王靜怡,佐長賡,牛新湘,管力慧,楊紅梅,楚 敏,王 寧,林 青,婁 愷,史應(yīng)武,5,
(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所,新疆烏魯木齊 830091;3.新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830091;4.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所,新疆烏魯木齊 830091;5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北綠洲農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830091)
新疆由于其獨(dú)特的氣候條件,是重要的瓜果產(chǎn)區(qū)。其中,厚皮甜瓜是新疆主要的特色瓜果之一。厚皮甜瓜為葫蘆科(Cuculacere),黃瓜屬(CucumisL.),一年生草本植物,對比其他甜瓜,厚皮甜瓜具有果肉甜度高、口感好、貯藏期長等優(yōu)點(diǎn)[1]。然而由于其含糖量高,水分足,因此在氣溫高的夏季采摘容易使其受到病原菌的侵染,縮短其貯藏期,給生產(chǎn)者帶來經(jīng)濟(jì)損失[2]。在厚皮甜瓜的貯藏過程中,自身對病原菌的防御會導(dǎo)致自由基的積累,自由基的積累會加速其腐敗進(jìn)程[3],厚皮甜瓜體內(nèi)的保護(hù)酶在清除自由基中發(fā)揮了重要作用[4-5]。但在采后貯藏期間,保護(hù)酶的活性會由于外界因素的變化而降低,因此,減緩保護(hù)酶的活性降低及生防菌在厚皮甜瓜表面穩(wěn)定定殖對延長厚皮甜瓜貯藏期具有積極意義。
果蔬保鮮的研究多使用物理和化學(xué)方式[6],其中物理保鮮方式主要有低溫保鮮、氣調(diào)保鮮、輻照保鮮、光照處理保鮮、臭氧保鮮和熱處理保鮮等,杜紅鳳等[7]通過研究常溫、0.5 ℃和3 ℃貯藏條件下哈密瓜保護(hù)酶SOD、POD、CAT 活性的變化,得出0.5 ℃的貯藏條件對哈密瓜保護(hù)酶活性下降的抑制作用最為明顯;化學(xué)保鮮方式主要是利用植物生長調(diào)節(jié)劑和化學(xué)保鮮劑,其中,姚軍等[8]使用0.5%、1.0%和1.5%濃度的水楊酸對采后哈密瓜進(jìn)行浸泡處理,得出不同濃度的水楊酸均可增強(qiáng)PAL、PPO 和POD的活性,抑制哈密瓜果實(shí)腐爛的結(jié)論。現(xiàn)今生物保鮮技術(shù)以其無污染,成本低,效率高等優(yōu)點(diǎn)成為研究熱門[9]。生物保鮮技術(shù)主要有微生物拮抗保鮮、天然提取物保鮮和基因工程保鮮,其中,微生物拮抗保鮮的主要機(jī)理為抑制孢子萌發(fā)菌絲生長及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[10-11],劉奎等[12]探究獼猴桃接種枯草芽孢桿菌BS-1 對獼猴桃軟腐病的抑制效果及保鮮效果,發(fā)現(xiàn)接種BS-1 可顯著降低獼猴桃果實(shí)的腐爛率。目前,對于厚皮甜瓜保鮮效果及采后保護(hù)酶活性的變化研究,化學(xué)物理方式仍占據(jù)研究的主流[7],近幾年生防菌由于其高效環(huán)保的特點(diǎn)逐漸成為研究熱點(diǎn)[13],但把生防菌與溫度結(jié)合用在厚皮甜瓜貯藏期的研究鮮見報道。
本研究選用西州蜜25 號厚皮甜瓜,通過在4 ℃和25 ℃條件下在厚皮甜瓜表面接種貝萊斯芽孢桿菌BG-2,測定貯藏期間拮抗菌在厚皮甜瓜表面定殖特性、保鮮效果和厚皮甜瓜POD、PPO 和PAL 酶活性的變化趨勢,探究2 種溫度下貝萊斯芽孢桿菌BG-2 在厚皮甜瓜表面定殖特性、保鮮效果和對厚皮甜瓜貯藏期保護(hù)酶活性變化的影響。探討生物保鮮技術(shù)在厚皮甜瓜保鮮領(lǐng)域應(yīng)用的可能性,為延長新疆厚皮甜瓜貯藏期的研究提供理論依據(jù)。
