的合成獲得成功，其能夠激發(fā)動物免疫系統(tǒng)對靈芝酸A足夠的應(yīng)答強(qiáng)度。

表3 靈芝酸A特異性抗體效價的測定結(jié)果Table 3 Results of determination of titer of specific antibody against ganoderma acid A

2.4 劑量反應(yīng)關(guān)系曲線的擬合及線性分析

按照1.3.6節(jié)方法采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法，靈芝酸A每一劑量組的相對吸光度、組間差異顯著性及CV結(jié)果見表4。選取與0 μg/L及2 000 μg/L劑量組吸光度均表現(xiàn)為顯著差異的劑量組（0.3、0.9、2.7、8.1、24、72 μg/L）數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，表示相對吸光度，表示靈芝酸A質(zhì)量濃度，在對數(shù)函數(shù)模型下，取得較好的擬合效果，回歸方程：＝－15.45ln＋71.424，＝0.988 7。如果軸以靈芝酸A質(zhì)量濃度的自然對數(shù)表示，可以得到線性回歸方程：＝－15.454＋178.17，值相同。計算出靈芝酸A的IC為4.0 μg/L，IC為0.6 μg/L，IC為27.3 μg/L，IC為0.3 μg/L。確定該測定方法的線性范圍（IC～I(xiàn)C）為0.6～27.3 μg/L，檢出限（IC）為0.3 μg/L。經(jīng)過比較，該法用于靈芝酸A的測定比高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法及免疫層析法具有更低的檢出限，與Sakamoto等構(gòu)建的酶聯(lián)免疫吸附測定法相比，檢出限低1 個數(shù)量級，且反應(yīng)用時更短。

根據(jù)線性范圍，將靈芝酸A分為0.6、1.5、4.0、10.5、27 μg/L劑量組，通過間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法，制備出靈芝酸A測定的工作曲線，得到線性回歸方程：＝－16.177＋184.84，表示相對吸光度，表示靈芝酸A質(zhì)量濃度的自然對數(shù)值，值可達(dá)0.996 4，表明該工作曲線具有較高的擬合度。

表4 不同質(zhì)量濃度靈芝酸A的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果Table 4 Results of ic-ELISA for ganoderma acid A at different concentrations

2.5 可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

樣品加標(biāo)前后5 批次實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果見表5，加標(biāo)樣品與不加標(biāo)樣品5 個批次測定結(jié)果的批間CV均小于10%，樣品加標(biāo)回收率在82.9%～118.6%之間，不同批次的測定結(jié)果說明該方法對樣品中靈芝酸A測定具有較好的重復(fù)性，加標(biāo)回收率結(jié)果說明該方法對樣品中靈芝酸A測定具有較高的準(zhǔn)確度。

表5 不同批次實(shí)驗(yàn)測定靈芝酸A含量Table 5 Recoveries and intra-batch coefficients of variation of ganoderic acid A from spiked samples

2.6 實(shí)際產(chǎn)品中靈芝酸A的測定結(jié)果

通過間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法對22 份靈芝粉劑產(chǎn)品的測定結(jié)果見表6。不同品牌靈芝粉劑產(chǎn)品中靈芝酸A含量存在較大的差異，相差可以達(dá)到100 倍以上。進(jìn)一步進(jìn)行數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，不同類別的靈芝粉劑產(chǎn)品之間，靈芝酸A含量的差異顯著性有所不同，其中破壁靈芝孢子粉與靈芝孢子粉的組間差異不顯著（≥0.05），而靈芝粉與破壁靈芝孢子粉及靈芝孢子粉的組間差異極顯著（≤0.01），即便是同一類別的產(chǎn)品，不同品牌間的組間差異性也是極顯著（≤0.01），這種結(jié)果在靈芝粉、破壁靈芝孢子粉及靈芝孢子粉3 類產(chǎn)品中都存在。

表6 不同品牌靈芝粉劑產(chǎn)品中靈芝酸A含量的測定結(jié)果Table 6 Results of determination of ganoderic acid A in different brands of G. lucidum powder

圖2 酶聯(lián)免疫吸附測定法與高效液相色譜法測定比較Fig. 2 Comparison of results of ELISA and HPLC for ganoderic acid A

將上述22 種產(chǎn)品采用高效液相色譜法進(jìn)行靈芝酸A的測定，兩種方法的測定結(jié)果對比圖見圖2。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，酶聯(lián)免疫吸附測定法與高效液相色譜法的測定結(jié)果相比，相關(guān)系數(shù)=0.972，由此可見，本實(shí)驗(yàn)所建立的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法對樣品中靈芝酸A的測定結(jié)果具有較高的可信度。

