超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜肉中萬古霉素殘留量及測量不確定度評估

李慧晨，張穎穎，郭文萍，宋永青，樊之聰

（中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068）

萬古霉素（分子式CHClNO）屬于糖肽類抗生素，作為抗生素的“最后一道防線”，其獨特的抗菌機制被用于治療對其他抗生素無效的嚴重感染。萬古霉素的藥渣可作為補充蛋白飼料資源的一部分，并且可作為保健促生長飼料添加劑，用以提高飼料報酬率，因此被廣泛用于食用動物的生產(chǎn)養(yǎng)殖中，盡管農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告中已將萬古霉素列為禁用獸藥，但仍有養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)過程中惡意添加，造成畜肉藥物殘留的問題。消費者長期食用會產(chǎn)生嚴重的抗生素耐藥性，且萬古霉素有嚴重的耳毒性、腎毒性及其他副作用，給人類的健康造成巨大影響。

目前，萬古霉素的測定樣品基質(zhì)主要集中在藥物、血液、飼料、乳制品等，采用的方法多是液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學發(fā)光免疫法、近紅外光譜法、微生物法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。萬古霉素經(jīng)過飼喂及體內(nèi)吸收后，殘留在畜肉中的含量較低，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）具有分辨率高、定性定量準確、檢出限低、靈敏度高等優(yōu)點，能夠?qū)π笕庵腥f古霉素進行痕量檢測。近年來對畜肉中萬古霉素殘留量測定的研究不斷增多，回收率和檢出限也能滿足日常檢測需求，但普遍未對方法中基質(zhì)效應(yīng)進行評價，也未評估檢測過程的不確定度。

食品檢驗工作對結(jié)果的準確度要求日益提高，但檢驗過程會受到諸多因素的影響，導致測量結(jié)果和真值之間存在一定的誤差。由于真值往往不易得到，為了更客觀、科學地評價測量結(jié)果，需要開展對食品檢測過程中不確定度的評定。本研究利用UPLC-MS/MS，通過優(yōu)化樣品前處理條件及儀器采集條件，建立一種畜肉中萬古霉素的檢測方法，并依據(jù)CNAS-CL01-G003—2021《測量不確定度的要求》分析方法測量結(jié)果的不確定度，以便對用檢測結(jié)果進行樣品符合性判定時的風險開展評估，確保實驗質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮豬肉（15 份）、牛肉（5 份）和羊肉（5 份）購買于農(nóng)貿(mào)市場。

萬古霉素鹽酸鹽標準品 德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純） 美國Fisher公司；正己烷（分析純）、甲醇（分析純） 國藥集團化學試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ UPLC-MS/MS儀（配備電噴霧離子源、TraceFinder 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Thermo Fisher公司；20PR-520高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；HGC-12A氮吹儀 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；HENGAO T&D固相萃取裝置 美國Aiglent公司；KQ-700DV超聲儀 昆山超聲儀器有限公司；C、C、PHENYL固相萃取柱 博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取0.014 75 g萬古霉素標準品（精確到0.000 01 g），用體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液-乙腈定容于100 mL容量瓶中，制得標準儲備液質(zhì)量濃度為147.5 μg/mL，4 ℃冰箱保存。使用時依次用0.1%甲酸水溶液-乙腈（7∶3，/）稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.3.2 樣品制備

提取：分別取豬肉、牛肉和羊肉樣品，經(jīng)勻漿后制備成糜狀均質(zhì)樣品，準確稱取5 g均質(zhì)樣品（精確到0.001 g）于50 mL離心管中，加入5 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈（70∶30，/）溶液，渦旋2 min后，超聲10 min，10 000 r/min離心5 min；上清液全部轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，再向樣品殘渣中加入5 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈（70∶30，/）溶液，重復(fù)提取1 次，離心后合并提取液；加入5 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min后，棄去上層正己烷。

凈化：將提取液全部加入至依次用5 mL甲醇、5 mL水活化的C固相萃取柱中，用5 mL水淋洗小柱，然后用6 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，50 ℃氮吹至干；準確吸取1.00 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈（70∶30，/）溶解殘渣，渦旋混勻后過0.22 μm濾膜，進行UPLC-MS/MS檢測及分析。

1.3.3 儀器條件

液相色譜條件：Hypersil GOLD C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；流動相A：體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈。二元梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

質(zhì)譜條件：離子化模式為正模式；噴霧電壓3 000 V；離子源霧化溫度350 ℃；鞘氣壓力45 arb；輔氣壓力15 arb；采集方式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，采集參數(shù)見表2。

