響應(yīng)面法優(yōu)化雞肝發(fā)酵工藝

馬晶晶，吳瑀婕，李 良，黃 瑾，楊 靜,3，楊 彪,3，鄒 燁,*，王道營(yíng),*，徐為民

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

作為全球第二大肉雞生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，2021年我國(guó)肉雞總產(chǎn)量為1 998.1 萬(wàn)t。雞肝是雞屠宰加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)品之一，因此每年會(huì)產(chǎn)生大量雞肝。雞肝中蛋白質(zhì)的含量約占總成分的20%，與禽肉中的蛋白質(zhì)含量接近，同時(shí)還具有平衡的氨基酸比例結(jié)構(gòu)，富含VA、VB、VB、VE、鐵、硒等維生素及微量元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，對(duì)人體健康有益。然而，由于雞肝具有較重的腥苦味，在普通醬鹵過(guò)程中難以去除，較難被消費(fèi)者接受，且雞肝的膽固醇含量較高，多食對(duì)健康無(wú)益，大多數(shù)雞肝以鮮銷或僅經(jīng)簡(jiǎn)單加工以動(dòng)物飼料的形式被利用，精深加工利用率并不高，造成大量?jī)?yōu)質(zhì)資源的浪費(fèi)。

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌，屬于厭氧或兼性厭氧菌。其中植物乳桿菌（）是一種廣泛分布于自然界、動(dòng)物腸道及眾多發(fā)酵食品中的乳酸菌。鑒于其多種益生活性，植物乳桿菌在食品工業(yè)、飼料生產(chǎn)和臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著不可替代的作用。研究表明，植物乳桿菌能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量酸類物質(zhì)，使體系pH值下降至較低水平，從而抑制部分腐敗菌和雜菌的生長(zhǎng)，這些酸類同時(shí)也是風(fēng)味成分的前體物質(zhì)，能與醇類反應(yīng)生成酯類物質(zhì)，有利于促進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味的形成。

雞肝蛋白質(zhì)含量較高，可為乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。雞肝中的蛋白質(zhì)在微生物和酶的共同作用下降解為小肽和游離氨基酸等低分子質(zhì)量產(chǎn)物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高。隨著全球人口快速增長(zhǎng)，對(duì)食物資源尤其是蛋白質(zhì)資源的需求正不斷增加，開(kāi)展雞肝副產(chǎn)物綜合利用的研究具有十分重要的意義，有利于提升對(duì)優(yōu)質(zhì)食物資源的綜合利用，為畜禽屠宰加工業(yè)的持續(xù)發(fā)展提供強(qiáng)有力的保障。

本研究以雞肝為原料，從植物乳桿菌LP1、發(fā)酵乳桿菌（）LF1、枯草芽孢桿菌（）BS1中選擇植物乳桿菌對(duì)雞肝進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)優(yōu)化得到植物乳桿菌發(fā)酵雞肝的最佳工藝，并測(cè)定雞肝發(fā)酵前后游離氨基酸的變化，為利用發(fā)酵雞肝制備寵物食品提供理論依據(jù)，拓展雞肝副產(chǎn)物的綜合利用思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮六和雞肝，購(gòu)于南京孝陵衛(wèi)菜市場(chǎng)。放置于冰柜中冷凍保存。植物乳桿菌LP1、發(fā)酵乳桿菌LF1、枯草芽孢桿菌BS1均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所畜禽加工實(shí)驗(yàn)室保藏。

MRS液體培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、氫氧化鈉（分析純） 四川西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PTX-FA210S電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司；Five Easy Plus pH計(jì) 梅特勒-托利多（上海）有限公司；Zealway GI54DWS滅菌器 致微儀器有限公司；超凈操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZQZY-75BS振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；T-25數(shù)顯勻漿機(jī)德國(guó)IKA公司；Gen5全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；L8900氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將冷凍的新鮮雞肝置于室溫解凍，解凍后用流水清洗，剔除肝葉表面的苦膽和經(jīng)絡(luò)，然后放入料理機(jī)中勻漿（勻漿15 s，間隔10 s后再次勻漿15 s，重復(fù)勻漿3 次），將勻漿后的雞肝用無(wú)菌均質(zhì)袋分裝，放置在-20 ℃冰箱冷凍備用。

