運動應激對衰老大鼠神經(jīng)免疫功能及HPA軸皮質(zhì)酮分泌的影響

劉忠民，呂振磊，高曉新，尹 超

(海南科技職業(yè)大學健康科學學院，海南 海口571126)

下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫、情緒應激、炎性反應密切相關(guān)，是機體主要的免疫調(diào)控通路[1]。運動實際上是一種強有力的刺激，促進生理和代謝適應，如腦的可塑性和細胞重塑的變化。人體機體當受到外界刺激時，會激活HPA軸，從而促使腎上腺皮質(zhì)激素的合成和分泌，皮質(zhì)酮分泌過多會誘發(fā)腎上腺腫瘤和提高心血管疾病的發(fā)病率，皮質(zhì)酮分泌過低會導致身體器官功能衰退[2]。研究認為HPA軸在神經(jīng)免疫網(wǎng)絡發(fā)揮重要重用，D-半乳糖衰老建模屬于惡性刺激，惡性刺激會引起神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，進而誘發(fā)各種疾病，如惡性腫瘤。長期適宜的運動應激屬于良性刺激，其作用機制是多方面的。因此，本研究通過觀察運動應激刺激對衰老大鼠不同腦區(qū)5-羥色胺(5-HT)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)及外周血皮質(zhì)酮的影響，探討HPA軸的神經(jīng)免疫機制及運動對其干預的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

6周齡SPF級雄性 Sprange-Dawley大鼠 32只(湖南實驗動物有限責任公司提供),體重 350 g-400 g,隨機分為4組：對照組、衰老組、運動組、衰老運動組。大鼠均分籠飼養(yǎng)于海南醫(yī)學院動物實驗室，自由飲水與攝食，每隔一天定時清理鼠籠、更換墊料。環(huán)境溫度25℃，相對濕度60%-70%，自然晝夜交替。

1.2 D-半乳糖衰老模型及運動方案

(1)本實驗采用D-半乳糖腹腔注射建立衰老氧化應激模型[3]，衰老組大鼠腹腔注射10%的D-半乳糖溶液1 mL/(kg·d)，對照組腹腔注射等體積的生理鹽水,連續(xù)8周。(2) 根據(jù)BEDFORD 等[4]研究，實驗大鼠進行一周的適應訓練，跑臺坡度設(shè)為0，跑臺速度最終達到1.1 km/h,持續(xù)運動8周。具體運動應激負荷強度如表1所示。

表1 各運動組大鼠運動應激負荷強度

1.3 取材

實驗干預結(jié)束24 h后，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后處死大鼠，采集血清和腦組織。腹腔動脈采血，30 min后離心分離血清(4℃，3 500 r/min離心10 min)，-80℃冰箱保存。取血結(jié)束后，仔細并迅速取出大鼠的腦組織。在冷板上立即從大腦將海馬和前額葉皮質(zhì)分離暫放盛有干冰的保溫箱里，最終用液氮冷凍后儲存在-80℃的冰箱中進行后續(xù)的生化分析。

1.4 指標檢測

(1)通過使用硫代巴比妥酸反應物質(zhì)(TBARS)測定法估計海馬、皮質(zhì)MDA丙二醛(MDA)水平(軟件版本：2.09.2檢測速度:正常,延遲:100 msec,測量值/數(shù)據(jù)點:8 實際溫度:24.5)。(2)細胞因子檢測：海馬、皮質(zhì)T-SOD、5-羥色胺(5-HT)，大鼠血清皮質(zhì)酮水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA試劑盒,江萊生物)。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 長期運動應激對大鼠海馬抗氧化能力的影響

D-半乳糖衰老應激模型組大鼠海馬MDA、T-SOD含量與對照組相比均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，衰老運動組與衰老組相比，MDA含量低于衰老組(P<0.05)，衰老運動組T-SOD明顯高于衰老組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。衰老運動組海馬T-SOD含量高于對照組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 各組大鼠海馬MDA、T-SOD水平(n=8,μmol·g-1)

2.2 長期運動應激對大鼠不同腦區(qū)5-羥色胺水平的影響

與對照組相比，衰老組不同腦區(qū)5-HT表達均下降P(<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義；運動組5-HT顯著性表達增加(P<0.01)，具有極其顯著性差異；衰老運動組與衰老組相比，海馬和前額葉皮質(zhì)中5-HT均增加(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 各組大鼠海馬、前額葉皮質(zhì)中5-HT的表達水平(n=8,ng/g)

2.3 長期運動應激對衰老大鼠血清皮質(zhì)酮的影響

從表4可以看出，與對照組相比，衰老組與運動組血清中皮質(zhì)酮含量明顯增加(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義；衰老運動組與衰老組相比，運動組+衰老組血清中皮質(zhì)酮明顯增加(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。

表4 各組大鼠血清中皮質(zhì)酮的含量(μg·L-1)