表2 萬古霉素的MRM采集參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for vancomycin

1.3.4 標準曲線繪制

分別準確移取萬古霉素標準溶液0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，用0.1%甲酸水溶液-乙腈（70∶30，/）定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0.59、1.48、2.95、5.90、14.75 ng/mL的標準工作溶液。采用外標法，以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標，以待測物定量離子峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.5 測量不確定度評定

對豬肉中萬古霉素含量進行6 次重復(fù)測定，根據(jù)測定結(jié)果，依據(jù)CNAS-CL01-G003—2021和JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，對測定過程產(chǎn)生的不確定度進行評估。

1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)評價

基質(zhì)效應(yīng)按式（1）計算。

式中：基質(zhì)匹配標準曲線以空白基質(zhì)提取液為溶劑，配制成與標準曲線各點質(zhì)量濃度相同的標準工作溶液，繪制標準曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

色譜圖采用Thermo Fisher TraceFinder 4.1進行數(shù)據(jù)采集和處理，自動計算擬合線性回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶液的選擇

萬古霉素屬于大環(huán)糖肽類抗生素，化學結(jié)構(gòu)中含有羥基、酰胺等多個親水性基團，在水溶液中有很好的溶解性，在甲醇中微溶，在中性和酸性溶液中較穩(wěn)定。實驗比較了水、體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液、體積分數(shù)0.3%甲酸水溶液的提取效果。結(jié)果顯示，酸性水溶液提取率高于水溶液，且0.1%甲酸水溶液與0.3%甲酸水溶液的提取率無明顯差別，故選擇0.1%甲酸水溶液進行提取。但由于畜肉中有大部分蛋白質(zhì)是溶于水的，提取液渾濁，雜質(zhì)較多，基質(zhì)干擾嚴重且容易污染質(zhì)譜，根據(jù)畜肉中蛋白質(zhì)特點，加入適量的有機溶劑可降低蛋白質(zhì)的溶解性，因此比較在甲醇、乙腈中分別加入0.1%甲酸水溶液的提取率，結(jié)果顯示，0.1%甲酸水溶液-乙腈的提取率最高，因此選用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為混合提取試劑。

進一步比較不同體積比的0.1%甲酸水溶液-乙腈（85∶15、70∶30、55∶45）對樣品中萬古霉素的提取回收率，結(jié)果顯示，0.1%甲酸水溶液-乙腈（70∶30，/）的回收率最高。此外，畜肉中所含的脂肪會干擾凈化過程并污染色譜柱，因此提取溶液需用乙腈飽和的正己烷去除脂肪后再進一步凈化。

2.1.2 凈化條件的選擇

固相萃取柱的選擇：根據(jù)萬古霉素的化學性質(zhì)，分別選擇C、C、PHENYL 3 種固相萃取柱進行凈化，結(jié)果顯示，C萃取柱的回收率最高，因此選擇C作為固相萃取柱。

凈化條件的優(yōu)化：比較水和0.1%甲酸水溶液作為淋洗溶劑的效果，結(jié)果顯示，二者回收率無明顯差別，因此選擇水作為淋洗溶劑；進一步比較3、6、10 mL甲醇作為洗脫溶劑的效果，結(jié)果顯示，用3 mL甲醇洗脫回收率最低，用6、10 mL甲醇洗脫的回收率相差不大，因此選擇6 mL甲醇進行洗脫。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

萬古霉素的分子式為CHClNO，相對分子質(zhì)量為1 449.25，對萬古霉素標準物質(zhì)進行全掃描時，發(fā)現(xiàn)萬古霉素更容易產(chǎn)生帶正電的雙電荷離子（[M+2H]），因此其母離子為/725.4。之后進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，通過優(yōu)化碰撞電壓等條件，獲得定量離子、定性離子的最大響應(yīng)強度。正離子掃描模式下，在液相色譜流動相中加入少量的甲酸會增強待測化合物的響應(yīng)強度，這主要是由于酸提供了更多的H。因此本實驗選用0.1%甲酸水溶液與乙腈為流動相，優(yōu)化梯度洗脫程序，從而保證各個化合物有良好的峰形、分離度及響應(yīng)強度。在此條件下，10 ng/mL萬古霉素標準溶液的定量離子色譜圖如圖1所示。

圖1 萬古霉素標準溶液色譜圖Fig. 1 Chromatogram of vancomycin standard solution

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍及檢出限

在0.59～14.75 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性方程為=94.19+142.50，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，線性關(guān)系良好。

