基于碳點(diǎn)分子印跡紙芯片法測定金銀花綠原酸含量

樂 薇，孔京華，劉詩詩，段鳳琪

（武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430065）

金銀花為忍冬科（Caprifoliaceae）植物忍冬（Thunb.）的花蕾，是一種藥食同源的中藥材，廣泛應(yīng)用于中藥制劑和食品行業(yè)。綠原酸是金銀花的主要活性成分，具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等顯著生物活性，其含量是金銀花質(zhì)量控制的常用指標(biāo)之一。綠原酸含量測定方法主要為高效液相色譜法，但該法需要大型精密儀器，在一些條件簡陋的地方并不適用。因此，開發(fā)一種簡便快速適合現(xiàn)場分析的綠原酸含量測定方法很有必要。

微流控紙芯片具有成本低廉、便攜、操作簡單和無需復(fù)雜外部儀器等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛認(rèn)為是快速檢測裝置發(fā)展的主流方向。此方法利用紙張為基底，通過噴蠟打印和絲網(wǎng)印刷等加工技術(shù)，在紙基材料上加工具有一定結(jié)構(gòu)的親/疏水通道，將被測溶液限定在預(yù)設(shè)的親水區(qū)域內(nèi)進(jìn)行檢測。目前已應(yīng)用于食品安全和環(huán)境檢測等領(lǐng)域。

自其被偶然發(fā)現(xiàn)以來，熒光碳點(diǎn)（carbon dots，CDs）已經(jīng)成為一種應(yīng)用廣泛的碳納米材料，具有生物相容性好、光穩(wěn)定性好和制備過程簡單等優(yōu)點(diǎn)，在分析檢測領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。然而，熒光CDs存在抗干擾能力弱及選擇性差等問題。研究表明，將分子印跡技術(shù)與CDs結(jié)合后，可顯著提高熒光CDs的選擇性。因此，本研究利用數(shù)碼成像技術(shù)，結(jié)合熒光CDs的高靈敏度和分子印跡的高選擇性制備紙芯片，并對其進(jìn)行優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)金銀花中綠原酸含量高效、低廉和簡便測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花 湖北羅田縣綠野尚品農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木犀草素、蘆?。兌取?8%） 南京春秋生物工程有限公司；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；中速濾紙 通用電氣生物科技（杭州）有限公司。

3-氨丙基三乙氨基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS） 福晨（天津）化學(xué)試劑廠；-半胱氨酸、酪氨酸、甘氨酸 上海山浦化工有限公司；乙醇、檸檬酸銨、氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；氨水 天津百世化工有限公司；葡萄糖 天津市河北區(qū)海晶精細(xì)化工廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-50E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；JYO2S型紫外分析儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；M-700微波爐 廣東美的微波爐制造有限公司；9 SE智能手機(jī) 北京小米科技有限責(zé)任公司；HP LaserJet 1020plus激光打印機(jī) 惠普科技（北京）有限公司；LC-201A高效液相色譜儀 美國英特矽爾公司。

1.3 方法

1.3.1 濾紙親疏水區(qū)的制備

由繪圖軟件Auto CAD 2014設(shè)計(jì)直徑6 mm圓形陣列式微流控圖案，用激光打印機(jī)將其打印在A4大小的濾紙上，置于170 ℃烘箱加熱固化1.5 h。濾紙上墨粉中的無色聚合物可形成疏水墻，獲得白色區(qū)域的親水區(qū)（檢測區(qū)）和黑色區(qū)域的疏水區(qū)，如圖1所示。

圖1 濾紙親疏水區(qū)微流控圖案示意圖（A）及處理后實(shí)物圖（B）Fig. 1 Schematic diagram of hydrophilic and hydrophobic microfluidic patterns (A) and actual image after treatment (B)

1.3.2 CDs制備及功能化

參考李慧玉方法，以檸檬酸銨和-半胱氨酸為碳源，采用微波法制備APTES修飾的CDs。將2 g（9.6 mmol）檸檬酸銨與1 g（8.3 mmol）-半胱氨酸溶于10 mL超純水，超聲處理2 min后，置于700 W家用微波爐中加熱3 min，得到褐色粉末。加水溶解后，10 000 r/min離心20 min，取上清液。經(jīng)真空干燥得到CDs并稱質(zhì)量。用水溶解并配制成40 mL 10 mg/mL CDs溶液。加2 mL APTES，60 ℃攪拌24 h，得到氨基修飾的CDs。

