銀基納米合金的抗菌應(yīng)用進展

馬 敏，常江南，楊潤良，杜繼遠，孫 琳，李明雪

(河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,河南 開封475004)

“ESKAPE”超級細菌對人類的健康造成很大的威脅，主要包括多重耐藥(MDR)腸球菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎桿菌和腸桿菌物種等[1]。從1967年開始，MDR肺炎鏈球菌就快速增長，在2000年增長率達到85%[2]。由于不規(guī)范地使用大量抗生素，超過70%的細菌可以抵抗一種以上的抗生素[3]。因此，研究較為新穎的抗菌方法是迫在眉睫的。

貴金屬納米材料因其可調(diào)控的理化特性，所以在臨床上實現(xiàn)了廣泛的抗菌應(yīng)用。其中，具有不同形狀和尺寸的銀納米結(jié)構(gòu)對感染細菌顯示出潛在的應(yīng)用前景[4]。由于銀對核酸、蛋白質(zhì)等細胞內(nèi)外含氮和硫的生物分子具有高親和力，從而影響細胞活動，導(dǎo)致細胞死亡。銀納米結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出尺寸依賴性的抗菌效率。銀納米粒子(Ag-NPs)越小，抗菌效率越高。當(dāng)銀納米結(jié)構(gòu)的尺寸超過40 nm時，內(nèi)吞作用變得困難，生物可利用的Ag+量保持裸露[5]。當(dāng)尺寸相同時，帶正電荷表面的銀納米顆粒比帶負電荷的納米顆粒具有更強的抗菌活性[6]。雖然可以通過控制銀納米結(jié)構(gòu)的尺寸和表面電荷來提高抗菌效率，但由于Ag-NPs的不穩(wěn)定性而容易發(fā)生聚集現(xiàn)象[7]。這種聚集使銀納米材料更少地進入細菌，也減少了細胞間Ag+的含量。而紫外線也會驅(qū)動Ag-NPs的聚集，這是因為銀納米材料的紫外波段和吸收波段之間的光譜重疊，引起了振蕩偶極-偶極相互作用[8]。

1 銀納米合金的抗菌機理

銀納米合金由于其納米粒子可以通過多種配位鍵(包括Ag-N、Ag-S與膜蛋白結(jié)合)附著在細菌表面而廣泛應(yīng)用于抗菌領(lǐng)域。表面帶正電荷的納米顆粒具有強吸收性，有助于納米粒子進入細菌細胞質(zhì)。在細胞質(zhì)中，銀納米合金被氧化并以Ag+的形式釋放。此外，Ag、Au納米合金的內(nèi)源催化也可以產(chǎn)生ROS[12]，直接作用于細菌，實現(xiàn)抗菌的目的。并且，細胞內(nèi)過量ROS會引起一系列的反應(yīng)導(dǎo)致細菌死亡，例如：氧化損傷，氧化應(yīng)激和膜脂過氧化。此外，它還可以破壞細菌的細胞膜使細胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)等成分滲透出來，與銀原子或Ag+進行協(xié)調(diào)作用，導(dǎo)致細胞代謝紊亂。

2 銀納米合金的抗菌效果

銀納米結(jié)構(gòu)的易氧化的特性導(dǎo)致了它們的不穩(wěn)定性和潛在毒性，這一缺點可以通過加入另一種貴金屬來進行改善。例如，在高鹽介質(zhì)中，單層金原子涂層不僅可以提高銀納米片的穩(wěn)定性，而且可以持續(xù)釋放Ag+，增加其抗菌活性。Wang等[13]比較了具有不同Au/Ag比例的金銀納米籠(GSNCs)的抗菌性能，結(jié)果表明金銀納米合金中金含量的增加可以實現(xiàn)較強的抗菌效果。這由于GSNCs表面帶正電荷，導(dǎo)致了細菌細胞壁破壞、細胞膜破裂和損害細胞間活動。然而，它沒有考慮Ag+釋放的差異性。此外，還評估了具有不同Pt比例的Pt/Ag合金納米顆粒的生物效應(yīng)[14]。發(fā)現(xiàn)Pt/Ag合金(10% Pt)對細胞代謝有明顯的不利影響，而Pt/Ag合金(≥50% Pt)與純Ag-NPs相比具有較低的細胞毒性，并且提高了抗菌活性。這些結(jié)果表明提高Pt的含量可以防止銀的氧化和釋放。

