烏梅聯(lián)合抗菌藥物對(duì)豬大腸桿菌分離株的體外抑菌效果的研究

謝.江.吳健敏.陸有飛*.任春芝.梁珠民

（1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，廣西 南寧 530007；2.廣西獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001）

仔豬腹瀉是養(yǎng)豬業(yè)中最常見病癥，致病因素多種多樣，包括營養(yǎng)性、病毒性和細(xì)菌性感染等。其中大腸桿菌感染是公認(rèn)引起仔豬黃白痢的主要病因。大腸桿菌是一種條件致病菌，感染后主要引起嚴(yán)重的腹瀉和發(fā)熱，導(dǎo)致仔豬脫水休克死亡。不同飼養(yǎng)水平豬場仔豬黃白痢發(fā)病率、死亡率差異較大。有效控制大腸桿菌感染，可大幅減少仔豬黃白痢引起的死亡，減少經(jīng)濟(jì)損失。由于大腸桿菌血清型眾多，變異大，抗原復(fù)雜，現(xiàn)有疫苗預(yù)防效果不佳，因此對(duì)大腸桿菌的控制目前仍然主要依靠抗菌藥，但是抗菌藥使用不當(dāng)不僅會(huì)增加飼養(yǎng)成本，而且還可能因耐藥造成治療效果不佳。近年來，大量調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)廣西地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥性情況較為嚴(yán)重，因此開展有針對(duì)性藥物篩選及抗菌素的聯(lián)合用藥以提高治療效果，降低治療費(fèi)用具有十分重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

烏梅別名酸梅，為薔薇科植物梅［（Sieb.）Sieb.et Zucc.］的干燥近成熟的果實(shí)，是我國傳統(tǒng)中藥材之一，為藥食同源植物。中醫(yī)將其用于治療久痢，因?yàn)槠涠嘁怨矸莩霈F(xiàn)在市場，所以藥用價(jià)值長期被人們忽略。近年來多數(shù)學(xué)者研究已證實(shí)其具有良好的抗菌作用，對(duì)大腸桿菌、葡萄球菌等多種致病菌有良好的抑制效果，但少有關(guān)于烏梅與抗菌藥物聯(lián)合用藥的報(bào)道。加大對(duì)中藥的研發(fā)力度，篩選出具有優(yōu)良抗菌效果的中草藥替抗產(chǎn)品，或中西藥聯(lián)合應(yīng)用是動(dòng)物疫病防治的一條新思路。本項(xiàng)目研究烏梅聯(lián)合抗菌藥物對(duì)廣西某豬場多重耐藥大腸桿菌分離株的體外抑菌試驗(yàn)，旨在研究中藥烏梅的獸醫(yī)臨床用途，為仔豬黃白痢的治療方案提供更多的參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)菌株

豬大腸桿菌分離株，血清型為O124，分離自廣西某豬場發(fā)生腹瀉病死哺乳仔豬，由廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)分離鑒定并保存。此豬場連續(xù)發(fā)生仔豬腹瀉，更換多種抗菌藥物治療，效果不佳。

1.2 試驗(yàn)藥品

1.2.1 中藥及炮制

烏梅購于老百姓大藥房。干燥烏梅去核，果肉粉碎，稱取烏梅肉粉75 g置于砂鍋中，加入蒸餾水1000 mL，武火加熱煮沸后，用文火煎煮30 min，隨后趁熱過濾，所得藥液濃縮成500 mL，得到烏梅水提物，以生藥計(jì)，濃度為150 mg/mL，置冰箱4℃保存。

雞膽汁采自宰殺新鮮雞膽，無菌采取膽汁液，置冰箱4℃保存。

1.2.2 試劑及抗菌藥物

營養(yǎng)肉湯購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司，藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司，痢菌凈購于鄭州德寶精細(xì)化工有限公司，硫酸小檗堿購于陜西夏州生物科技有限公司，TMP購于壽光富康制藥有限公司，恩諾沙星購于浙江新昌制藥廠，硫酸慶大霉素購于湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司，均在有效期內(nèi)。

1.3 試驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀、超凈工作臺(tái)、蒸汽消毒鍋、自動(dòng)雙重純水蒸餾器、電熱恒溫干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、無菌96孔板、微量移液器、電子分析天平。

1.4 培養(yǎng)基的制備

依據(jù)《獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，按常規(guī)方法制備營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌液的制備

將大腸桿菌分離株接種麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h后，挑取典型菌落接種營養(yǎng)肉湯，37 ℃增菌培養(yǎng)18 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上測定菌液活菌數(shù)，再將菌液做10倍系列稀釋為每毫升含1×10個(gè)活菌。