1.3.2 雞肝發(fā)酵準(zhǔn)備

稱取勻漿后的雞肝20 g至250 mL錐形瓶中，加入適量蒸餾水，調(diào)節(jié)漿液pH值，按照錐形瓶中的雞肝質(zhì)量加入適量葡萄糖，混合均勻，于121 ℃滅菌15 min，得到無(wú)菌雞肝發(fā)酵培養(yǎng)基，備用。

1.3.3 發(fā)酵劑菌種的選擇

從實(shí)驗(yàn)室提供的植物乳桿菌LP1、發(fā)酵乳桿菌LF1和枯草芽孢桿菌BS1中選擇一種作為發(fā)酵劑。

1.3.3.1 菌種活化及培養(yǎng)

參照王夢(mèng)曼等的方法，稍作修改。將植物乳桿菌LP1、發(fā)酵乳桿菌LF1以2%（/）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h；枯草芽孢桿菌BS1以2%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。確定發(fā)酵菌株后，轉(zhuǎn)接2 代恢復(fù)活力，培養(yǎng)至活菌數(shù)為10CFU/mL，于4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，棄去上層液體培養(yǎng)基，沉淀的菌泥用同體積的無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次，將菌懸液于4 ℃保存，備用。

1.3.3.2 生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸曲線的測(cè)定

參照張玉的方法，并稍作修改?；罨蟮闹参锶闂U菌LP1和發(fā)酵乳桿菌LF1菌株以2%的接種量接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，枯草芽孢桿菌BS1以2%的接種量接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，間隔2 h取適量培養(yǎng)物測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處光密度（OD）及pH值，同時(shí)以空白MRS液體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基作對(duì)照，平行測(cè)定3 次取平均值，繪制生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸曲線，根據(jù)菌種的生長(zhǎng)與產(chǎn)酸情況選擇合適菌株作為發(fā)酵劑。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇植物乳桿菌LP1為發(fā)酵菌種，將重懸后的菌懸液以一定的比例接種到雞肝發(fā)酵培養(yǎng)基中。利用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）能夠溶解小分子蛋白質(zhì)或肽段的特性，將發(fā)酵后雞肝與15 g/100 mL TCA混合，離心取上清液測(cè)定280 nm波長(zhǎng)處吸光度（），用于表征小分子蛋白質(zhì)或肽段的含量，越大說(shuō)明小分子肽和游離氨基酸的含量越高，發(fā)酵效果越好。

1.3.4.1 發(fā)酵初始pH值對(duì)的影響

按照1.3.2節(jié)，稱取20 g雞肝至250 mL錐形瓶中，以料液比1∶3.5（/）加入純水，調(diào)節(jié)pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，滅菌冷卻后，以葡萄糖添加量6%、接種量1.5%的條件在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h，將雞肝發(fā)酵物與15 g/100 mL TCA混合均勻，靜置30 min，然后4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋至合適濃度（在2.5以內(nèi)）測(cè)定。

1.3.4.2 葡萄糖添加量對(duì)的影響

以料液比1∶3.5向雞肝中加入純水，分別加入2%、4%、6%、8%、10%葡萄糖，調(diào)節(jié)pH值為5.5，滅菌冷卻后，接種1.5%的發(fā)酵菌種，其余步驟同1.3.4.1節(jié)。

1.3.4.3 接種量對(duì)的影響

以料液比1∶3.5向雞肝中加入純水，加入6%葡萄糖，調(diào)節(jié)pH值為5.5，滅菌冷卻后，分別接種0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的發(fā)酵菌種，其余步驟同1.3.4.1節(jié)。

