中藥聯(lián)合益生菌對大腸桿菌性小鼠腹瀉的保護(hù)作用

李春亭，王沙沙，趙 欣，王 巍，葛冰潔，張雪梅

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002)

腹瀉是一種多因素引起的腸道疾病，主要包括細(xì)菌性腹瀉、病毒性腹瀉、寄生蟲腹瀉等[1]，其中危害最嚴(yán)重的是細(xì)菌性腹瀉。多種細(xì)菌菌株已被確認(rèn)是細(xì)菌性腹瀉的病原體，其中致病性大腸桿菌是造成動物細(xì)菌性腹瀉最常見的病原菌之一[2-3]，可感染所有種類及年齡的家禽和哺乳動物[4]。當(dāng)飼養(yǎng)環(huán)境受到污染或機(jī)體免疫力下降時(shí)，致病性大腸桿菌菌群數(shù)量發(fā)生改變，導(dǎo)致炎癥發(fā)生，髓過氧化物酶(MPO)活性升高等[5]，從而引起機(jī)體腹瀉、脫水并伴隨其他臟器損傷[6]。大腸桿菌引起的腹瀉會導(dǎo)致動物機(jī)體生理功能紊亂、生產(chǎn)性能下降，甚至引起動物死亡，目前獸醫(yī)臨床上對細(xì)菌性腹瀉多采用抗生素療法，但易產(chǎn)生細(xì)菌抗藥性，同時(shí)抗生素殘留也會危害人類健康[7]。

中藥在治療腹瀉類疾病中展現(xiàn)出不可替代的優(yōu)勢，益生菌也為調(diào)節(jié)腸道菌群提供了新的策略[8]。與抗生素相比，中藥副作用小且兼具抗菌消炎作用[9]。蒲公英、黃芪等多種中藥活性成分都具有良好的抑菌效果和免疫調(diào)節(jié)作用[10-11]。益生菌也可通過生物奪氧、生物頡頏等改善腸道菌群[12-13]，其中枯草芽孢桿菌應(yīng)用較為廣泛[14]。但在臨床應(yīng)用中，單味中藥很難完全取代抗生素[15]，長期單獨(dú)服用益生菌也容易使機(jī)體產(chǎn)生依賴性，喪失繁殖益生菌的能力[16]。中藥和益生菌在治療疾病的過程中能相互作用、相互影響，一方面益生菌可以促進(jìn)中藥的吸收和利用，另一方面中藥可以促進(jìn)益生菌的增殖、抑制有害菌增殖、維持腸道微生態(tài)平衡[17]，兩者協(xié)同可提高藥效。本試驗(yàn)通過建立致病性大腸桿菌小鼠腹瀉模型，利用中藥蒲公英、黃芪與益生菌枯草桿菌等聯(lián)合處理，檢測小鼠腹瀉、體重、采食量、臟器系數(shù)、糞便隱血和MPO活性等，研究其聯(lián)合應(yīng)用對大腸桿菌性腹瀉的保護(hù)作用，為中藥聯(lián)合益生菌在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為動物養(yǎng)殖中細(xì)菌性腹瀉提供有效的臨床藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 5～6周齡清潔級昆明小鼠110只，體重(20±2)g，購自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)于隔離籠中，自由采食、飲水，實(shí)驗(yàn)室溫度(24±1)℃，相對濕度40%～80%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 亞硒酸鹽胱氨酸増菌液(SC)、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)、HE瓊脂、營養(yǎng)肉湯(NB)、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、LB肉湯等均購自青島海博生物公司；人糞便隱血測試盒(聯(lián)苯胺法)購自南京建成生物工程研究所；小鼠MPO活性測定試劑盒購自Biolegend公司。

1.1.3 菌株 枯草桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(編號：63501)購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所。大腸桿菌為從延邊地區(qū)養(yǎng)殖場疑似大腸桿菌病病雞的心臟、盲腸和直腸中分離、純化鑒定得到的，并經(jīng)致死性試驗(yàn)得到用于制作小鼠腹瀉模型的注射劑量為1×107CFU/kg。

1.1.4 藥物制備及正交試驗(yàn) 蒲公英和黃芪均購自延吉同仁堂大藥房。蒲公英干草采用水煎法，合并濾液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀70 ℃濃縮制備蒲公英提取物；黃芪采用水提醇沉法，無水乙醇洗滌沉淀，60 ℃烘干制備黃芪多糖，采用乙醇回流石油醚萃取法，80%乙醇、80 ℃水浴回流2 h，石油醚萃取取下層液制備黃芪總黃酮；按照4因素3水平(表1)、L9(34)正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以細(xì)菌計(jì)數(shù)為指標(biāo)分析各因素對大腸桿菌的抑菌效果，通過極差分析方法篩選中藥聯(lián)合益生菌各因素的最佳配比。