病原菌 來自實(shí)驗(yàn)室從腐爛厚皮甜瓜中篩選出的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)CH-3;拮抗菌貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)BG-2 篩選自厚皮甜瓜種植土地;厚皮甜瓜 選自市場(經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所鑒定為西州蜜25 號),購買大小相近、重量3 kg 左右,成熟度基本一致,表皮無損傷,無病害蟲害的西州蜜25 號;營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(PDB)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、LB 培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;NaCl 天津市登峰化學(xué)試劑廠;75%乙醇 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司;過氧化氫酶試劑盒、多酚氧化酶試劑盒、苯丙氨酸解氨酶試劑盒 蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。
UVZ255 型紫外分光光度計 日本島津自動化設(shè)備有限公司;CENTRIFUGE 型高速冷凍離心機(jī)EPPENDORF;GMSX-280 型高壓蒸汽滅菌鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;ZWY-2102C 型恒溫培養(yǎng)震蕩器 上海智城儀器制造有限公司;WY 型手持折射儀成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司;Five Easy Plus 型pH計 北京東南儀誠實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。
1.2.1 拮抗菌處理液的制備 將篩選出的拮抗菌在NA 板上劃線,32 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接種于500 mL 有100 mL LB 培養(yǎng)基的錐形瓶中,32 ℃,180 r/min 搖瓶培養(yǎng)12 h,得到種子液。按2%的接種量接種至500 mL 裝有250 mL NB 培養(yǎng)基的錐形瓶中,32 ℃,180 r/min 搖瓶發(fā)酵3 d,8000 r/min 4 ℃離心5 min,取下層菌體沉淀,用0.85%的NaCl 溶液洗滌3 次,加入250 mL 相同濃度NaCl 溶液重懸菌體得到拮抗菌處理液。
1.2.2 病原菌處理液的制備 在PDA 平板中心接種一個病原菌菌餅,用6 mm 打孔器(1×105Pa 滅菌)在長滿病原菌的平板上打取15 個菌餅,接種至含有100 mL PDB 培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中,25 ℃,160 r/min 搖瓶培養(yǎng)2 d 獲得種子液,以1%的接種量接種至含有250 mL 培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中,25 ℃,160 r/min 搖瓶發(fā)酵5 d,8000 r/min 4 ℃離心5 min,取下層菌體沉淀,用0.85%的NaCl 溶液洗滌3 次沉淀,加入250 mL 相同濃度NaCl 溶液得到病原菌處理液。
1.2.3 厚皮甜瓜果實(shí)損傷后接種處理液 根據(jù)汪志浩等[14]的方法進(jìn)行改進(jìn):將厚皮甜瓜表面用自來水沖洗干凈并晾干,用75%的乙醇對其進(jìn)行表面消毒后用無菌水洗3 遍并晾干,選取厚皮甜瓜一側(cè)16 cm2的瓜面,用無菌針均勻的刺約2 mm 深的傷口30 個。
對照(CK):將消毒處理后的厚皮甜瓜于生理鹽水中浸泡2 min。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個處理,處理1(T1):用拮抗菌處理液(1×107CFU/mL)浸泡表面已消毒損傷厚皮甜瓜2 min;處理2(T2):將表面消毒處理后的厚皮甜瓜用無菌棉簽蘸取病原菌處理液(1×105CFU/mL)涂抹傷口部位并晾干;處理3(T3):將表面消毒處理后的厚皮甜瓜用無菌棉簽蘸取病原菌處理液(1×105CFU/mL)涂抹傷口部位,晾干后于拮抗菌處理液中浸泡2 min。。每種處理選取360 個厚皮甜瓜,180 個置于25 ℃,相對濕度55%的人工氣候箱中,180 個置于溫度4 ℃,相對濕度85%的冷庫中。常溫下每隔5 d 測定,低溫下每隔10 d 測定,每次測定每種處理選取9 個瓜。
1.2.4 厚皮甜瓜腐爛率的測定 根據(jù)汪志浩等[14]的方法進(jìn)行改進(jìn),常溫下每隔5 d,低溫下每隔10 d,將病斑半徑大于10 mm 的厚皮甜瓜記為腐爛,記錄各組厚皮甜瓜腐爛數(shù)量,為方便統(tǒng)計,定義厚皮甜瓜腐爛率計算公式如下:
厚皮甜瓜腐爛率(%)=(腐爛果實(shí)數(shù)量/果實(shí)總數(shù)量)×100
1.2.5 厚皮甜瓜酶活測定 將待測厚皮甜瓜切開后稱取5 g 損傷部位果肉,勻漿后吸取1 mL,采用POD、PPO、PAL 測試盒進(jìn)行提取測定,每次測定重復(fù)3 次。
1.2.6 厚皮甜瓜可溶性固形物(TSS)的測定 根據(jù)曹建康[15]的方法進(jìn)行改進(jìn),取傷口部位隨機(jī)5 g 厚皮甜瓜果肉于研缽中勻漿,4 層紗布過濾得到汁液,用膠頭滴管滴取3 滴瓜液至手持折射儀檢測鏡上,讀取數(shù)值(%),即為厚皮甜瓜可溶性固形物含量。每個處理重復(fù)3 次。
1.2.7 厚皮甜瓜pH 的測定 根據(jù)陳存坤等[16]的方法進(jìn)行改進(jìn),取傷口部位隨機(jī)10 g 厚皮甜瓜果肉于研缽中勻漿,4 層紗布過濾得到汁液,用pH 計測量pH,每個處理重復(fù)3 次。
1.2.8 拮抗菌在厚皮甜瓜表面定殖特性的測定 參照李建等[17]的方法進(jìn)行改進(jìn),常溫貯藏厚皮甜瓜每隔5 d 取樣,低溫貯藏每隔10 d 取樣。取傷口處5 g厚皮甜瓜于無菌研缽中研磨,0.85%無菌生理鹽水稀釋104倍,取100 μL 稀釋液涂布于NA 板,32 ℃恒溫培養(yǎng)16 h 后平板計數(shù)拮抗菌BG-2。每個處理取3 個重復(fù)。
定殖量(CFU/g)=平板菌落數(shù)×104
本研究每個處理做3 組平行,每組平行重復(fù)3 次,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Excel 2019 進(jìn)行作圖,SPSS26 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析,用方差分析的最小顯著性差異(LSD)進(jìn)行差異顯著性比較,P<0.05 表示差異顯著。
腐爛率是直觀表現(xiàn)厚皮甜瓜腐爛情況的指標(biāo),由圖1 可知,在25 ℃和4 ℃條件下,T2 處理最早腐爛,分別從第10 d 和第20 d 開始,T1 處理腐爛時間最晚且腐爛率顯著低于其他處理(P<0.05)。這可能是由于拮抗菌BG-2 具有廣譜抗菌性,而對厚皮甜瓜消毒處理并不能殺滅所有病原菌,另一方面拮抗菌可以誘導(dǎo)厚皮甜瓜保護(hù)酶活性增強(qiáng),提高抗病能力,延緩腐爛。井敏敏等[18]也通過將拮抗菌接種到貯藏期“臺農(nóng)”芒果上得出拮抗菌可以抑制芒果果實(shí)軟化的結(jié)論。25 ℃條件下,第25 d 時,T2 的腐爛率為100%,顯著高于其他處理(P<0.05),T1 的腐爛率為33.33%,T3 的腐爛率為55.56%,均低于CK,說明拮抗菌BG-2 可以有效控制病原菌的生長。4 ℃條件下,第50 d 時,T2 的腐爛率為100%,此時CK 和T3 的腐爛率均為56.00%,T1 的腐爛率為22.22%,顯著低于其他處理(P<0.05),T1 處理的保鮮效果最好,且相同天數(shù)低溫4 種處理腐爛率均低于常溫,說明低溫可以延緩厚皮甜瓜腐爛,這與王紅林等[19]的研究結(jié)果相符。綜上表明拮抗菌BG-2 與低溫結(jié)合對延緩厚皮甜瓜腐爛效果最好。
圖1 拮抗菌對新疆厚皮甜瓜腐爛率的影響Fig.1 Effect of decay rate of antagonistic bacteria on Xinjiang muskmelon
植物保護(hù)酶在植物防御系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用[20-21],其與某些病原菌的抗病性密切相關(guān),在抵御病原菌入侵中發(fā)揮積極作用[22]。研究表明貯藏期水果體內(nèi)H2O2含量隨貯藏時間延長而增加,過量H2O2會對植物細(xì)胞造成損傷,縮短貯藏期[19]。而POD 可以抑制果實(shí)體內(nèi)H2O2的生成[23-26],平衡活性氧的代謝,延緩果實(shí)的衰老[27-28]。由圖2 可知,在25 ℃和4 ℃條件下,4 種處理的過氧化物酶都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。25 ℃和4 ℃下4 種處理均在第20 d 時酶活達(dá)到最高,且T3 處理顯著高于其他處理(P<0.05),25 ℃下為5.45×103U/g,4 ℃下為3.06×103U/g。整個貯藏期間,T1 和T3 處理酶活始終高于CK 處理,這與寇莉萍等[29]的研究結(jié)果相似,這可能是由于厚皮甜瓜受到脅迫后體內(nèi)POD 活性上升從而抵御病原菌的侵染,T1 處理酶活上升說明拮抗菌能誘導(dǎo)厚皮甜瓜中POD 的活性增高[30],延長厚皮甜瓜貯藏期。