Koller等[15]在Au或Ti薄膜上制備Ag點陣列并比較它們的抗菌效果，鈦膜作為對照組。由于犧牲陽極效應(yīng)，Ag-Au薄膜表現(xiàn)出比Ag-Ti薄膜更高的殺菌效果。表明金膜上釋放較多的銀離子和具有更強的殺菌活性(圖1a)。這是因為耦合Au和Ag納米材料，形成Ag為陽極，Au為陰極的原電池結(jié)構(gòu)，促進Ag+的釋放。在原電池結(jié)構(gòu)中，Ag形成合金后失去電子。然而，Ag也可以接受來自其他貴金屬的電子，在它們的界面處形成抗氧化狀態(tài)，這稱為“電子補償效應(yīng)”。這種效應(yīng)與氧化Ag的犧牲陽極效應(yīng)不一樣，它與其他貴金屬轉(zhuǎn)移到Ag的平均電子密度密切相關(guān)[16]。例如，盡管納米片和納米籠都具有核@殼(Ag@Au)結(jié)構(gòu)，但納米片界面處的銀可以接受更多由金層提供的電子。因此，Ag-Au納米片中的電子補償作用比納米籠強。

此外，兩種金屬元素的分布決定抗菌效果。例如，與Ag-NPs相比，共濺射的Ag50Pt50合金不僅具有低細胞毒性而且具有高抗菌活性。也沒有觀察到Ag+釋放的增加，表明犧牲陽極效應(yīng)沒有增強[17]。然而，連續(xù)濺射的Ag-Pt納米片的犧牲陽極效應(yīng)可以提高銀納米片的抗菌活性，這些結(jié)果可以通過不同的分布方式來解釋(圖1b)[18]。連續(xù)濺射的Ag-Pt合金具有清晰的界面，增強了犧牲陽極效應(yīng)。同時，在共濺射Ag-Pt結(jié)構(gòu)中，Pt元素中的電子可以均勻地分裂Ag原子，從而增加電子補償效應(yīng)和降低犧牲陽極效應(yīng)?？傊己玫腁g-Pt結(jié)構(gòu)具有加速Ag+的釋放和抗菌作用。

圖1 用貴元素涂覆后增強Ag+釋放的機制：在Au或Ti薄膜上制備Ag點并比較它們的抗菌效果[15](a)、連續(xù)濺射和共濺射Ag-Pt合金的抗菌效率比較[18](b)

3 銀納米合金的光熱抗菌應(yīng)用

雖然Ag+具有不可逆的殺菌效果，但還有一些新興的銀納米材料耐藥菌株。最初的抗銀菌株存活下來主要是將有毒的Ag+還原為Ag單質(zhì)或通過P型腺苷三磷酸酶或通過化學(xué)滲透的Ag+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白流出銀物種。當(dāng)Ag-NPs長期暴露時，芽孢桿菌和沙門氏菌適應(yīng)了細胞氧化應(yīng)激刺激，表現(xiàn)出銀抗性決定因子(SilB)[19]。銀基納米材料與相應(yīng)的化學(xué)或物理策略相結(jié)合可以增強其抗菌效率。當(dāng)核尺寸小于2 nm時，金屬納米簇(即Ag、Au和Au@Ag納米簇)可表現(xiàn)出對抗多重耐藥菌性。亞納米尺寸賦予了金屬納米團簇快速擴散，細菌容易內(nèi)吞以及模擬氧化酶/過氧化酶特性以產(chǎn)生ROS[20]。此外，大多數(shù)納米團簇在體內(nèi)也具有強而穩(wěn)定的發(fā)光特性，可以追蹤它們與細菌的相互作用以研究抗菌機制。

光熱照射也可以破壞細菌的結(jié)構(gòu)，因為它具有處理時間短、細菌耐藥性可忽略不計等優(yōu)點[21]。這就需要金屬納米材料能有效吸附近紅外光。雖然大小約為40 nm的Au-NPs的SPR峰值位于550 nm處[22]，但它可以通過將金沉積到不同的銀納米結(jié)構(gòu)上來調(diào)整吸附范圍。合金中的銀核部分被氧化，SPR峰值可以轉(zhuǎn)移到NIR區(qū)域[23]。這可以精確地調(diào)控Ag-Au、Ag-Pt和Ag-Pd合金的物理化學(xué)和光學(xué)特性。

對于具有較大尺寸或深度蝕刻的銀核GSNCs，SPR吸光度可以調(diào)控到NIR區(qū)域。在Au框架的形成過程中，Au3+蝕刻了一半的Ag核，從而實現(xiàn)光學(xué)特性。此外，用藥物和熱響應(yīng)相變材料代替原有的Ag核也可以實現(xiàn)可控的藥物釋放[24]。以這種方式將抗生素和光學(xué)特性協(xié)同有利于實現(xiàn)抗菌活性。例如，高度空心的GSNCs可以作為有效的光學(xué)特性來破壞808 nm照射下的細菌膜。而細菌預(yù)處理的巨噬細胞膜涂覆在GSNCs上，顯示出對感染細菌的個性化靶向能力(圖2a)[25]。為了增強抗菌性能，在808 nm照射下具有光學(xué)特性效應(yīng)的GSNCs與達托霉素和抗體相結(jié)合，靶向MRSA表面的葡萄球菌蛋白A。菌種靶向特異性和抗菌肽結(jié)合NIR療法證明了對耐藥性生物膜是有效的(圖2b)[26]。而錨定在GSNCs表面的Dap會在體內(nèi)循環(huán)過程中存在藥物傳遞效率低的問題。雖然這些策略結(jié)合了物理(近紅外輻射)和生化(抗菌肽)手段，但忽略了納米籠內(nèi)銀的殘留。Qin等[27]近期報道了存在半胱胺時銀組分用于感染傷口的治療。除了銀組分的快速釋放外，隨著SPR從可見光(530 nm)到NIR-II(1 064 nm)區(qū)域的轉(zhuǎn)移，半胱胺也可以引起GSNCs的聚集，從而表現(xiàn)出光學(xué)特性。因此，基于光學(xué)特性和Ag+釋放的協(xié)同關(guān)系，提出了一種廣譜抗菌策略來有效治療MDR物種。