1.3.4.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)的影響

以料液比1∶3.5向雞肝中加入純水，加入6%葡萄糖，調(diào)節(jié)pH值為5.5，滅菌冷卻后，接種1.5%的發(fā)酵菌種，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵16、20、24、28、32 h，其余步驟同1.3.4.1節(jié)。

1.3.4.5 料液比對(duì)的影響

分別以料液比1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0、1∶4.5向雞肝中加入純水，加入6%葡萄糖，調(diào)節(jié)pH值為5.5，滅菌冷卻后，接種1.5%的發(fā)酵菌種，其余步驟同1.3.4.1節(jié)。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合1.3.4節(jié)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定各單因素取值范圍，選擇接種量（）、發(fā)酵初始pH值（）、料液比（）為自變量，以為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，具體見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Codes and levels of independent variables in Box-Behnken design

1.3.6 發(fā)酵雞肝測(cè)定

取1 g發(fā)酵雞肝固液混合物，加入5 mL 15 g/100 mL TCA后混合均勻，靜置30 min，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，將離心后得到的上清液適當(dāng)稀釋，測(cè)定。

1.3.7 游離氨基酸測(cè)定

參照Yang Xue等的方法，稍作修改。稱取0.05 g凍干的發(fā)酵前后雞肝樣品，與5 mL 10 g/100 mL TCA溶液混合均勻，于4 ℃靜置2 h，并在4 ℃、10 000 r/min的條件下離心10 min，取2 mL離心后的上清液用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH值為2，并用pH 2、0.06 mol/L TCA溶液定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm的針筒式有機(jī)相濾膜過(guò)濾后，將濾液轉(zhuǎn)移至2 mL的上樣瓶中，采用氨基酸自動(dòng)分析儀上機(jī)檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖分析，用SPSS（IBM SPSS Statistics 19）軟件進(jìn)行方差分析，＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵劑菌種的選擇

2.1.1 不同菌種的生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，植物乳桿菌LP1和發(fā)酵乳桿菌LF1顯示出類似的生長(zhǎng)趨勢(shì)，2 種菌株的生長(zhǎng)周期均較短，而枯草芽孢桿菌BS1的生長(zhǎng)速率比植物乳桿菌LP1和發(fā)酵乳桿菌LF1小。0～4 h為植物乳桿菌LP1和發(fā)酵乳桿菌LF1的生長(zhǎng)延滯期，此時(shí)菌種剛剛接種到新鮮培養(yǎng)基中，為了適應(yīng)新環(huán)境，菌種需要對(duì)自身的代謝系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整，菌種細(xì)胞數(shù)量及生物量增長(zhǎng)率在延滯期處于最低水平；4～8 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌種已適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境，生長(zhǎng)速率達(dá)到最快；經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的生長(zhǎng)后，隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物的積累，此時(shí)新增細(xì)胞數(shù)和死亡細(xì)胞數(shù)維持相對(duì)平衡，在生長(zhǎng)曲線中表現(xiàn)為接近水平的線。枯草芽孢桿菌BS1的生長(zhǎng)延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期分別為0～8 h、8～12 h及12 h后。植物乳桿菌LP1在對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率高于發(fā)酵乳桿菌LF1和枯草芽孢桿菌BS1，且達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期后，植物乳桿菌LP1的OD整體高于發(fā)酵乳桿菌LF1和枯草芽孢桿菌BS1。這說(shuō)明植物乳桿菌LP1和發(fā)酵乳桿菌LF1較枯草芽孢桿菌BS1具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。

圖1 不同菌種的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curves of different strains