1.3.3 CDs分子印跡紙芯片制備

將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于一定體積的無水乙醇中，超聲溶解后加入一定體積的功能單體（APTES）及1.3.2節(jié)中氨基修飾的CDs溶液，攪拌10 min。加入一定體積的交聯(lián)劑（TEOS）及50 μL氨水，25 ℃下反應(yīng)10 min，再經(jīng)氮?dú)饷摎?5 min，得到預(yù)聚液。在超聲功率150 W、超聲溫度30 ℃下，超聲輔助聚合反應(yīng)一定時(shí)間。移取10 μL超聲后的預(yù)聚液到濾紙檢測區(qū)中，自然晾干。用無水乙醇漂洗濾紙條，洗去未反應(yīng)的多余試劑；用70%乙醇溶液（/）洗去綠原酸，干燥后即得CDs分子印跡紙芯片。

同時(shí)制備非印跡紙芯片用作對照，除不加綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品外，其余操作相同。

1.3.4 CDs分子印跡紙芯片法的可行性分析

綠原酸溶液制備：準(zhǔn)確稱取50 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，加70%乙醇溶液（/）溶解并定容至50 mL，得到1.0 mg/mL綠原酸溶液。將1.0 mg/mL綠原酸溶液用70%乙醇溶液稀釋1 倍后得到0.5 mg/mL綠原酸溶液。

按1.3.3節(jié)制備CDs分子印跡紙芯片和非印跡紙芯片。綠原酸0.017 5g，無水乙醇6 mL，APTES 71 μL，TEOS 68 μL，CDs溶液1.0 mL，超聲聚合時(shí)間30 min。在紙芯片檢測區(qū)分別加入0、0.5、1.0 mg/mL綠原酸溶液4 μL（0 mg/mL綠原酸溶液為70%乙醇溶液）。顯色20 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片。

1.3.5 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

為提高CDs分子印跡紙芯片測定綠原酸的靈敏度，以顯色斑點(diǎn)的紅（）、綠（）、藍(lán)（）值為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)。優(yōu)化試驗(yàn)中使用的0.15 mg/mL綠原酸溶液以70%乙醇溶液為溶劑。空白組綠原酸點(diǎn)樣體積為0 μL，其余操作與試驗(yàn)組相同。

1.3.5.1 超聲輔助聚合時(shí)間優(yōu)化

按照1.3.3節(jié)制備CDs分子印跡紙芯片。綠原酸0.017 5 g，無水乙醇6 mL，APTES 71 μL，TEOS 68 μL，CDs溶液1.0 mL。在此條件下，考察超聲輔助聚合時(shí)間（5、10、15、20、25、30、35、40 min）對紙芯片制備的影響。在紙芯片檢測區(qū)加入4 μL 0.15 mg/mL綠原酸溶液，顯色20 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片并分析顯色斑點(diǎn)的、、值。

1.3.5.2 無水乙醇添加體積優(yōu)化

按照1.3.3節(jié)制備CDs分子印跡紙芯片。綠原酸0.017 5 g，APTES 71 μL，TEOS 68 μL，CDs溶液1.0 mL，超聲輔助聚合時(shí)間35 min。在此條件下，考察無水乙醇添加體積（3、4、5、6、8、10 mL）對紙芯片制備的影響。在紙芯片檢測區(qū)加入4 μL 0.15 mg/mL綠原酸溶液，顯色20 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片并分析顯色斑點(diǎn)的、、值。

1.3.5.3 模板分子-功能單體-交聯(lián)劑的物質(zhì)的量比優(yōu)化

按照1.3.3節(jié)制備CDs分子印跡紙芯片。綠原酸0.017 5 g，無水乙醇5 mL，CDs溶液1.0 mL，超聲輔助聚合時(shí)間35 min，APTES用量分別為47、71、94、118、140 μL，TEOS用量分別為45、68、90、113、134 μL。在此條件下，考察模板分子-功能單體-交聯(lián)劑的物質(zhì)的量比（1∶4∶4、1∶6∶6、1∶8∶8、1∶10∶10、1∶12∶12）對紙芯片制備的影響。在紙芯片檢測區(qū)加入4 μL 0.15 mg/mL綠原酸溶液，顯色20 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片并分析顯色斑點(diǎn)的、、值。