圖2 GSNCs包裹的金黃色葡萄球菌膜的示意圖[25](a)和靶向光活化納米結(jié)構(gòu)協(xié)同光熱和抗生素治療金黃色葡萄球菌的機制示意圖[26](b)

4 具有高抗菌活性的多孔Ag-Pt和Ag-Pd合金

Pt或Pd納米材料是最有前景的抗菌劑，因為它們可以在氧化Ag模板上原位催化產(chǎn)生ROS以干擾細菌的代謝[28]。使用Pt或Pd基納米材料來加速H2O2轉(zhuǎn)化為對致病菌有毒的羥基自由基(·OH)來實現(xiàn)抗菌目的。

用硝酸對不同Pt/Ag比率的Pt/Ag-NPs進行了Ag合金的蝕刻。在酸性環(huán)境中存在H2O2時所獲得的多孔Pt50Ag50結(jié)構(gòu)具有與ORR抗菌效率有關(guān)的酶模擬活性(圖3a)[17]。雖然Pt50Ag50具有易蝕刻性質(zhì)，但其他Pt/Ag比值的合金效率較低，這是由于Pt75Ag25中的Pt屏障以及Pt25Ag75中Pt不足。對于Ag-Pd合金，Gao等[29]合成了具有不同Pd含量的核@殼合金納米籠。選擇AgPd0.38合金作為導(dǎo)管的涂層添加劑，能夠抑制生物膜形成(圖3b)。AgPd0.38納米籠利用細胞內(nèi)的H2O2和O2產(chǎn)生表面結(jié)合的ROS，毒性作用限制在20～200 nm。而納米籠表面產(chǎn)生的ROS對宿主哺乳動物細胞表現(xiàn)出裸露的毒性，會對病原菌造成有效損傷。

圖3 氧化酶樣AgX(X=Pt(a)或Pd(b))合金產(chǎn)生活性氧以對抗病原體

在Pt-Ag合金中，Pt和Ag原子是交錯分布的，沒有明確的邊界。因此，在蝕刻Ag核后形成多孔結(jié)構(gòu)，提高了表面積與體積的比率。然而，Pd-Ag納米籠是通過GR反應(yīng)產(chǎn)生的，形成清晰的核殼結(jié)構(gòu)。而且Pd-Ag納米籠中的Ag核容易氧化和釋放，留下薄而多孔的Pd壁。因此，銀被認為是產(chǎn)生多孔結(jié)構(gòu)的理想模板，但它也可以被其他元素取代。例如，Pt-Pd核框架納米晶體分兩步制備，即Pt原子的選擇性生長和FeBr3對Pd原子的化學(xué)蝕刻。這種納米晶體結(jié)構(gòu)提供了特別活躍的小平面和大表面積，通過過氧化物的酶活性將H2O2分解為·OH，表現(xiàn)出優(yōu)異的殺菌效率。

5 結(jié)論與展望

多重耐藥性的出現(xiàn)導(dǎo)致細菌對經(jīng)典抗生素的有效性下降，需要尋找新的抗菌策略[30]。雖然銀納米材料在臨床上得到應(yīng)用，但它仍然面臨著許多問題，尤其是抗銀病原體的出現(xiàn)。這主要是由于銀納米材料的不穩(wěn)定性削弱了Ag+在感染部位的釋放和積累，使Ag+的含量低于最低殺菌濃度。通過涂覆更惰性的金屬形成合金，可以更好的提高穩(wěn)定性，同時這種涂層可以控制Ag+釋放來達到增強抗菌的目的。盡管銀合金納米材料表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，可以作為治療MDR的潛在抗生素，但仍然有許多工作需要進一步改進，特別是在臨床應(yīng)用方面。因此有必要對其抗菌機制、細胞毒性和可調(diào)控的理化性質(zhì)等進行更深入系統(tǒng)的研究，為制備高效、低毒、低生產(chǎn)成本的新型抗菌材料提供理論指導(dǎo)。