在空白豬肉樣品中加入萬古霉素標準溶液，經(jīng)過提取和凈化后，進行儀器檢測，以定量離子信噪比不小于3為檢出限，得到檢出限為0.1 μg/kg。較周迎春等的研究，該方法檢出限更低。

2.3.2 回收率及精密度

在空白豬肉中添加低、中、高3 個濃度水平的標準溶液，每個添加量分別做6 個平行，進行回收率實驗。由表3可知，萬古霉素的回收率為86.7%～100.3%，相對標準偏差小于3%，其精密度和回收率均符合殘留分析方法的要求。在此基礎(chǔ)上，對空白牛肉、羊肉進行低濃度水平（加標量為0.38 μg/kg）的添加回收驗證實驗，回收率分別為86.3%和97.1%，滿足日常檢測需求。

表3 豬肉樣品中萬古霉素添加回收率及相對標準偏差Table 3 Recoveries and RSDs of vancomycin in spiked pork samples

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)評價

基質(zhì)效應(yīng)是影響定量分析準確性的因素之一，產(chǎn)生的主要原因是樣品中鹽類、胺類、脂肪酸等干擾物質(zhì)與目標物一同提取出來，從而影響目標物進入質(zhì)譜分析的離子數(shù)量，導致定量結(jié)果產(chǎn)生偏差。本研究中萬古霉素的基質(zhì)效應(yīng)為-24%，結(jié)合添加回收實驗結(jié)果，綜合認為基質(zhì)效應(yīng)未對實驗結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

2.4 方法的應(yīng)用

根據(jù)本實驗建立的前處理方法，對農(nóng)貿(mào)市場的豬肉、牛肉、羊肉共計10 個樣品進行萬古霉素含量檢測，未檢出陽性樣品。

2.5 不確定度評估

由于既往對萬古霉素檢測方法的研究中，測量不確定度評估的研究較少，因此，本研究對豬肉中萬古霉素測定過程的測量不確定度進行了評估。

2.5.1 建立數(shù)學模型

樣品中萬古霉素含量按式（2）計算。

式中：為試樣中萬古霉素含量/（μg/kg）；為從標準工作曲線中擬合得到的萬古霉素溶液質(zhì)量濃度/（ng/mL）；為樣品溶液最終體積/mL；為樣品質(zhì)量/g。

2.5.2 不確定度分量的主要來源分析

通過檢測過程及數(shù)學模型，可以確定不確定度來源主要包括標準溶液配制過程引入的不確定度、樣品制備過程引入的不確定度、曲線擬合引入的不確定度、重復(fù)性實驗（隨機）變化引入的不確定度、試劑空白引入的不確定度、提取、凈化對樣品回收率的影響引入的不確定度和儀器定量測量重復(fù)性引入的不確定度。

相對合成標準不確定度按式（3）計算。

2.5.3 標準溶液配制過程引入的不確定度

來自標準儲備液配制過程引入的不確定度和標準溶液配制過程引入的不確定度，按式（4）計算。

2.5.3.1 標準儲備液配制過程引入的不確定度

來自標準物質(zhì)純度引入的不確定度、標準物質(zhì)稱量引入的不確定度和標準儲備液定容至100 mL時引入的不確定度。按式（5）計算。

式中：標準品證書上提供的標準物質(zhì)純度為（99.5±0.5）%，包含因子為3，則按式（6）計算。

天平檢定證書給出的最大允許誤差為±0.01 mg，包含因子為3，則按式（7）計算。

分別來源于容量瓶引入的不確定度和實驗溫度引入的不確定度。100 mL容量瓶的允許誤差為±0.1 mL，包含因子為6；實驗溫度為22 ℃，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10/℃，包含因子為3。因此，按式（8）計算。

根據(jù)式（8）計算得到為4.74×10，根據(jù)式（5），利用式（6）、（7）、（8）的結(jié)果，計算得到為2.95×10。

2.5.3.2 配制標準溶液引入的不確定度

來自0.2 mL分度吸管引入的不確定度和定容引起的不確定度，按式（9）計算。

式中：0.2 mL分度吸管的允差為±0.005 mL，50 mL容量瓶的允差為±0.05 mL，包含因子均為6，實驗溫度引入的不確定度同上，則和分別按式（10）、（11）計算。