1.3.5.4 CDs溶液添加體積優(yōu)化

按照1.3.3節(jié)制備CDs分子印跡紙芯片。綠原酸0.017 5 g，無水乙醇體積5 mL，APTES 94 μL，TEOS 90 μL，超聲輔助聚合時(shí)間35 min。在此條件下，考察CDs溶液添加體積（0.8、1.0、1.2、1.5、1.8 mL）對紙芯片制備的影響。在紙芯片檢測區(qū)加入4 μL 0.15 mg/mL綠原酸溶液，顯色20 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片并分析顯色斑點(diǎn)的、、值。

1.3.5.5 點(diǎn)樣體積優(yōu)化

在最優(yōu)制備條件下，按照1.3.3節(jié)制備CDs分子印跡紙芯片。分別在紙芯片檢測區(qū)準(zhǔn)確滴加不同體積（0、1、2、3、4、5 μL）質(zhì)量濃度0.15 mg/mL綠原酸溶液，顯色20 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片并分析顯色斑點(diǎn)的、、值。

1.3.5.6 顯色時(shí)間優(yōu)化

在最優(yōu)制備條件下，按照1.3.3節(jié)制備CDs分子印跡紙芯片。在紙芯片檢測區(qū)準(zhǔn)確滴加4 μL 0.15 mg/mL綠原酸溶液，在不同顯色時(shí)間（5、10、15、20、25、30、35、40、60、120 min）下拍攝365 nm波長處的熒光圖片并分析顯色斑點(diǎn)的、、值。

1.3.6 CDs分子印跡紙芯片測定金銀花中綠原酸含量

1.3.6.1 制備綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及金銀花待測液

準(zhǔn)確稱取25 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，加70%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，得到0.5 mg/mL綠原酸母液。準(zhǔn)確移取不同體積的綠原酸母液，用70%乙醇溶液稀釋分別得到0.025、0.050、0.075、0.10、0.125、0.15 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于CDs分子印跡紙芯片法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

準(zhǔn)確稱取5.00 g金銀花，以70 mL 70%乙醇溶液為溶劑，90 ℃下索氏提取120 min，得到金銀花粗提取液。取1.0 mL粗提取液，用70%乙醇溶液定容至25 mL，得到金銀花待測液。另取12.5 mL金銀花待測液，加70%乙醇溶液定容至25 mL，用于加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.2 熒光圖片獲取及處理

在最佳的CDs分子印跡紙芯片制備條件和顯色條件下，在紙芯片的檢測區(qū)，分別滴加不同質(zhì)量濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和金銀花待測液，室溫下反應(yīng)一定時(shí)間（最佳顯色時(shí)間）。將待測紙芯片水平置于紫外分析儀的暗箱中，在365 nm波長處將智能手機(jī)鏡頭置于紫外分析儀的相機(jī)拍照口，每次拍攝均采用2 倍焦距拍照模式拍照?？瞻捉M綠原酸點(diǎn)樣體積為0 μL，其余操作與實(shí)驗(yàn)組相同。

用Adobe Photoshop CS5.1軟件處理熒光圖片，得到整個(gè)圓形檢測區(qū)、、值的平均值并代入最優(yōu)的濃度擬合方程中，得到金銀花待測液中綠原酸質(zhì)量濃度，并計(jì)算金銀花樣品中綠原酸相對含量：

式中：為金銀花待測液體積/mL；為稀釋倍數(shù)；為金銀花樣品質(zhì)量/mg；為金銀花待測液中綠原酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 高效液相色譜測定金銀花中綠原酸含量

1.3.7.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及金銀花待測液配制

準(zhǔn)確稱取10 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，加75%甲醇溶液（/）定容至100 mL，得到0.1 mg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品母液。量取不同體積綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品母液，分別用75%甲醇溶液配制成0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

取1.3.6.1節(jié)中金銀花粗提取液1.0 mL于100 mL棕色容量瓶中，加75%甲醇溶液定容。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，進(jìn)樣供高效液相色譜檢測。

1.3.7.2 高效液相色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A乙腈＋B 0.1%磷酸溶液（/）；梯度洗脫程序：0～8 min，14%～19% A、86%～81%B；11～22 min，19% A、81% B；23～35 min，19%～31% A、81%～69% B。檢測波長327 nm；柱溫25 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 CDs分子印跡紙芯片測定綠原酸含量的可行性分析