PPO 在植物體活性氧系統(tǒng)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用,能有效維持細(xì)胞內(nèi)自由基的正常水平,同時PPO 可催化植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸镜孽愇镔|(zhì)和單寧,抑制病原菌的生長[31-32]。由圖3 可知,在25 ℃條件下,多酚氧化物酶呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在4 ℃條件下,多酚氧化物酶呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。在25 ℃貯藏期間,T1 處理在第10 d 時酶活顯著高于其他處理(P<0.05),為63.2 U/g。其余3 種處理在第15 d 時酶活達(dá)到最高,此時T3 處理酶活顯著高于其他處理(P<0.05),為65.8 U/g,這可能是由于病原菌和拮抗菌結(jié)合具有協(xié)同作用[18]。在4 ℃貯藏期間,4 種處理中在第40 d 時酶活達(dá)到最高,T3 處理顯著高于其他處理(P<0.05),為69 U/g,說明低溫能有效延長PPO 活性的上升期,與袁啟鳳等[33]研究結(jié)論相似。2 種貯藏溫度下拮抗菌處理酶活始終高于CK 處理,表明拮抗菌BG-2 和低溫結(jié)合處理厚皮甜瓜能有效減緩PPO 活性的降低,延長厚皮甜瓜貯藏期。
圖3 拮抗菌對新疆厚皮甜瓜多酚氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of antagonistic bacteria on PPO activity of Xinjiang muskmelon
PAL 是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶[34],合成的酚類、植保素、木質(zhì)素和異黃酮類物質(zhì)在抵御病原菌侵染植物體中起著重要作用[35]。由圖4 可知,在25 ℃和4 ℃條件下,苯丙氨酸解氨酶呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在25 ℃貯藏期間,在第10 d 時酶活達(dá)到最高,4 種處理中T1 處理顯著高于其他處理(P<0.05),為5.55 U/g,是初始值的1.60 倍,增長較明顯。在4 ℃貯藏期間,CK、T1、T3 在第20 d 時酶活達(dá)到最高,其中,T1 處理顯著高于其他2 個處理(P<0.05),為5.72 U/g,是初始值的2.31 倍,增長明顯。40 d后T3 處理PAL 活性高于其他,可能是由于病原菌與拮抗菌結(jié)合在誘導(dǎo)PAL 酶活性中具有協(xié)同作用,T2 處理在整個貯藏期間雖然整體呈上升趨勢但增長較為平緩,且對比T1 和T3 處理始終處于較低水平。表明拮抗菌BG-2 處理厚皮甜瓜能有效減緩PAL 活性的降低從而延長厚皮甜瓜貯藏期。
圖4 拮抗菌對新疆厚皮甜瓜苯丙氨酸解氨酶活性的影響Fig.4 Effect of antagonistic bacteria on PAL activity of Xinjiang muskmelon
可溶性固形物是判斷果實(shí)是否成熟及影響果實(shí)風(fēng)味的重要指標(biāo)[36]。由圖5 可知,在25 ℃和4 ℃條件下,厚皮甜瓜的可溶性固形物含量呈現(xiàn)下降的趨勢。在整個貯藏期間,T1 處理和T3 處理可溶性固形物含量均顯著高于T2 處理(P<0.05)。在25 ℃下,貯藏第25 d 時,T1 和T3 處理的可溶性固形物分別下降了17.25%和14.19%,T2 處理下降了60.59%。在4 ℃下,貯藏第50 d 時,各處理可溶性固形物含量達(dá)到最低,T1 和T3 處理顯著高于CK 和T2 處理(P<0.05)。整個4 ℃貯藏過程T1 和T3 處理的可溶性固形物含量分別下降了15.72%和14.43%,這與趙魯寧等[37]的研究結(jié)果一致。果實(shí)中可溶性固形物中主要成分是糖類物質(zhì),而糖類物質(zhì)是果實(shí)重要的風(fēng)味物質(zhì)和能量來源[38]。低溫貯藏能有效減緩果實(shí)可溶性固形物的下降,延長貯藏期[39],與本研究中4 ℃下4 種處理可溶性固形物含量高于25 ℃相符。說明拮抗菌BG-2 與低溫結(jié)合能有效抑制厚皮甜瓜貯藏過程中可溶性固形物的下降,降低厚皮甜瓜風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)的損失。