表1 因素水平表

1.2 小鼠分組及處理

將60只小鼠隨機(jī)分為空白組(Blank)、模型組(Model)、中藥組(TCM)、益生菌組(Prob)和中藥聯(lián)合益生菌組(TCM+Prob)，每組12只?？瞻捉M小鼠腹腔注射生理鹽水(0.2 mL/只)，模型組、中藥組、益生菌組和中藥聯(lián)合益生菌組均先腹腔注射分離菌懸液1×107CFU/kg，然后中藥組按10 mL/kg灌胃中藥液(其中蒲公英提取物濃度為0.25 g/mL,黃芪總黃酮和黃芪多糖濃度均為0.05 g/mL)，益生菌組按4 mL/kg灌胃枯草桿菌懸液(菌含量5×107CFU/mL)，中藥聯(lián)合益生菌組按上述量灌胃中藥液和枯草桿菌混合液，每天定時(shí)灌胃給藥1次，連續(xù)3 d。

建模判定標(biāo)準(zhǔn)：體重下降，飲食量減少，眼瞼分泌物增多，動作遲緩，反應(yīng)遲鈍，屁股有明顯污跡等。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 樣品采集 各試驗(yàn)組于末次給藥12 h后進(jìn)行采樣。小鼠經(jīng)眼球采血，一部分血液立即進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)分析；一部分血液分離血清于-20 ℃保存。處死后取小腸組織于-80 ℃保存，用于MPO活性測定；取其心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟用于臟器系數(shù)測定，取小鼠腸內(nèi)糞便用于糞便隱血及腸內(nèi)大腸桿菌數(shù)測定。

1.3.2 臨床癥狀 注射分離菌懸液后開始每日記錄各組小鼠體重、采食量及臨床癥狀，連續(xù)3 d，試驗(yàn)結(jié)束計(jì)算小鼠腹瀉率、稀便率、死亡率、治愈率和腹瀉指數(shù)。

腹瀉率(%)=腹瀉小鼠數(shù)/小鼠總數(shù)×100%

死亡率(%)=死亡小鼠數(shù)/小鼠總數(shù)×100%

治愈率(%)=治愈小鼠數(shù)/腹瀉小鼠數(shù)×100%

稀便率(%)=每只動物稀便數(shù)/每只動物總便數(shù)×100%

腹瀉指數(shù)=稀便率×稀便級[18]

1.3.3 臟器系數(shù)測定 分離小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟，稱量并計(jì)算臟器系數(shù)。

臟器系數(shù)(%)=臟器重量/小鼠體重×100%

1.3.4 血液學(xué)指標(biāo)檢測 采用全自動血細(xì)胞分析儀分析各組小鼠淋巴細(xì)胞比率(LYM)、中間細(xì)胞比率(MID)、粒細(xì)胞比率(GRAN)和白細(xì)胞總數(shù)(WBC)等血液學(xué)指標(biāo)。

1.3.5 糞便隱血檢測及腸內(nèi)容物大腸桿菌計(jì)數(shù) 取各組小鼠糞便涂在白瓷板上，滴加鄰聯(lián)苯胺液后再滴加過氧化氫液，觀察糞便隱血結(jié)果。取各組小鼠腸內(nèi)容物0.1 mL加入0.9 mL生理鹽水中混合靜置，取上清液，用生理鹽水稀釋至適宜濃度。取100 μL上清液涂在EMB平板上37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.6 MPO活性檢測 采集血清和小腸組織勻漿，參照ELISA試劑盒說明書檢測血清和小腸組織MPO活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，各因素體外抑制大腸桿菌的效果為A(蒲公英粗提物)>B(黃芪多糖)>D(枯草桿菌)>C(黃芪總黃酮)；中藥聯(lián)合益生菌各因素最佳配比為A1B2C2D2，后續(xù)試驗(yàn)中所用的中藥聯(lián)合益生菌藥液均根據(jù)此配比配制。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 中藥聯(lián)合益生菌對大腸桿菌性腹瀉小鼠臨床指標(biāo)的影響