圖2 CDs分子印跡紙芯片（a）和非印跡紙芯片（b）對綠原酸的熒光響應(yīng)Fig. 2 Fluorescence response of molecularly imprinted (a) and nonmolecularly imprinted paper chip (b) to chlorogenic acid

由圖2可知，滴加綠原酸后，CDs分子印跡紙芯片上熒光斑點(diǎn)顏色為藍(lán)色，并且隨著綠原酸質(zhì)量濃度的增加逐漸變淺；而在非印跡紙芯片上熒光斑點(diǎn)為明亮的白色且無明顯變化。這表明CDs印跡紙芯片可以用于檢測綠原酸的含量。其檢測原理推測為在綠原酸分子印跡物的存在下，CDs在365 nm波長的紫外光下顯藍(lán)色熒光，綠原酸分子能被紙芯片上的印跡孔穴特異性識別，吸附的綠原酸與CDs反應(yīng)發(fā)生作用導(dǎo)致熒光斑點(diǎn)顏色發(fā)生變化。

2.2 CDs分子印跡紙芯片制備條件的優(yōu)化

2.2.1 超聲輔助聚合時(shí)間對顯色斑點(diǎn)、、值的影響

由圖3A可知，隨著超聲輔助聚合時(shí)間的延長，空白組顯色斑點(diǎn)的、值基本保持不變，值總體呈緩慢上升的趨勢。對比空白及綠原酸點(diǎn)樣后的、、值的差值（Δ、Δ、Δ），由圖3B可知，超聲輔助聚合30 min內(nèi)Δ、Δ值波動不大，但Δ變化明顯，超聲輔助聚合35 min時(shí)Δ、Δ、Δ最大，之后略微下降并趨于平緩。這是因?yàn)橛≯E聚合物的聚合程度與聚合時(shí)間有關(guān)，時(shí)間過短，聚合度不高，對綠原酸的選擇性不高。時(shí)間延長后由于預(yù)聚液中的CDs分子印跡聚合物充分聚合，對綠原酸吸附性增強(qiáng)，從而與CDs發(fā)生反應(yīng)的綠原酸增多，造成熒光斑點(diǎn)變化明顯。因此，CDs分子印跡紙芯片制備的超聲輔助聚合時(shí)間確定為35 min。

圖3 不同超聲輔助聚合時(shí)間下空白組顯色斑點(diǎn)的R、G、B值（A）和綠原酸點(diǎn)樣組顯色斑點(diǎn)的ΔR、ΔG、ΔB值（B）Fig. 3 R, G and B values of blank samples (A) and ΔR, ΔG and ΔB values of chlorogenic acid samples (B) with different ultrasonic-assisted polymerization times

2.2.2 無水乙醇添加量對顯色斑點(diǎn)、、值的影響

由圖4可知，隨著無水乙醇體積的增加，空白組顯色斑點(diǎn)的值先上升后下降、值變化較小、值緩慢上升；而經(jīng)綠原酸點(diǎn)樣的顯色斑點(diǎn)的Δ、Δ基本出現(xiàn)先增加后下降的趨勢，Δ則呈現(xiàn)先增加后下降再增加的趨勢，在無水乙醇添加量為5 mL時(shí)，Δ、Δ、Δ最大。這是因?yàn)槿軇┻^少時(shí)交聯(lián)劑濃度大使印跡膜的孔隙小，不利于綠原酸的選擇性吸附，而溶劑量過大又使印跡膜難以形成。因此，制備CDs分子印跡紙芯片，無水乙醇的最佳添加量是5 mL，即每0.01 mmol綠原酸添加1 mL無水乙醇。

圖4 不同無水乙醇體積下空白組顯色斑點(diǎn)的R、G、B值（A）和綠原酸點(diǎn)樣組顯色斑點(diǎn)的ΔR、ΔG、ΔB值（B）Fig. 4 R, G and B values of blank samples (A) and ΔR, ΔG and ΔB values of chlorogenic acid samples (B) with different anhydrous ethanol volumes