1.6 藥液的制備

精確量取1.2.2項(xiàng)各抗菌藥物，用滅菌雙蒸水現(xiàn)配現(xiàn)用。痢菌凈終濃度為0.4 mg/mL，硫酸小檗堿終濃度為40 mg/mL，TMP終濃度為4 mg/mL，恩諾沙星終濃度為25 mg/mL，硫酸慶大霉素終濃度為1.6 mg/mL。

1.7 烏梅藥敏紙片的制備

烏梅藥敏紙片的制備：在無菌條件下吸取1 mL烏梅水提物加入裝有50片滅菌空白藥敏紙片的青霉素瓶中，用牛皮紙密封瓶口，浸泡2 h，待藥液被紙片充分吸凈后烘干，-20℃保存?zhèn)溆?。其它藥敏紙片為商品化藥敏紙片?/p>

2 試驗(yàn)方法

2.1 紙片法抑菌試驗(yàn)

無菌取分離株菌液涂布至瓊脂板，均勻的貼上藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)24 h，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）頒布的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷。

2.2 單藥最低抑菌濃度（MIC）測定

1.6項(xiàng)中各種藥物均采用微量肉湯二倍稀釋法測定單藥最低抑菌濃度。首先在無菌96孔板每一孔中均加入50 μL營養(yǎng)肉湯，再在每一行的第1孔中加入50 μL配制好的藥物原液進(jìn)行倍比稀釋，稀釋至第11孔棄去50 μL，第12孔為無藥對(duì)照孔，最后各孔均加入50 μL 稀釋好的1.5項(xiàng)菌液。振蕩混勻，加蓋置37 ℃孵育10~14 h后觀察結(jié)果。單藥最低抑菌濃度判定方法：無細(xì)菌生長的稀釋孔所含藥物濃度即為該藥大腸桿菌分離株的MIC。

烏梅水提物（150 mg/mL）和雞膽汁也按上述方法測定其對(duì)大腸桿菌分離株的MIC。

2.3 棋盤法聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

根據(jù)MIC測定結(jié)果，用營養(yǎng)肉湯將1.6項(xiàng)各藥液及烏梅水提物分別配成MIC的2倍、1倍、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32工作液各5 mL；將雞膽汁原液 配 制 成 1倍、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64工作液各5 mL。將烏梅分別與痢菌凈、硫酸小檗堿、TMP、恩諾沙星、硫酸慶大霉素、雞膽汁進(jìn)行聯(lián)合抑菌試驗(yàn)，每個(gè)無菌96孔板做一個(gè)組合，兩種藥物的稀釋分別在無菌96孔板上按橫列和縱列進(jìn)行聯(lián)合。操作方法如下：取50 μL烏梅水提物MIC的2倍、1倍、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32工作液，依次加入無菌96孔板的第2、3、4、5、6、7、8列；取50 μL各試藥不同稀釋度工作液，濃度由高到低依次加入無菌96孔板的第B~H行的第1~8孔，第12孔為無藥對(duì)照孔，除無藥對(duì)照孔外，各孔均加入50 μL稀釋好的1.5項(xiàng)菌液；另設(shè)只加菌液和營養(yǎng)肉湯為陽性對(duì)照孔，只加營養(yǎng)肉湯為陰性對(duì)照孔。同樣方法進(jìn)行烏梅與雞膽汁的棋盤試驗(yàn)。

振蕩無菌96孔板使之混合均勻，加蓋置37 ℃孵育10~14 h后觀察結(jié)果。聯(lián)合抑菌試驗(yàn)的判定方法：以部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)作為依據(jù)，F(xiàn)IC指數(shù)＞2為兩藥拮抗，1＜FIC指數(shù)≤2為兩藥無關(guān)，0.5＜FIC指數(shù)≤1為兩藥相加，F(xiàn)IC指數(shù)≤0.5為兩藥協(xié)同。

FIC指數(shù)=（A藥聯(lián)合時(shí)的MIC/A藥單獨(dú)時(shí)的MIC）+（B藥聯(lián)合時(shí)的MIC/B藥單獨(dú)時(shí)的MIC）

3 結(jié)果與分析

3.1 紙片法抑菌試驗(yàn)結(jié)果

紙片法抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可見該菌株對(duì)150 mg/mL烏梅和75 mg/mL烏梅中度敏感，18.75 mg/mL烏梅低度敏感，表明烏梅對(duì)本臨床分離株大腸桿菌有較好的抑菌作用。從抗菌素檢測結(jié)果看，該菌株對(duì)哌拉西林、頭孢拉定、頭孢曲松、多西環(huán)素、卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素等中度敏感，對(duì)氧氟沙星低度敏感，對(duì)青霉素、羧芐西林、頭孢氨芐、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、克林霉素、新霉素等藥物耐藥，說明該臨床分離株為多重耐藥菌株，與豬場臨床使用多種抗菌藥物進(jìn)行治療效果不佳表述相符。