2.1.2 不同菌種的產(chǎn)酸曲線

由圖2可知，植物乳桿菌LP1和發(fā)酵乳桿菌LF1的產(chǎn)酸曲線也具有相似的趨勢(shì)，與圖1菌株生長(zhǎng)曲線所體現(xiàn)的趨勢(shì)相符。經(jīng)過(guò)延滯期對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)，2 株乳桿菌培養(yǎng)基的pH值在生長(zhǎng)4 h后迅速下降，進(jìn)入對(duì)數(shù)期后代謝旺盛，開(kāi)始大量產(chǎn)酸，生長(zhǎng)8 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞代謝速率下降，并且已產(chǎn)生的酸類物質(zhì)會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)起到抑制作用，最終植物乳桿菌LP1的pH值穩(wěn)定在3.7左右，發(fā)酵乳桿菌LF1的pH值穩(wěn)定在4.0左右。與以上2 株乳桿菌相比而言，枯草芽孢桿菌BS1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)基pH值下降的速率明顯降低，且最終pH值穩(wěn)定在4.7左右。可以看出，3 種菌株中2 株乳桿菌的產(chǎn)酸能力遠(yuǎn)高于枯草芽孢桿菌BS1，其中植物乳桿菌LP1的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。因此，綜合生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸能力的結(jié)果，本研究最終選擇植物乳桿菌LP1作為發(fā)酵雞肝的發(fā)酵劑。

圖2 不同菌種的產(chǎn)酸曲線Fig. 2 Acid production curves of different strains

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵初始pH值對(duì)的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵初始pH值的增加總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵初始pH值為5.5時(shí)達(dá)到最高（＜0.05），說(shuō)明在該pH值條件下發(fā)酵雞肝中小分子肽和游離氨基酸的含量最高。部分低分子質(zhì)量肽和游離氨基酸可以單獨(dú)呈味，也可以繼續(xù)反應(yīng)形成其他風(fēng)味化合物。雞肝蛋白質(zhì)在植物乳桿菌LP1分泌的蛋白酶作用下降解，研究表明，生成的低分子質(zhì)量肽和游離氨基酸不僅能起呈味增鮮作用，而且具有一定生理活性，能改善雞肝的風(fēng)味，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。與鄧愛(ài)華等優(yōu)化地衣芽孢桿菌SD1482發(fā)酵魷魚下腳料時(shí)得到的結(jié)果一致，最佳發(fā)酵初始pH值同樣為5.5。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初始pH值不僅會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)情況，還會(huì)影響酶的活性。為了促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程中菌株的生長(zhǎng)，增強(qiáng)酶的活性，需要選擇合適的初始pH值。因此，本研究選取發(fā)酵初始pH 5.5為最優(yōu)條件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 發(fā)酵初始pH值對(duì)A280 nm的影響Fig. 3 Effect of initial pH of fermentation medium on A280 nm

2.2.2 葡萄糖添加量對(duì)的影響

葡萄糖是乳酸菌生長(zhǎng)繁殖必不可缺的碳源，而雞肝中的糖類以肝糖原形式存在，葡萄糖較之更有利于乳酸菌的利用，因此本實(shí)驗(yàn)選擇向雞肝發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖。乳酸菌可將培養(yǎng)基中的碳源分解轉(zhuǎn)化為乳酸等有機(jī)酸，賦予發(fā)酵產(chǎn)品較強(qiáng)的酸味，這些酸類還可與醇類反應(yīng)生成酯類物質(zhì)，對(duì)產(chǎn)品特征風(fēng)味的形成具有重要貢獻(xiàn)。

由圖4可知，首先隨著葡萄糖添加量增加而增大，在葡萄糖添加量為8%時(shí)達(dá)到最大值，隨后下降。葡萄糖添加量低于8%時(shí)，因碳源量無(wú)法滿足植物乳桿菌LP1正常生長(zhǎng)所需而導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)速率緩慢，進(jìn)而造成蛋白酶產(chǎn)量較低，蛋白質(zhì)分解程度較低，較低。葡萄糖添加量繼續(xù)增加，出現(xiàn)下降，這是由于培養(yǎng)基中過(guò)高的葡萄糖含量會(huì)造成滲透壓過(guò)高，可能破壞菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的正常生理活動(dòng)和代謝過(guò)程被擾亂，甚至導(dǎo)致菌體死亡，不利于發(fā)酵的進(jìn)行，故選擇葡萄糖添加量為6%進(jìn)行發(fā)酵。