3 討 論

靈芝保健品市場中，同一類別和相同質(zhì)量的產(chǎn)品，價格可以相差10 倍以上，價格與質(zhì)量相關(guān)性，以及性價比，會讓消費(fèi)者難以抉擇。本研究選用靈芝酸A作為評估靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的檢測指標(biāo)，是考慮到靈芝酸A在不同品種的靈芝中普遍存在，在靈芝三萜中占有比例最大、穩(wěn)定性好，而且其經(jīng)過驗(yàn)證的抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、緩解哮喘及抗疲勞等多種生物學(xué)活性基本上可以代表靈芝的功效。然而，靈芝的功效因子不止一種，某種藥效的作用或許是多種因子共同作用的結(jié)果，所以單獨(dú)用靈芝酸A作為評估靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的指標(biāo)有不完善之處。當(dāng)前靈芝酸A測定還主要是依賴高效液相色譜等專業(yè)化的分析儀器，運(yùn)行成本及技術(shù)要求都比較高，酶聯(lián)免疫吸附測定法是基于抗原-抗體反應(yīng)的測定方法，反應(yīng)條件溫和又具有較高的靈敏度，對儀器專業(yè)化要求也不高，而且能夠開發(fā)出商業(yè)化試劑盒，便于基層的應(yīng)用，所以利用酶聯(lián)免疫吸附法測定靈芝酸A是一個可以考慮的選項(xiàng)。在酶聯(lián)免疫吸附法中特異性抗體是測定的關(guān)鍵因素，如果需要測定的物質(zhì)為半抗原，由于本身沒有免疫原性，半抗原需要與載體聯(lián)接才能合成免疫原獲得抗體，因而在針對小分子半抗原的多克隆抗體中，往往含有多種獨(dú)特型抗體，這些抗體的靶向位置理論上可以分布于免疫原的載體蛋白、載體蛋白與聯(lián)接部的結(jié)合點(diǎn)、聯(lián)接部、半抗原與聯(lián)接部的結(jié)合點(diǎn)及半抗原5 個區(qū)域。在酶聯(lián)免疫吸附測定法中，只有靶向半抗原的抗體才是測定目標(biāo)物所必需抗體，如果包被原選擇不當(dāng)，多抗中靶向其他區(qū)域的抗體與包被原反應(yīng)會影響到測定的靈敏度或者使測定不能開展。在做小分子目標(biāo)物酶聯(lián)免疫吸附測定時，通常是將包被原與免疫原采用不同的載體，往往就能夠得到理想的效果，然而如果多抗中存在靶向與聯(lián)接部有關(guān)的抗體，只更換載體則無法保證實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行，這也是本實(shí)驗(yàn)中遭遇失敗的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，所以多克隆抗體的靶向分析有一定的必要性。在抗體制備技術(shù)中，單克隆抗體與基因工程抗體具有更高的技術(shù)含量，但是在酶聯(lián)免疫吸附測定法中，只要包被原選擇合理或者多抗經(jīng)過適當(dāng)處理，利用多克隆抗體構(gòu)建的測定方法在靈敏度與特異性方面并不低于單抗與基因工程抗體，而且具有更低的成本。

4 結(jié) 論

利用活化酯法合成BSA-AEM-GAA作為免疫原，接種實(shí)驗(yàn)兔獲得了兔抗BSA-AEM-GAA的多克隆抗體，經(jīng)過對多克隆抗體總效價及靈芝酸A特異性抗體效價的測定，證明免疫原的合成及動物免疫接種都獲得了成功。本研究還利用多克隆抗體構(gòu)建了靈芝酸A測定的間接競爭法酶聯(lián)免疫吸附法，對所構(gòu)建測定方法的可重復(fù)性、樣品回收率進(jìn)行測定，結(jié)果證明該方法對樣品中靈芝酸A測定具有較好的可重復(fù)性和較高的準(zhǔn)確度。本研究利用構(gòu)建的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法對市場上22 份靈芝粉劑產(chǎn)品進(jìn)行測定，測定結(jié)果與高效液相色譜法結(jié)果具有較強(qiáng)的相關(guān)性，證明該方法用于靈芝酸A的測定具有較高可信度。上述結(jié)果表明本研究構(gòu)建的方法用于靈芝酸A測定具有可行性，該方法能夠?yàn)殪`芝保健品市場中相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控提供一種輔助手段。