基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)研究黃芪調(diào)控仔豬腸道菌群失調(diào)性腹瀉的作用

孫悅龍，張夢潔，豆佳紅,2，王小瑩，戴小楓，李秀梅

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京 100081；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

仔豬腹瀉是仔豬生長過程中普遍存在、危害嚴重的一類疾病，輕則減緩仔豬生長發(fā)育，重則導(dǎo)致仔豬脫水死亡[1]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。仔豬消化器官不發(fā)達，消化酶含量處于較低水平，腸道免疫系統(tǒng)尚未成熟，極易受到病原菌的侵擾和外界環(huán)境的影響[2]。已有研究表明，腸道微生物被認為是宿主的“第二基因組”，當(dāng)仔豬腸道菌群的類型、數(shù)量、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化，菌群的相關(guān)代謝活動發(fā)生相應(yīng)變化，腸道菌群失調(diào)，仔豬易發(fā)生腹瀉[3]。目前，對于仔豬腹瀉的治療方式仍以抗生素為主，抗生素的長期使用，易產(chǎn)生超級耐藥菌和污染環(huán)境，尋求新的藥物治療方式顯得尤為重要。中草藥作為一種綠色、多靶點的藥物，已成為研究熱點。

黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge.)用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛、便血崩漏、表虛自汗、氣虛水腫、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、久潰不斂等癥，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。尹佳婷等[5]采用小鼠自然衰老模型，驗證了黃芪能增加小鼠腸道微生物多樣性，恢復(fù)腸道穩(wěn)態(tài)。張陽等[6]在生長育肥豬基礎(chǔ)飼糧中添加0.1%黃芪多糖顯著降低了豬糞便微生物的多樣性。但鮮有研究報道黃芪對仔豬腸道菌群失調(diào)性腹瀉的調(diào)節(jié)作用，因此，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)研究了黃芪用于調(diào)控仔豬腸道菌群失調(diào)性腹瀉的有效活性成分及其潛在作用機制，以期為黃芪的應(yīng)用及進一步試驗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃芪主要活性成分及作用靶點的搜集

利用中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP[7](https:∥old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)搜集黃芪的活性成分，設(shè)置口服吸收利用度(oral bioavailablity，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[8]進行篩選，并通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進一步搜集相關(guān)活性成分的靶點，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(https:∥www.uniprot.org/)中進行標(biāo)準(zhǔn)化。利用Cytoscape_3.8.0軟件構(gòu)建黃芪活性成分-潛在作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 腸道菌群失調(diào)性腹瀉相關(guān)靶點及交集靶點的獲取

以“flora imbalance diarrhea”為關(guān)鍵詞，于GeneCards(https:∥www.genecards.org/)和OMIM(https:∥omim.org/)數(shù)據(jù)庫中進行腸道菌群失調(diào)性腹瀉疾病靶點搜集并去重后，在Uniprot數(shù)據(jù)庫中獲取靶點簡稱，設(shè)置物種為Susscrofa進行標(biāo)準(zhǔn)化，建立疾病靶點數(shù)據(jù)集。利用Venny_2.1.0軟件(https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對黃芪活性成分與腸道菌群失調(diào)性腹瀉疾病靶點取交集得到交集靶點，并制作Venn圖。

1.3 黃芪-活性成分-作用靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.1中獲得的黃芪活性成分與1.2中獲得的交集靶點導(dǎo)入Cytoscape_3.8.0軟件，構(gòu)建黃芪-活性成分-作用靶點-腸道菌群失調(diào)性腹瀉網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 黃芪與腸道菌群失調(diào)性腹瀉蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓撲分析

將1.2中獲取的交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https:∥cn.string-db.org/)，設(shè)置物種為Susscrofa，獲得蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，分析交集網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的屬性值，并導(dǎo)出文件，利用Cytoscape_3.8.0軟件進行拓撲分析。

1.5 GO功能與KEGG通路富集分析

將1.2中獲得的交集靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https:∥david.ncifcrf.gov/summary.jsp)，設(shè)置物種為Susscrofa，進行GO功能和KEGG通路富集分析，獲得黃芪調(diào)控仔豬菌群失調(diào)性腹瀉的潛在通路。

1.6 分子對接驗證

選取PPI網(wǎng)絡(luò)中前10個關(guān)鍵靶點和對應(yīng)的黃芪活性成分進行分子對接。利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載黃芪活性成分化合物2D文件，導(dǎo)入Chem3D_20.0.0.41中以最小能量進行3D轉(zhuǎn)換并保存為mol2格式文件，經(jīng)AutoDuckTools_1.5.7轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件。利用PDB數(shù)據(jù)庫(https:∥www.rcsb.org/)下載關(guān)鍵靶點的三維晶體結(jié)構(gòu)，經(jīng)Pymol軟件去除水分子和配體，導(dǎo)入至AutoDuckTools_1.5.7進行加氫、分配電荷、添加原子類型后保存為pdbqt格式文件。將上述兩部分經(jīng)AutoDuck_4.2.6進行分子對接，對接結(jié)果經(jīng)Pymol_2.4.0可視化。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪主要活性成分及作用靶點