3 討論

機體長期良性刺激可以抵抗氧化應激對細胞帶來損傷，產(chǎn)生保護性適應，增強神經(jīng)內(nèi)分泌功能[5]。劉洪珍等研究發(fā)現(xiàn)[6]，進行有氧運動干預組人的海馬中MDA含量較對照組相比，具有極低的水平，安靜狀態(tài)下表現(xiàn)出極顯著性差異(P<0.01)；運動應激提高了谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性。國外實驗研究表明，運動應激對情緒和認知的改善可能由于它作用在海馬神經(jīng)的因素[7]。海馬體在認知、情緒調(diào)節(jié)、壓力反應、學習、記憶甚至預測未來事件方面發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果表明，運動應激可以對大腦的抗氧化系統(tǒng)效力產(chǎn)生積極作用，從而改善認知功能。超氧化物歧化酶(SOD)是參與氧代謝的重要酶，可將超氧自由基轉(zhuǎn)化為氧氣或過氧化氫[8]。SOD活力高代表這機體清除超氧陰離子自由基能力強。本實驗結(jié)果顯示，衰老組海馬中MDA含量顯著性增加(P<0.01)，而T-SOD含量明顯降低(P<0.01)，表明D-半乳糖注射引起的衰老應激脂質(zhì)過氧化程度高，自由基清除能力減弱，間接證明細胞損傷嚴重。在檢測各組大鼠海馬組織中總超氧化物歧化酶(T-SOD)時發(fā)現(xiàn)，衰老組大鼠T-SOD活力明顯要低于對照組;衰老運動組與衰老組相比，T-SOD在衰老運動組表現(xiàn)出較高的水平，這說明長期運動刺激使T-SOD酶活性顯著提高。實驗表明長期運動刺激能夠減少MDA的產(chǎn)生，增強T-SOD的含量，減少神經(jīng)細胞損傷。

5-HT是一種能產(chǎn)生愉悅情緒的信使，幾乎影響到大腦活動的每一個方面，從調(diào)節(jié)情緒、精力、記憶力到生命觀均有涉及。以前的研究更多地關(guān)注5-HT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的作用。然而，5-HT也與腫瘤，炎癥和病原體感染的病理病例有很強的關(guān)系[9]。5-HT參與腫瘤細胞遷移，轉(zhuǎn)移擴散和血管生成[9]。下丘腦與神經(jīng)垂體與腺垂體的聯(lián)系是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的關(guān)鍵。達娜·沃爾夫等[10]人進行了單劑量選擇性5-HT再攝取抑制劑(艾司西酞普蘭)對虛擬暴力期間情緒調(diào)節(jié)的研究，結(jié)果顯示，暴力背景下的情緒調(diào)節(jié)由5-HT調(diào)節(jié)。不同情緒應激反應直接影響5-HT的表達。本次實驗結(jié)果顯示衰老組大鼠海馬和前額葉皮質(zhì)區(qū)5-HT含量均明顯降低(P<0.01)，實驗結(jié)果表明惡性刺激(D半乳糖注射)可能通過使HPA軸紊亂，進而導致大鼠5-HT含量降低，導致衰老加劇。運動組兩個腦區(qū)5-HT含量明顯增加(P<0.01)，說明長期的良性應激能夠保持HPA軸平衡，增加有益激素的分泌，對機體進行調(diào)控。對照組中5-HT水平較低，但通過運動應激明顯增加了大鼠不同腦區(qū)5-HT水平，結(jié)果表明在改善不同腦區(qū)氧化應激水平中，運動應激起到了重要的作用。

生理和心理壓力導致皮質(zhì)酮增加的主要機制與下丘腦-垂體-腎上腺通路的活性有關(guān)。國外研究表明，運動員的皮質(zhì)醇濃度低于運動前久坐的個體。皮質(zhì)酮的降低可能是通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺通路和負反饋系統(tǒng)的活性或降低TNF-a水平、炎癥和氧化應激標志物以及增加SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶的抗氧化活性來誘導的(GPx)，神經(jīng)營養(yǎng)表達[11]。衰老會使皮質(zhì)酮水平增加[12-14]，本實驗結(jié)果表明也衰老組大鼠皮質(zhì)酮水平明顯增加(P<0.05)。運動應激即刻會增加血清中皮質(zhì)酮水平，但恢復后低于運動前靜息水平。研究表明[15]，在強迫游泳或熱應激期間，皮質(zhì)醇在3分鐘內(nèi)增加到最高水平，40分鐘達到最大值，證實了在不同應激條件下血清中皮質(zhì)酮的變化。運動刺激皮質(zhì)酮增加的主要機制在于下丘腦刺激促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)的產(chǎn)生，進而刺激垂體中的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)。ACTH刺激腎上腺釋放皮質(zhì)醇激素(嚙齒動物中稱為皮質(zhì)酮)[16]。通常，當壓力源或?qū)ζ鞴俚耐{停止時，一個綜合的負反饋回路系統(tǒng)會停止皮質(zhì)醇的產(chǎn)生，但長期暴露于壓力源會導致皮質(zhì)醇的持續(xù)產(chǎn)生，從而導致紊亂。通過本實驗研究表明，運動應激改善HPA軸平衡很可能由于刺激皮質(zhì)酮負反饋回路系統(tǒng)，改善負反饋回路系統(tǒng)的抗應激作用，從而改善神經(jīng)退化，增加海馬體積，減少炎癥，進而與運動刺激的其他通路協(xié)同增強中樞神經(jīng)免疫系統(tǒng)。

綜上，本研究通過長期運動應激對衰老大鼠神經(jīng)免疫功能及HPA軸皮質(zhì)酮分泌的動物實驗可得出：良性刺激(長期運動干預)能夠減少實驗大鼠大腦細胞脂質(zhì)過氧化作用，增加清除超氧陰離子自由基能力，減少神經(jīng)細胞損傷；同時能夠通過增加兩個腦區(qū)5-HT含量，維持下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)的平衡，長期運動刺激能夠增加血清中皮質(zhì)酮水平；惡性刺激(D-半乳糖注射)增加神經(jīng)細胞的氧化應激，擾亂了下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)的平衡，破壞機體內(nèi)環(huán)境，加速大鼠衰老的形成。運動組大鼠腦區(qū)T-SOD明顯高于衰老組，表明長期的良性刺激可增強神經(jīng)抗氧化能力，減少大鼠神經(jīng)免疫功能的損害，從而維持機體免疫穩(wěn)態(tài)，預防腫瘤等疾病的發(fā)生。