2.2.3 模板分子-功能單體-交聯(lián)劑物質(zhì)的量比對顯色斑點(diǎn)、、值的影響

由圖5B可知，在聚合體系中，當(dāng)模板分子（綠原酸）、功能單體（APTES）和交聯(lián)劑（TEOS）的物質(zhì)的量比為1∶8∶8時(shí)，綠原酸點(diǎn)樣組顯色斑點(diǎn)的ΔRGB值最大。這是因?yàn)楫?dāng)交聯(lián)劑用量過大時(shí)，聚合度過高，模板不易洗脫，吸附位點(diǎn)被占據(jù)，吸附量下降；而功能單體量過大時(shí)會發(fā)生自身分子聚合，選擇性吸附能力下降。因此，制備CDs分子印跡紙芯片，模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的最優(yōu)物質(zhì)的量比為1∶8∶8。

圖5 不同模板分子-功能單體-交聯(lián)劑物質(zhì)的量比下空白組顯色斑點(diǎn)的R、G、B值（A）及綠原酸點(diǎn)樣組顯色斑點(diǎn)的ΔR、ΔG、ΔB值（B）Fig. 5 R, G and B values of blank samples (A) and ΔR, ΔG and ΔB values of chlorogenic acid samples (B) with different molar ratios of template molecule to functional monomer to crosslinking agent

2.2.4 CDs添加量對顯色斑點(diǎn)、、值的影響

由圖6A可知，隨著CDs添加量的增加，空白組顯色斑點(diǎn)的值基本保持不變，和值呈現(xiàn)下降趨勢。由圖6B可知，經(jīng)綠原酸點(diǎn)樣的顯色斑點(diǎn)的ΔRGB值呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢；CDs溶液添加體積為1 mL時(shí)，ΔRGB值最大。這是因?yàn)楫?dāng)CDs添加量過大時(shí)，背景熒光強(qiáng)度過大，造成綠原酸點(diǎn)樣后熒光強(qiáng)度變化不明顯。因此，CDs的最優(yōu)添加量為1 mL，即每0.01 mmol綠原酸添加0.2 mL CDs溶液。

圖6 不同CDs添加量下空白組顯色斑點(diǎn)的R、G、B值（A）及綠原酸點(diǎn)樣組顯色斑點(diǎn)的ΔR、ΔG、ΔB值（B）Fig. 6 R, G and B values of blank samples (A) and ΔR, ΔG and ΔB values of chlorogenic acid samples (B) with different volumes of CDs solution

2.3 CDs分子印跡紙芯片顯色條件的優(yōu)化

2.3.1 綠原酸點(diǎn)樣體積對顯色斑點(diǎn)、、值的影響

由圖7可以看出，點(diǎn)樣體積≤2 μL時(shí)RGB值標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，這是由于點(diǎn)樣體積過小，溶液未完全覆蓋親水區(qū)，造成顯色不均勻，使、、值重現(xiàn)性下降；點(diǎn)樣體積＞2 μL時(shí)，RGB值基本趨于穩(wěn)定；點(diǎn)樣體積為4 μL時(shí)，RGB值標(biāo)準(zhǔn)偏差最小。因此，綠原酸最佳點(diǎn)樣體積為4 μL。

圖7 不同點(diǎn)樣體積下綠原酸顯色斑點(diǎn)的R、G、B值Fig. 7 R, G and B values of chlorogenic acid samples with different sample volumes

2.3.2 顯色時(shí)間對顯色斑點(diǎn)、、值的影響

由圖8可知，在顯色40 min內(nèi)，隨著顯色時(shí)間的增加，、值變化不明顯；值先上升并在顯色時(shí)間15～25 min時(shí)較為穩(wěn)定，之后呈現(xiàn)緩慢上升趨勢。在顯色時(shí)間40、60、120 min處拍照獲取的、、值變化不明顯，可以推斷該體系熒光能夠較長時(shí)間穩(wěn)定存在，長時(shí)間放置結(jié)果變化較小。綜合考慮顯色穩(wěn)定性和檢測時(shí)長，選擇最優(yōu)顯色時(shí)間為15 min。

圖8 不同顯色時(shí)間下綠原酸顯色斑點(diǎn)的R、G、B值Fig. 8 R, G and B values of chlorogenic acid samples with different color development times

