溫敏型水凝膠包載布比卡因?qū)ρ娱L(zhǎng)神經(jīng)阻滯時(shí)間的研究

郭 穎，郭 傲，路 暢，劉國(guó)梁，周升柱，王吉蘋，石宏宇，劉鐵成*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 麻醉科，吉林 長(zhǎng)春130041；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 內(nèi)鏡中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

外科手術(shù)常常通過應(yīng)用局部麻醉藥阻斷手術(shù)部位的神經(jīng)傳導(dǎo)從而達(dá)到鎮(zhèn)痛的效果。理想的局麻藥應(yīng)該在具有良好的鎮(zhèn)痛效果的同時(shí)沒有局部刺激作用，致敏程度低，較高的治療指數(shù)以及感覺阻滯遠(yuǎn)大于運(yùn)動(dòng)阻滯等特點(diǎn)，然而同時(shí)具備上述特征的理想藥物是不存在的[1]。

水凝膠是一種通過物理或者化學(xué)交聯(lián)的、遇水膨脹的三維立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。環(huán)境敏感水凝膠可以對(duì)類似于溫度、pH、酶促反應(yīng)等做出反應(yīng)的智能水凝膠。我們最常用的包載局麻藥的水凝膠為溫度敏感型水凝膠，絕大多數(shù)的溫敏型水凝膠在室溫下為液體狀態(tài)，在更高的溫度下(譬如體溫)即可轉(zhuǎn)變?yōu)槟z體狀態(tài)[2]。為了延長(zhǎng)單次注射局部麻醉藥制劑所產(chǎn)生的作用時(shí)間，將臨床上常見水溶性局麻藥包載于可注射的、生物可降解的、溫度敏感性的水凝膠中，研究坐骨神經(jīng)阻滯延長(zhǎng)的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

Pluronic F127(Sigma-Aldrich 上海貿(mào)易有限公司)；PAla-PEG-PAla(中科院生態(tài)環(huán)境高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)；PLGA-PEG-PLGA(長(zhǎng)春圣博瑪生物材料有限公司)；鹽酸布比卡因(北京華奉聯(lián)博科技有限公司)；彈性蛋白酶(Merck公司，德國(guó)，達(dá)姆施塔特)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1載藥水凝膠的制備 將臨床常用的鹽酸布比卡因(bupivacaine hydrochloride，BUP)堿化沉淀制成疏水制劑(布比卡因游離堿,bupivacaine free base，BFB)，并包載于水凝膠中。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買20只體重介于260 g-320 g之間的年輕成年雄性Wistar大鼠。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合吉林大學(xué)動(dòng)物保健和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的協(xié)議。動(dòng)物被單獨(dú)安置在自然光明/黑暗條件下的塑料籠子里，供應(yīng)充足的食物和水。實(shí)驗(yàn)前預(yù)適應(yīng)環(huán)境至少2周。

1.2.3大鼠坐骨神經(jīng)阻滯 大鼠隨機(jī)分為4組，每組5只大鼠，乙醚吸入麻醉后行坐骨神經(jīng)阻滯術(shù)，分別給予：1)0.75 wt.% BUP·HCl溶液PBS(對(duì)照組)；2)0.75 wt.% BFB Pluronic F127水凝膠，稱為Pluronic F127/BFB；3)0.75 wt.% BFB PAla-PEG-PAla水凝膠,PAla-PEG-PAla/BFB；4)0.75 wt.% BFBPLGA-PEG-PLGA水凝膠，標(biāo)記為PLGA-PEG-PLGA/BFB。每只大鼠給予0.6 ml的藥物制劑。

1.3 神經(jīng)狀態(tài)評(píng)估

1.3.1通過改良后的熱盤試驗(yàn)對(duì)痛覺阻滯的有效性進(jìn)行評(píng)估[3]熱盤的溫度設(shè)定在可以提供一個(gè)8-10 s左右的供被測(cè)試大鼠抬腿的反應(yīng)時(shí)間，溫度的準(zhǔn)確性通過利用溫度計(jì)來保證。被測(cè)試大鼠的后足被依次放置在熱板上(先右再左)，應(yīng)用秒表記錄老鼠的肢體抬足反射或?qū)е聞?dòng)物舔爪子的時(shí)間，即反應(yīng)時(shí)間。為了避免在測(cè)試過程中發(fā)展為痛覺過敏或熱損傷,我們?cè)O(shè)定30 s為截止時(shí)間。在給藥前2天獲得每只大鼠自身的熱反應(yīng)測(cè)量基線。給藥后，在所選擇設(shè)定的每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每只大鼠都將測(cè)試一式3份，取平均值為熱延遲時(shí)間。為了方便組間比較,我們把數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為最大比例效應(yīng)(MPE%)使用以下方程：MPE%=[(P-B)/(C-B)]×100%。其中，P是平均基線反應(yīng)時(shí)間，B為平均治療反應(yīng)時(shí)間，C是截止時(shí)間。