圖4 葡萄糖添加量對(duì)A280 nm的影響Fig. 4 Effect of glucose addition on A280 nm

2.2.3 接種量對(duì)的影響

由圖5可知：接種量在0.5%～1.5%時(shí)，呈上升趨勢(shì)；當(dāng)接種量大于1.5%時(shí)，開(kāi)始下降。這是因?yàn)樵诮臃N量過(guò)低時(shí)，菌株生長(zhǎng)繁殖速率慢，植物乳桿菌LP1分泌的蛋白酶含量很少，分解蛋白質(zhì)的能力較弱，故小肽及游離氨基酸的含量較低；而當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)，菌株迅速繁殖，菌體密度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致與氧氣的接觸不足，不利于發(fā)酵的進(jìn)行，另外，發(fā)酵劑用量過(guò)高不利于控制生產(chǎn)成本。同時(shí)植物乳桿菌LP1發(fā)酵產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，使培養(yǎng)基處于較高的酸度環(huán)境，反而會(huì)抑制菌體部分代謝活動(dòng)，影響產(chǎn)酶量及酶活性，從而導(dǎo)致接種量過(guò)大時(shí)發(fā)酵雞肝中小分子肽和氨基酸的含量隨之降低。因此，選擇接種量為1.5%進(jìn)行發(fā)酵。李梓媛在研究乳酸菌和肉葡萄球菌混菌發(fā)酵制備羊肉香腸時(shí)，發(fā)現(xiàn)以8%的接種量進(jìn)行發(fā)酵，菌株的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，有利于保證發(fā)酵香腸的安全性，使發(fā)酵香腸具有穩(wěn)定的品質(zhì)。

圖5 接種量對(duì)A280 nm的影響Fig. 5 Effect of inoculum size on A280 nm

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)的影響

由圖6可知，發(fā)酵16～24 h內(nèi)，發(fā)酵雞肝的隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)上升，20～24 h的急劇上升，說(shuō)明大量的雞肝蛋白質(zhì)被分解利用，小肽及游離氨基酸的含量迅速增加，可能由于在發(fā)酵24 h時(shí)植物乳桿菌LP1分泌的蛋白酶含量及酶活達(dá)到最大值，此時(shí)的發(fā)酵效果顯著。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)24 h，不再升高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)甚至還出現(xiàn)輕微下降，當(dāng)大部分雞肝蛋白被分解后，小分子肽和游離氨基酸的含量遠(yuǎn)高于雞肝蛋白的含量，此時(shí)植物乳桿菌LP1會(huì)優(yōu)先消耗小分子物質(zhì)，造成小肽及游離氨基酸含量下降。另外，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致乳酸等物質(zhì)的積累，菌體的產(chǎn)酶量在進(jìn)入平穩(wěn)期后達(dá)到最大值，繼續(xù)發(fā)酵可能會(huì)影響蛋白酶的產(chǎn)量和活性。因此，綜合考慮生產(chǎn)成本以及避免過(guò)長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵導(dǎo)致發(fā)酵效果的降低，選擇發(fā)酵時(shí)間為24 h。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)A280 nm的影響Fig. 6 Effect of fermentation time on A280 nm