由表3可知，給藥3 d后空白組小鼠無腹瀉癥狀，模型組腹瀉率100%、無自愈現(xiàn)象，中藥組和中藥聯(lián)合益生菌組腹瀉率均為35%，益生菌組腹瀉率為75%，益生菌組和中藥組治愈率分別為50%和75%，中藥聯(lián)合益生菌組治愈率達(dá)100%。試驗(yàn)期間小鼠無死亡現(xiàn)象。由圖1可知，與空白組相比，模型組腹瀉指數(shù)極顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，中藥組、益生菌組、中藥聯(lián)合益生菌組腹瀉指數(shù)均極顯著下降(P<0.01)，中藥聯(lián)合益生菌組治療效果最明顯。

表3 各組小鼠臨床指標(biāo)

①模型組與空白組比較，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。②藥物組與模型組比較，#，差異顯著(P<0.05)；##，差異極顯著(P<0.01)；無#，差異不顯著(P>0.05)。下同①M(fèi)odel group was compared with blank group, *, Significant difference (P<0.05); **, Extremely significant difference (P<0.01); No *, No significant difference(P>0.05). ②Drug treatment groups were compared with model group, #, Significant difference (P<0.05); ##, Extremely significant difference (P<0.01); No #, No significant difference(P>0.05). The same as below圖1 各組小鼠的腹瀉指數(shù)Fig.1 Diarrhea index of mice in each group

2.3 中藥聯(lián)合益生菌對大腸桿菌性腹瀉小鼠體重及采食量的影響

由圖2可知，與空白組相比，模型組小鼠體重極顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，中藥組小鼠體重在第2、3天顯著性上升(P<0.05)，中藥聯(lián)合益生菌組體重在第1天顯著上升(P<0.05)，第2、3天極顯著上升(P<0.01)，益生菌組體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。由圖3可知，與空白組相比，模型組小鼠采食量極顯著下降(P<0.01)，與模型組相比，中藥組、中藥聯(lián)合益生菌組采食量極顯著上升(P<0.01)，益生菌組采食量無顯著差異(P>0.05)。

圖2 各組小鼠的體重Fig.2 Body weight of mice in each group

圖3 各組小鼠的采食量Fig.3 Diet quantity of mice in each group

2.4 中藥聯(lián)合益生菌對大腸桿菌性腹瀉小鼠臟器系數(shù)的影響

由圖4可知，與空白組相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，脾臟指數(shù)極顯著升高(P<0.01)，心臟、肺臟、腎臟器官指數(shù)無顯著差異(P>0.05)；與模型組相比，中藥組小鼠肝臟、脾臟指數(shù)顯著下降(P<0.05)，中藥聯(lián)合益生菌組小鼠肝臟、脾臟指數(shù)極顯著下降(P<0.01)，心臟、肺臟、腎臟指數(shù)無顯著差異(P>0.05)，益生菌組各臟器系數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 各組小鼠的臟器系數(shù)Fig.4 Viscera coefficient of mice in each group

2.5 中藥聯(lián)合益生菌對大腸桿菌性腹瀉小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

由表4可知，與空白組相比，模型組LYM極顯著下降(P<0.01)，MID顯著下降(P<0.05)，GRAN極顯著上升(P<0.01)，WBC無顯著差異(P>0.05)；與模型組相比，中藥組、益生菌組、中藥聯(lián)合益生菌組LYM顯著上升(P<0.05),GRAN顯著下降(P<0.05)，WBC、MID無顯著差異(P>0.05)。

表4 各組小鼠的血液學(xué)指標(biāo)

2.6 中藥聯(lián)合益生菌對大腸桿菌性腹瀉小鼠糞便隱血和腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)量的影響

由表5可知，模型組小鼠糞便隱血檢測結(jié)果均呈現(xiàn)強(qiáng)陽性，而中藥組、益生菌組呈現(xiàn)弱陽性，空白組、中藥聯(lián)合益生菌組結(jié)果均為陰性；對腸內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大腸桿菌數(shù)量極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，中藥組、益生菌組、中藥聯(lián)合益生菌組大腸桿菌數(shù)量均極顯著降低(P<0.01)。

表5 各組小鼠糞便隱血情況和腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)量

2.7 中藥聯(lián)合益生菌對大腸桿菌性腹瀉小鼠MPO的影響

由圖5可知，與空白組相比，模型組小鼠血清、小腸組織MPO活性均極顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，中藥組、益生菌組和中藥聯(lián)合益生菌組血清MPO活性極顯著下降(P<0.01)，中藥組小腸組織MPO活性顯著下降(P<0.05)，益生菌組、中藥聯(lián)合益生菌組小腸組織MPO活性極顯著下降(P<0.01)。