表1 紙片法抑菌試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

3.2 單藥最低抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果

單藥最低抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果見表2。從單獨(dú)使用各種藥物的抑菌結(jié)果看，痢菌凈、恩諾沙星、硫酸慶大霉素的MIC較低，本菌株對(duì)這些藥物敏感，可作為該場治療的首選藥物。TMP和硫酸小檗堿對(duì)大腸桿菌分離株的MIC較高，抑菌作用不如上述3種藥物。烏梅對(duì)大腸桿菌分離株的MIC為9375 μg/mL，表明對(duì)該菌株具有一定的抑制作用。雞膽汁無抑制作用。

表2 單藥最低抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果

3.3 棋盤法聯(lián)合抑菌試驗(yàn)結(jié)果

棋盤法聯(lián)合抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表3，在棋盤法體外大腸桿菌抑制實(shí)驗(yàn)中，烏梅與TMP、痢菌凈聯(lián)合用藥呈現(xiàn)相加作用，TMP、痢菌凈對(duì)大腸桿菌分離株的MIC分別降至1/2、1/4，烏梅對(duì)本分離株的MIC也降至1/2，表明烏梅與TMP、痢菌凈聯(lián)合用藥能起到增效作用；但烏梅與硫酸慶大霉素、硫酸小檗堿、恩諾沙星聯(lián)合用藥呈拮抗作用。

表3 棋盤法聯(lián)合抑菌試驗(yàn)結(jié)果

4 小結(jié)與討論

抗菌藥物過度使用、濫用，導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)已成為養(yǎng)殖業(yè)的一大危害。本試驗(yàn)分離的大腸桿菌，對(duì)獸醫(yī)臨床上常用的抗菌藥物如青霉素、羧芐西林、頭孢氨芐、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、克林霉素、新霉素等均耐藥，是一株多重耐藥菌株，導(dǎo)致臨床用藥效果不佳。因此，在獸醫(yī)臨床上用藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物進(jìn)行治療是很有必要的。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，烏梅水提液對(duì)本試驗(yàn)分離的多重耐藥菌株的MIC為9375 μg/mL，說明烏梅對(duì)大腸桿菌具有一定的抑制作用，這與同類研究報(bào)道相符，可能與烏梅中酚類化合物、有機(jī)酸等有效成分對(duì)腸道細(xì)菌的抑制作用有關(guān)。從已有的報(bào)道看，黃柏（0.5 g/mL）、穿心蓮（1 g/mL）、淫羊藿（62.5 g/mL）、含珠草（0.5 g/mL）、透骨草（0.125 g/mL）、蒲公英（0.25 g/mL）等水提物對(duì)大腸桿菌的MIC均高于烏梅水提物，說明烏梅對(duì)大腸桿菌的抑制作用更強(qiáng)。

痢菌凈、硫酸小檗堿、恩諾沙星、硫酸慶大霉素都是腸道細(xì)菌感染常用藥物，TMP為腸道不易吸收的抗菌藥物，通常作為磺胺類藥物和其他藥物的抗菌增效劑，也有對(duì)中藥抗菌增效作用的報(bào)道，因此本試驗(yàn)選擇上述藥物進(jìn)行聯(lián)合抑菌試驗(yàn)。棋盤法聯(lián)合抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，烏梅水提物與抗菌藥物聯(lián)用有選擇性的增強(qiáng)作用。與硫酸慶大霉素、硫酸小檗堿、恩諾沙星聯(lián)合應(yīng)用時(shí)呈拮抗作用，與痢菌凈、TMP聯(lián)合應(yīng)用時(shí)呈現(xiàn)相加作用，與TMP對(duì)中藥有抗菌增效作用的報(bào)道相符。因此在臨床治療上可推薦為首選用藥。

本試驗(yàn)嘗試用烏梅水提物與雞膽汁聯(lián)合對(duì)大腸桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示也呈相加作用。

在細(xì)菌對(duì)常用藥物耐藥性普遍提升的環(huán)境下，聯(lián)合用藥是解決仔豬腹瀉臨床用藥效果不佳的常見途徑。因此尋找對(duì)多重耐藥大腸桿菌有抑制作用且對(duì)藥物抗菌效果有協(xié)同或相加作用的中藥，制備出廉價(jià)高效的中西復(fù)方制劑，或?yàn)榕R床聯(lián)合用藥提供有效治療方案也是今后的研究趨勢。烏梅除具備來源廣泛、藥食同源、綠色無殘等優(yōu)勢外，在大腸桿菌性腹瀉治療中，將會(huì)有非常好的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步的研究價(jià)值。