2.2.5 料液比對(duì)的影響

雞肝作為植物乳桿菌生長(zhǎng)繁殖的主要營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，控制合適的料液比能在節(jié)省生產(chǎn)成本的同時(shí)提高植物乳桿菌的生長(zhǎng)速率。由圖7可知，料液比1∶2.0～1∶3.5時(shí)，隨著液體添加量的增加顯著增高（＜0.05），在料液比為1∶3.5時(shí)達(dá)到最高，隨著液體添加量的繼續(xù)增加，開(kāi)始下降，料液比過(guò)高會(huì)使生產(chǎn)成本提高，令狐青青等使用納豆芽孢桿菌（）發(fā)酵魷魚碎肉，發(fā)現(xiàn)料液比過(guò)高會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量下降，與本研究結(jié)果趨勢(shì)一致。當(dāng)料液比達(dá)到1∶4.5時(shí)，與料液比為1∶4.0時(shí)相較無(wú)顯著變化，說(shuō)明在料液比1∶4.0～1∶4.5范圍內(nèi)，雞肝蛋白被分解生成小分子肽和游離氨基酸的量與被植物乳桿菌LP1菌體利用的量保持相對(duì)平衡，考慮到生產(chǎn)成本，選擇料液比1∶3.5進(jìn)行下一步發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

圖7 料液比對(duì)A280 nm的影響Fig. 7 Effect of solid-to-liquid ratio on A280 nm

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，接種量、發(fā)酵初始pH值和料液比對(duì)雞肝發(fā)酵的影響更為顯著，因此選擇該3 個(gè)因素對(duì)雞肝發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.1 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到與接種量（）、發(fā)酵初始pH值（）、料液比（）3 個(gè)因素間的回歸方程為：=-21.196 47+2.477 85+5.206 20+3.608 65-0.120 00-0.181 00+0.086 00-0.389 70-0.478 70-0.537 70。該方程中各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值大小代表各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)則反映各因素對(duì)響應(yīng)值影響的方向。由一次項(xiàng)系數(shù)可以得出對(duì)于發(fā)酵物的影響程度依次為＞＞，即發(fā)酵初始pH值＞料液比＞接種量。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸模型顯著性系數(shù)檢驗(yàn)Table 3 Analysis variance of quadratic polynomial model and significance test

通過(guò)顯著性分析可知，模型中一次項(xiàng)中的發(fā)酵初始pH值影響極顯著（＜0.01），料液比影響顯著（＜0.05），接種量影響不顯著；二次項(xiàng)系數(shù)均影響極顯著（＜0.01）；交互項(xiàng)中，接種量與料液比交互作用極顯著（＜0.01），接種量與發(fā)酵初始pH值的交互作用顯著（＜0.05），發(fā)酵初始pH值與料液比交互作用不顯著。

2.3.2 因素交互作用分析

圖9 接種量和料液比對(duì)A280 nm影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig. 9 Response surface and contour plots showing the effects of inoculum size and solid-to-liquid ratio on A280 nm

分析接種量、發(fā)酵初始pH值、料液比中任意一個(gè)因素為零水平時(shí)，其余2 個(gè)因素對(duì)發(fā)酵雞肝的交互影響。為了分析兩因素間交互作用的程度，需要通過(guò)響應(yīng)面陡峭程度、三維等高線的形狀來(lái)進(jìn)行直觀反映。其中響應(yīng)值與各自變量之間的變化程度可通過(guò)響應(yīng)面坡度的陡峭情況來(lái)分析。等高線的形狀呈橢圓形，表明兩因素之間的交互作用顯著，而等高線趨于圓形則說(shuō)明交互作用較弱。可以看出，圖8～9的響應(yīng)面具有較陡峭的坡面，等高線呈現(xiàn)橢圓形，說(shuō)明接種量和發(fā)酵初始pH值、接種量和料液比的交互作用對(duì)發(fā)酵雞肝有顯著影響。圖10響應(yīng)面坡面較緩，等高線形狀趨于圓形，可知發(fā)酵初始pH值和料液比的交互作用對(duì)發(fā)酵雞肝的影響不大，這與表3方差分析的結(jié)果一致。

圖8 接種量和發(fā)酵初始pH值對(duì)A280 nm影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig. 8 Response surface and contour plots showing the effects of inoculum size and initial pH of fermentation medium on A280 nm

圖10 發(fā)酵初始pH值和料液比對(duì)發(fā)酵雞肝A280 nm影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig. 10 Response surface and contour plots showing the effects of initial pH of fermentation meduim and solid-to-liquid ratio on A280 nm