2.4 CDs分子印跡紙芯片法綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在最佳的CDs分子印跡紙芯片制備條件和顯色條件下，滴加不同質(zhì)量濃度綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行拍照（圖9），并讀取顯色斑點(diǎn)的、、值，代入不同的數(shù)學(xué)模型中進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如表1所示。通過比較數(shù)學(xué)模型的決定系數(shù)（），得到最適合的數(shù)學(xué)模型為＝594.28＋154.64，＞0.99，綠原酸質(zhì)量濃度與值呈正相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝594.28＋154.64。繼續(xù)呈梯度增加綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，觀察綠原酸質(zhì)量濃度與值的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)綠原酸質(zhì)量濃度為0.025～0.15 mg/mL，熒光斑點(diǎn)的值與綠原酸質(zhì)量濃度依舊呈線性關(guān)系。對空白溶液進(jìn)行11 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，按照檢出限＝空白測定值標(biāo)準(zhǔn)差的3 倍/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，得到檢出限為0.020 6 mg/mL。

圖9 不同質(zhì)量濃度綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光顯色照片F(xiàn)ig. 9 Fluorescent color images of chlorogenic acid standard solutions at different mass concentrations

表1 不同數(shù)學(xué)模型的擬合情況Table 1 Fitting of R, G and B values to different mathematical models

2.5 共存物質(zhì)對顯色斑點(diǎn)R、G、B值的影響

在綠原酸質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL下，測定了常見金屬離子、葡萄糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和黃酮類化合物對綠原酸熒光顯色斑點(diǎn)、、值的影響。因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)為值，故以值的變化量為考察目標(biāo)，結(jié)果如表2所示。

表2 共存物質(zhì)的顯色斑點(diǎn)G值Table 2 G values of colored spots in the presence of coexisting substances

由表2可知，常見金屬離子（Na、K、Mg、Ca和Zn）、蛋白質(zhì)（牛血清白蛋白）、氨基酸（酪氨酸和甘氨酸）和葡萄糖等對檢測體系影響小；蘆丁和木犀草素等黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量濃度是綠原酸質(zhì)量濃度的3 倍及以下時(shí)，這些黃酮類物質(zhì)對綠原酸含量檢測的影響也可忽略。由于實(shí)際測定中，金銀花待測液的黃酮類物質(zhì)含量很低，因此該檢測體系對金銀花中綠原酸含量測定具有較高的選擇性。

2.6 兩種方法測定金銀花中綠原酸含量對比分析

由表3可知，CDs分子印跡紙芯片法測定綠原酸的相對含量平均值為4.01%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.60%，具有良好的重復(fù)性。CDs分子印跡紙芯片法測定的綠原酸含量與HPLC法測定結(jié)果相近。

表3 CDs分子印跡紙芯片法和高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸含量Table 3 Comparison of results of determination of chlorogenic acid content in honeysuckle by CDs-molecularly imprinted paper chip and high performance liquid chromatography%

2.7 CDs分子印跡紙芯片法測定綠原酸加標(biāo)回收分析

保證綠原酸質(zhì)量濃度在紙芯片法的線性范圍內(nèi)，進(jìn)行加標(biāo)回收分析。由表4可知，CDs分子印跡紙芯片法的樣品回收率在90.77%～102.10%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.10%。

表4 CDs分子印跡紙芯片法測定綠原酸的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Recoveries of CDs-molecularly imprinted paper chip for spiked chlorogenic acid

3 結(jié) 論

結(jié)合CDs的熒光特性和分子印跡技術(shù)的高選擇性，開發(fā)出一種利用紙芯片快速測定金銀花中綠原酸含量的方法。單因素優(yōu)化試驗(yàn)得到CDs分子印跡紙芯片的最佳制備條件：綠原酸、功能單體和交聯(lián)劑物質(zhì)的量比1∶8∶8，每0.01 mmol綠原酸添加1 mL無水乙醇、0.2 mL氨基修飾的CDs溶液，預(yù)聚液超聲輔助聚合時(shí)間35 min。最佳顯色條件：點(diǎn)樣量4 μL，顯色時(shí)間15 min。在上述最優(yōu)條件下，綠原酸質(zhì)量濃度在0.025～0.15 mg/mL時(shí)與其熒光顯色斑點(diǎn)的值呈良好的線性關(guān)系，為0.991 8，測得的金銀花中綠原酸含量與高效液相色譜法測定結(jié)果較接近。CDs分子印跡紙芯片法僅需制備好的紙芯片、紫外燈和智能手機(jī)，直接點(diǎn)樣，即可進(jìn)行檢測。所需試劑量極少、成本低廉且簡便快速，能滿足現(xiàn)場快速測定分析。后續(xù)研究可對此方法靈敏度進(jìn)行提高。