根據(jù)式（10）、（11）計算得到為1.02×10，為4.74×10。

根據(jù)式（9），利用式（10）、（11）的結(jié)果，計算得到為1.02×10。

來自0.5 mL分度吸管引入的不確定度和定容引起的不確定度，按式（12）計算。

式中：0.5 mL分度吸管的允差為±0.010 mL，包含因子為6，實驗溫度引入的不確定度同上，按式（13）計算。

根據(jù)式（13）計算得到為8.16×10。

根據(jù)式（12），利用式（11）、（13）的結(jié)果，計算得到為8.17×10。

來自1.0 mL單標吸管引入的不確定度和定容引起的不確定度，按式（14）計算。

式中：1.0 mL單標吸管的允差為±0.007 mL，包含因子為6，實驗溫度引入的不確定度同上，按式（15）計算。

根據(jù)式（15）計算得到為2.87×10。

根據(jù)式（14），利用式（11）、（15）的結(jié)果，計算得到為2.91×10。

來自2.0 mL單標吸管引入的不確定度和定容引起的不確定度，按式（16）計算。

式中：2.0 mL單標吸管的允差為±0.010 mL，包含因子為6，實驗溫度引入的不確定度同上，按式（17）計算。

根據(jù)式（17）計算得到為2.05×10。

根據(jù)式（16），利用式（11）、（17）的結(jié)果，計算得到為2.10×10。

來自5.0 mL單標吸管引入的不確定度和定容引起的不確定度，按式（18）計算。

式中：5.0 mL單標吸管的允差為±0.015 mL，包含因子為6，實驗溫度引入的不確定度同上，按式（19）計算。

根據(jù)式（19）計算得到為1.24×10。

根據(jù)式（18），利用式（11）、（19）的結(jié)果，計算得到為1.33×10。

根據(jù)式（4），利用式（5）、（9）、（12）、（14）、（16）、（18）的結(jié)果，計算得到標準溶液配制過程引起的相對標準不確定度為1.39×10。

2.5.4 樣品制備過程引入的不確定度

來自稱量引入的不確定度和用單標吸管移取1.0 mL甲酸-乙腈溶液復(fù)溶所引入的不確定度，按式（20）計算。

式中：稱取5.000 g樣品，天平檢定證書給出的最大允許誤差為±0.001 g，包含因子為3，則按式（21）計算。

根據(jù)式（20），利用式（15）、（21）的結(jié)果，計算得到樣品制備過程引入的不確定度為2.87×10。

2.5.5 曲線擬合引入的不確定度

采用5 個質(zhì)量濃度水平的萬古霉素標準溶液（ρ）進行線性擬合，得到線性方程：=94.19+142.50（=0.999 5），曲線擬合的相對合成不確定度按式（22）計算。

式中：為擬合曲線截距（142.50）；y為擬合曲線各個質(zhì)量濃度的響應(yīng)值；ρ為擬合曲線各質(zhì)量濃度。

2.5.6 重復(fù)性實驗引入的不確定度

在重復(fù)性條件下，對豬肉中的萬古霉素含量進行了6 次平行測定，含量（x）分別為0.341、0.350、0.367、0.326、0.348、0.319 μg/kg。重復(fù)性實驗的相對合成不確定度按式（25）計算。

2.5.7 試劑空白引入的不確定度

由于本實驗所用試劑均為色譜純或者分析純，試劑空白溶液在目標物保留時間附近無干擾，故可忽略不計。

2.5.8 提取、凈化對樣品回收率的影響引入的不確定度

對含有萬古霉素的樣品進行6 次添加回收實驗，加標回收率分別為88.8%、91.1%、88.8%、86.7%、89.8%和89.6%。加標回收率實驗的相對合成不確定度按式（27）計算。

2.5.9 儀器定量測量重復(fù)性引入的不確定度

根據(jù)校準證書獲得儀器定量測量重復(fù)性引入的不確定度=6.12×10。

2.5.10 相對合成標準不確定度

3 結(jié) 論

本研究建立了測定畜肉中萬古霉素殘留的UPLCMS/MS法。樣品經(jīng)0.1%甲酸水溶液-乙腈提取，正己烷除去脂肪，過C固相萃取柱凈化，C色譜柱分離，采用MRM檢測，外標法定量。檢出限為0.1 μg/kg，加標回收率為86.7～100.3%，相對標準偏差小于3%。對該過程的測量不確定度進行評估，在95%的置信水平下，取擴展因子=2，結(jié)果可表示為（0.342±0.041） μg/kg。本方法操作簡便快捷、靈敏度高、回收率穩(wěn)定，數(shù)據(jù)準確，滿足國內(nèi)外相關(guān)法規(guī)的要求，適合大批量樣品的分析。