圖5 各組小鼠MPO活性Fig.5 MPO activity of mice in each group

3 討 論

大腸桿菌等多種致病菌株能引起動物腹瀉，導(dǎo)致腹瀉率和腹瀉指數(shù)增高[19]。腹瀉率和腹瀉指數(shù)可直接表明感染分離菌后的腹瀉程度，體重、飲食量、臨床癥狀在一定程度上可以反應(yīng)機(jī)體的發(fā)育狀況及病理變化。谷巍等[20]研究表明，嗜酸乳桿菌中藥復(fù)方發(fā)酵液對小鼠大腸桿菌腹瀉有治療效果，小鼠腹瀉率和腹瀉指數(shù)均低于模型組。Ma等[21]研究表明，麒麟菜解聚硫酸多糖可降低腹瀉小鼠的腹瀉率和腹瀉指數(shù)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥聯(lián)合益生菌可明顯降低小鼠腹瀉率和腹瀉指數(shù)、提高腹瀉小鼠的體重及飲食量，說明中藥聯(lián)合益生菌可減輕和改善大腸桿菌性小鼠腹瀉情況。

臟器系數(shù)是動物試驗(yàn)中的常用指標(biāo)，當(dāng)臟器病理性萎縮或水腫時(shí)，臟器系數(shù)大小發(fā)生改變從而反映出器官功能的強(qiáng)弱。有研究表明，四君子湯[22]和白頭翁復(fù)方[23]對大腸桿菌性腹瀉小鼠預(yù)防效果顯著，模型組小鼠肝臟、脾臟腫大明顯減輕。血液學(xué)指標(biāo)也是鑒別和診斷細(xì)菌性腹瀉的重要參考指標(biāo)，研究表明，大腸桿菌可以減少白細(xì)胞數(shù)量，造成免疫力下降，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，致病性大腸桿菌可誘導(dǎo)小鼠肝臟和脾臟腫大，而中藥聯(lián)合益生菌可逆轉(zhuǎn)大腸桿菌引起的小鼠臟器系數(shù)的改變，同時(shí)也明顯恢復(fù)了模型組小鼠血液學(xué)指標(biāo)的異常變化。糞便隱血是消化道異常的早期預(yù)警，對肉眼不能辨別的消化道少量或慢性出血應(yīng)進(jìn)行糞便隱血檢測，已成為腸道疾病的早期診斷指標(biāo)[25]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，中藥聯(lián)合益生菌使大腸桿菌性腹瀉小鼠糞便隱血由強(qiáng)陽性轉(zhuǎn)陰性且腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)量減少。說明中藥聯(lián)合益生菌可改善小鼠腹瀉及腸道出血癥狀。

MPO是氧化應(yīng)激的重要產(chǎn)物，可反映脂質(zhì)過氧化損傷的程度[26]。研究表明，MPO的在動物機(jī)體的外周淋巴細(xì)胞中表達(dá)，在腹瀉類疾病急性期的腸組織和糞便中增加[27]，可作為腸類疾病的生物標(biāo)志物[28]。趙寶凱等[29]在金香顆粒預(yù)防小鼠大腸桿菌性腹瀉試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，給藥組小鼠小腸組織中MPO活性顯著降低。張亞輝[30]用鸛榆止瀉散治療大腸桿菌性腹瀉小鼠，給藥組MPO活性明顯低于模型組。Xu等[31]用黃柏提取物治療大腸桿菌性腹瀉小鼠發(fā)現(xiàn)MPO活性降低。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，各試驗(yàn)組大腸桿菌性腹瀉小鼠小腸組織及血清中的MPO活性均低于模型組且血液學(xué)指標(biāo)恢復(fù)，其中中藥聯(lián)合益生菌組效果最好，表明中藥聯(lián)合益生菌通過降低MPO活性對大腸桿菌性小鼠腹瀉產(chǎn)生協(xié)同保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

中藥聯(lián)合益生菌明顯減輕致病性大腸桿菌腹瀉小鼠臨床癥狀，降低腹瀉指數(shù)，提高體重、飲食量，降低肝臟、脾臟器官指數(shù)，改善血液學(xué)指標(biāo)，使糞便隱血轉(zhuǎn)陰并降低腸內(nèi)大腸桿菌數(shù)、血清及小腸組織中MPO活性，從而對大腸桿菌性小鼠腹瀉產(chǎn)生協(xié)同保護(hù)作用。