圖5 拮抗菌對新疆厚皮甜瓜可溶性固形物的影響Fig.5 Effect of antagonistic bacteria on TSS content of Xinjiang muskmelon
由圖6 可知,在25 ℃和4 ℃條件下,厚皮甜瓜的pH 呈現(xiàn)下降的趨勢,這是由于在貯藏過程中厚皮甜瓜腐敗產(chǎn)生有機(jī)酸,導(dǎo)致pH 降低,CK 處理在第2 次取樣升高的趨勢可能是由于厚皮甜瓜的后熟消耗了有機(jī)酸[16]。在整個貯藏期間,T1 和T3 處理抑制pH 下降的能力優(yōu)于其他2 種處理。在25 ℃下,貯藏第25 d 時,T1 和T3 處理pH 顯著高于CK 和T2處理(P<0.05),整個貯藏過程T1 和T3 處理pH 分別下降了8.26%和15.09%,T2 處理下降了30.07%。在4 ℃下,貯藏第50 d 時,各處理pH 達(dá)到最低,T1和T3 處理顯著高于CK 和T2 處理(P<0.05)。整個貯藏過程中,T1 和T3 處理pH 分別下降了5.28%和7.63%,T2 處理下降了21.93%。說明低溫對抑制厚皮甜瓜pH 下降效果更好,T1 和T3 處理不僅能抑制厚皮甜瓜前期貯藏過程中pH 的上升,還能延緩后期pH 的下降,且與低溫結(jié)合效果更好。
圖6 拮抗菌對新疆厚皮甜瓜pH 的影響Fig.6 Effect of antagonistic bacteria on pH of Xinjiang muskmelon
由圖7 可知,在25 ℃和4 ℃條件下,CK 和T2 處理拮抗菌為0,T1 和T3 處理拮抗菌在厚皮甜瓜表面的定殖規(guī)律都呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢。在25 ℃貯藏條件下,T1 和T3 處理拮抗菌定殖量在前20 d 呈現(xiàn)勻速上升的趨勢,在第20 d 達(dá)到最高,T1 為5.68×106CFU/g,T3 為4.63×106CFU/g。之后拮抗菌定殖量開始下降,在第25 d 時T1 保持在3.54×106CFU/g,T3 保持在3.45×106CFU/g。在4 ℃貯藏條件下,T1 和T3 處理拮抗菌定殖量在前30 d呈現(xiàn)上升趨勢,在第30 d 達(dá)到最高,T1 為1.41×106CFU/g,T3 為1.06×106CFU/g。之后拮抗菌定殖量開始下降,在第50 d 時T1 保持在1.06×106CFU/g,T3 保持在5.50×105CFU/g。說明拮抗菌BG-2 能在厚皮甜瓜表面穩(wěn)定定殖且保持有效的定殖量。
圖7 拮抗菌在新疆厚皮甜瓜表面的定殖特性Fig.7 Colonization characteristics of antagonistic bacteria on the surface of Xinjiang muskmelon
本研究初步探明了25 ℃和4 ℃下拮抗菌BG-2 對新疆厚皮甜瓜貯藏期保鮮效果和保護(hù)酶活性的影響。結(jié)果表明,2 種溫度貯藏期貯藏結(jié)束時,接種拮抗菌BG-2 的厚皮甜瓜T1 處理腐爛率顯著低于T2 處理(P<0.05),對抑制厚皮甜瓜pH 和可溶性固形物含量的下降也顯著優(yōu)于CK 和T2 處理(P<0.05)。厚皮甜瓜保護(hù)酶POD 和PAL 活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,PPO 活性在25 ℃下呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在4 ℃下呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。接種拮抗菌BG-2 的厚皮甜瓜3 種酶活性顯著高于CK 和T2 處理(P<0.05)。在25 ℃和4 ℃下貝萊斯芽孢桿菌BG-2 均能在厚皮甜瓜表面定殖,降低厚皮甜瓜腐爛率,延緩pH 和可溶性固形物的下降,延緩貯藏期厚皮甜瓜果實(shí)內(nèi)POD、PPO 和PAL 活性下降,尤其與低溫相結(jié)合效果更好。