2.3.3 雞肝發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化和模型驗(yàn)證

以為響應(yīng)值，通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件分析得到植物乳桿菌LP1發(fā)酵雞肝的最佳工藝條件為：發(fā)酵初始pH 5.57、料液比1∶3.55、接種量1.5%。在此條件下，發(fā)酵物的預(yù)測(cè)值為1.559。經(jīng)過(guò)3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)條件保持高度一致），得到發(fā)酵雞肝的實(shí)際值為1.537，與預(yù)測(cè)值的吻合度達(dá)到98.59%，因此，該模型能夠有效應(yīng)用于植物乳桿菌LP1發(fā)酵雞肝工藝的優(yōu)化。

2.4 最優(yōu)工藝條件下發(fā)酵雞肝游離氨基酸組成測(cè)定結(jié)果

植物乳桿菌LP1在發(fā)酵過(guò)程中分泌的蛋白酶可將雞肝蛋白分解為小分子質(zhì)量的肽和大量游離氨基酸，這些小肽和游離氨基酸本身具有呈味作用，同時(shí)還可與其他成分進(jìn)一步反應(yīng)作為風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵雞肝風(fēng)味的形成有重要作用。通過(guò)對(duì)游離氨基酸組成的測(cè)定分析，可知發(fā)酵前后雞肝中游離氨基酸的種類及變化情況。測(cè)得的17 種氨基酸中，根據(jù)機(jī)體是否合成及合成速率是否滿足需求，分為必需氨基酸（Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、His）和非必需氨基酸（Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Tyr、Arg、Pro）；按照呈味不同可分為鮮味氨基酸（Asp、Glu）、甜味氨基酸（Ser、Ala、Thr、Pro、Gly）和苦味氨基酸（Val、Leu、Ile、Tyr、Lys、Arg、Phe）等。

由表4可知，發(fā)酵雞肝的游離氨基酸總含量顯著高于未發(fā)酵雞肝（＜0.05），同時(shí)必需氨基酸的總含量經(jīng)過(guò)發(fā)酵后顯著增加（＜0.05），說(shuō)明發(fā)酵能促使蛋白質(zhì)分解為大量游離氨基酸，其中蘇氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和精氨酸含量分別提高58.67%、49.18%、65.71%、51.62%、57.39%、80.82%和53.93%，從而提高雞肝的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。Li Chunsheng等使用戊糖片球菌30-7和30-15發(fā)酵羅非魚香腸，發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌30-15能夠顯著提高羅非魚香腸中鮮味和甜味游離氨基酸的含量，改善產(chǎn)品滋味。

表4 發(fā)酵前后雞肝游離氨基酸組分含量的變化Table 4 Changes in free amino acid composition of chicken liver before and after fermentation g/100 g

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)植物乳桿菌LP1、發(fā)酵乳桿菌LF1和枯草芽孢桿菌BS1生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸曲線的測(cè)定，得出植物乳桿菌LP1的生長(zhǎng)速率最快、產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，故選擇植物乳桿菌LP1作為發(fā)酵劑對(duì)雞肝進(jìn)行單菌發(fā)酵，同時(shí)可利用植物乳桿菌LP1產(chǎn)酸抑制雜菌的生長(zhǎng)，提高安全性。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇發(fā)酵初始pH值、接種量和料液比進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)植物乳桿菌LP1發(fā)酵雞肝的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為：發(fā)酵初始pH 5.57、料液比1∶3.55、接種量1.5%。結(jié)果顯示，雞肝發(fā)酵后游離氨基酸和必需氨基酸總含量均顯著增加（＜0.05），進(jìn)一步說(shuō)明發(fā)酵可促進(jìn)蛋白質(zhì)分解為大量游離氨基酸，提高雞肝的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。發(fā)酵雞肝是制備寵物貓食品的優(yōu)質(zhì)原料，拓展了雞肝副產(chǎn)物綜合利用的新途徑。