1.3.2運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)估具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]1分代表正常外觀；2分表示當(dāng)抬起大鼠尾巴時(shí)足背屈及腳趾完全張開；3分表示足跖屈且沒有能力展開腳趾；4分表示完全喪失的背屈、跖屈的能力，及伴有步態(tài)障礙。為了比較，運(yùn)動(dòng)阻滯的持續(xù)時(shí)間從4分-2分，2分起開始復(fù)蘇。

1.3.3坐骨神經(jīng)周圍組織大體解剖學(xué)和形態(tài)學(xué)大鼠在給藥后第7天予以處死、解剖。收集注射水凝膠臨近的坐骨神經(jīng)，以及周圍的肌肉組織。坐骨神經(jīng)和肌肉標(biāo)本用石蠟固定,HE染色。在大體解剖下，主要觀察局部組織層次是否可以輕易分開，以及局部是否有顯著粘連和疤痕形成。在顯微鏡下，局部的組織壞死以及是否有炎癥細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)浸潤(rùn)均被納入觀察評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有的數(shù)據(jù)描述均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。三組水凝膠載藥與對(duì)照組(BUP·HCl組)之間的組間差異分析均利用SPSS(Version 18.0，IBM Corporation,Armonk,New York)軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)。以P<0.05、P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[5]。

2 結(jié)果

將局部麻醉藥物封裝在水凝膠結(jié)構(gòu)可以有效延長(zhǎng)單次注射后鎮(zhèn)痛持續(xù)時(shí)間。水凝膠在體內(nèi)的存留時(shí)間是影響藥物釋放的重要因素。BUP·HCl組在注射給藥后5 h即恢復(fù)完整的感覺功能(圖1)。通過分析測(cè)定的MPE%值可以看出，Pluronic F127/BFB組(0± 100%)和PAla-PEG-PAla/BFB組(93.76%±3.96%)在5 h時(shí)與對(duì)照組(BUP·HCl組)(73.62%±8.63%)相比較組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在6 h，BUP·HCl組(0.01%±2.26%)和Pluronic F127/BFB(84.51%±6.85%)或PAla-PEG-PAla/BFB(51.93%±7.43%)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義更加顯著。然而，PLGA-PEG-PLGA/BFB組在任何時(shí)間點(diǎn)與BUP·HCl組相比均未體現(xiàn)出明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣，所有大鼠在給藥后即可觀察到完全的運(yùn)動(dòng)阻滯。每隔1 h，對(duì)組間運(yùn)動(dòng)阻滯的評(píng)分進(jìn)行分析和比較。如圖2所示，當(dāng)相比BUP·HCl組(2.8±0.45，1.4±0.55，1±0，1±0)，PAla-PEG-PAla/BFB的(3.8±0.45，3.2±0.58，2.8±0.58，2.4±0.58)組從3 h-6 h運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分均顯示出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著差異。PluronicF127/BFB組(2.6±0.55，2.6±0.55，1.8±0.45)在4 h-6 h之間與對(duì)照組相比下具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PLGA-PEG-PLGA組(2.5±0.58)在4 h時(shí)與對(duì)照組有顯著性差異。運(yùn)動(dòng)阻滯持續(xù)時(shí)間的中位數(shù)PAla-PEG-PAla/BFB(9 h)幾乎為BUP·HCl(5 h)的2倍，雖然僅略長(zhǎng)于PluronicF127/BFB組(8 h)。BUP·HCl組的運(yùn)動(dòng)阻滯時(shí)間只持續(xù)了4 h，然后迅速恢復(fù)至基線,我們推測(cè)可能的原因是藥物的再分配和/或消除作用。運(yùn)動(dòng)功能比痛覺功能更快恢復(fù)(圖2)。在感覺和運(yùn)動(dòng)阻滯測(cè)試后，所有的動(dòng)物完全恢復(fù)，沒有觀察到殘留的感覺或運(yùn)動(dòng)障礙。

圖1 注射載藥水凝膠后大鼠熱盤實(shí)驗(yàn)中的MPE

圖2 注射載藥水凝膠的大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分

所有大鼠均未觀察到明顯的神經(jīng)毒性，但包載有水凝膠的組別局部肌肉組織炎癥反應(yīng)明顯。相于比BUP·HCl組，PluronicF127組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更明顯。BUP·HCl組沒有觀察到明顯的組織學(xué)異常。PAla-PEG-PAla/BFB和PLGA-PEG-PLGA/BFB組炎癥反應(yīng)尤為明顯，我們可以觀察到明顯的成纖維細(xì)胞的增生，局部組織的壞死，以及骨骼肌間炎癥細(xì)胞的廣泛浸潤(rùn)。

3 討論

坐骨神經(jīng)阻滯的評(píng)估主要從大鼠對(duì)疼痛的反應(yīng)以及運(yùn)動(dòng)功能方面的影響[5]。所有動(dòng)物注射包載有BFB的水凝膠后10 min即表現(xiàn)出完整的運(yùn)動(dòng)及感覺阻滯，也就是說，局麻藥的起效時(shí)間并未受控制釋放的影響。感覺復(fù)蘇的順序(由早到晚)為BUP·HCl>PLGA-PEG-PLGA/BFB>PAla-PEG-PAla/BFB>Pluronic F127/BFB。在熱盤試驗(yàn)中不同組間所體現(xiàn)出的痛覺延遲的差異取決于水凝膠降解時(shí)間。水凝膠較長(zhǎng)的降解時(shí)間似乎提供了一個(gè)藥物釋放曲線以及更長(zhǎng)的局部麻醉持續(xù)時(shí)間。然而，給予PLGA-PEG-PLGA/BFB治療組與對(duì)照組BUP·HCl相比運(yùn)動(dòng)和感覺阻滯方面均未體現(xiàn)出明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

比較圖1和圖2，運(yùn)動(dòng)機(jī)能比痛覺功能更快恢復(fù)，這與之前的研究相符合[6]。盡管所有神經(jīng)纖維均受局部麻醉劑的作用，神經(jīng)軸突的痛覺傳遞在較低的局麻藥濃度下即可受到影響。根據(jù)臨床觀察及現(xiàn)有的一些研究顯示，軸突的直徑和大小仍然是影響傳導(dǎo)速度的重要因素[7]。傳導(dǎo)速度較慢的、細(xì)小的感覺神經(jīng)軸突(A-δ有髓和C-無髓鞘的纖維)比快傳導(dǎo)的，粗大的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)軸突(A-α有髓纖維)對(duì)于局部麻醉藥顯示出的更強(qiáng)的敏感性。本研究中描述的控釋水凝膠配方可能通過藥物的緩慢低濃度釋放,延遲痛覺恢復(fù)[6]。

PAla-PEG-PAla和PLGA-PEG-PLGA均為PEG為基鏈的三嵌段聚合物，均已經(jīng)通過美國(guó)FDA(食品及藥物管理局)藥理應(yīng)用程序[8]。PAla-PEG-PAla合成同源聚-氨基酸復(fù)合物,這是類似于自然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。而通常認(rèn)為水凝膠PluronicF127的成膠過程是從凝膠溶液的單聚體平衡狀態(tài)向膠束形成的平衡狀態(tài)，膠束中存在大量游離水,導(dǎo)致PluronicF127僅體內(nèi)存留很短的時(shí)間。即PluronicF127凝膠降解并通過表面侵蝕，另外2個(gè)水凝膠通過上述機(jī)制降解[7]。在我們的研究中使用所有的水凝膠均顯示了良好的持久性、強(qiáng)度以及一定的黏度，這些屬性使局部麻醉劑的整合得以實(shí)施并已經(jīng)證明能夠進(jìn)一步延長(zhǎng)釋放期。因此，藥物可能在膠束形成過程中均勻包裹于可溶性聚合物，從而可以控制藥物從凝膠聚合物中釋放的模式[9]。

在組織學(xué)檢查過程中，PAla-PEG-PAla/BFB組可以觀察到明顯的局部充血和以及廣泛的膠原增生。炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度似乎與凝膠在體內(nèi)的存留時(shí)間成正比。PLGA-PEG-PLGA在體內(nèi)的存留時(shí)間遠(yuǎn)超過其對(duì)于神經(jīng)阻滯效果的延長(zhǎng)，局部組織的炎癥反應(yīng)使其并非局部麻醉藥載體最佳選擇。具有較短體內(nèi)降解時(shí)間的水凝膠能夠更好的兼顧藥效作用時(shí)間延長(zhǎng)與局部組織炎癥反應(yīng)的最小化。即選擇體內(nèi)降解時(shí)間與藥物藥效時(shí)間相接近生物材料載體能夠最大程度的提高療效,減少副作用。