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫共獲得87個活性成分，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，篩選出20個活性成分。將活性成分作用靶點經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫中已認證的豬基因進行標(biāo)準(zhǔn)化，得到11個活性成分(表1)，對應(yīng)119個作用靶點，去重后得到65個潛在靶點。

表1 黃芪主要活性成分

將黃芪11個主要活性成分及作用靶點導(dǎo)入Cytoscape_3.8.0軟件進行映射，構(gòu)建黃芪主要活性成分-藥物靶點網(wǎng)絡(luò)可視化；得到77個節(jié)點(節(jié)點表示黃芪活性成分和藥物靶點)和130條邊(邊表示黃芪活性成分和靶點之間的相互作用)(圖1)。

正方形代表中藥；六邊形代表黃芪的有效成分；菱形代表黃芪作用靶點Square represents traditional Chinese medicine；Hexagon represents effective components of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.；Diamond represents targets of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.圖1 黃芪主要活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Active ingredients-target network of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.

2.2 菌群失調(diào)性腹瀉相關(guān)靶點及交集靶點

經(jīng)GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索，分別得到菌群失調(diào)性腹瀉靶點258、873個，去除重復(fù)項后共計854個靶點，將其與2.1得到的藥物靶點經(jīng)Venny_2.1.0軟件取交集得到靶點25個(圖2)，分別為半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、C-C基序趨化因子2(CCL2)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、重組白細胞介素-8(CXCL8)、雌激素受體(ESR1)、雌激素β受體(ESR2)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、熱休克蛋白β-1(HSPB1)、γ干擾素(IFNG)、白細胞介素-10(IL10)、IL1A、IL1B、IL2、IL4、IL6、干擾素調(diào)控因子1(IRF1)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、Myc原癌基因蛋白(MYC)、NF-κB抑制劑α(NFKBIA)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)、Mu型阿片受體(OPRM1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、抗白細胞蛋白酶(SLPI)、腫瘤壞死因子(TNF)、細胞腫瘤抗原p53(TP53)。

圖2 黃芪與菌群失調(diào)性腹瀉交集靶點Venn圖Fig.2 Venn diagram of intersection targets of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.and flora imbalance diarrhea

2.3 黃芪-活性成分-作用靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

整合黃芪、活性成分、菌群失調(diào)性腹瀉靶點，導(dǎo)入Cytoscape_3.8.0軟件構(gòu)建黃芪-活性成分-作用靶點-菌群失調(diào)性腹瀉網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖3。

圓形代表疾??；正方形代表中藥；六邊形代表中藥的有效成分；菱形代表黃芪作用靶點Circle represents disease；Square represents traditional Chinese medicine；Hexagon represents active ingredient of traditional Chinese medicine；Diamond represents target of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.圖3 黃芪-活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network model of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.-chemical components-target-disease

由圖3可知，試驗得到36個節(jié)點和105條邊，25個交集靶點對應(yīng)黃芪9個活性成分，分別為槲皮素(MOL000098)、華良姜素(MOL000239)、異鼠李素(MOL000354)、美迪紫檀素(MOL000371)、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇(MOL000378)、(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基-6a,11a-二氫-6H-苯并吡喃[3,2-c]-3-醇(MOL000380)、芒柄花素(MOL000392)、毛蕊異黃酮(MOL000417)、山奈酚(MOL000422)。不同活性成分平均作用6.3個靶點，其中，槲皮素作用于20個靶點，山奈酚作用于8個靶點，芒柄花素作用于7個靶點；不同疾病靶點平均對應(yīng)3.84個活性成分，體現(xiàn)了中草藥多成分與多靶點共同作用的整體性。

2.4 黃芪與菌群失調(diào)性腹瀉PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將獲取的25個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為Susscrofa，選擇置信度≥0.04，去除游離蛋白，獲得23個靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。由圖4可知，共有23個蛋白節(jié)點和680條邊，平均節(jié)點度為29.6。各靶點間具有良好的蛋白交互作用，其中JUN和TNF靶點度值最高，為42，其次是IL6和CASP3，度值為40。

圖4 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network of the common targets

根據(jù)節(jié)點度值繪制所有靶點蛋白的柱形圖。由圖5可知，黃芪與菌群失調(diào)性腹瀉靶點中的JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2和PPARG等有較大互作頻率，說明黃芪可能通過以上靶點調(diào)控仔豬腸道菌群失調(diào)性腹瀉，這些靶點在黃芪調(diào)控仔豬腸道菌群失調(diào)性腹瀉的作用機制中可能發(fā)揮重要作用。

圖5 交集靶點度值Fig.5 Degree of the common targets

將蛋白互作分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape_3.8.0軟件繪制交互網(wǎng)絡(luò)圖，進行拓撲分析。由圖6可知，JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2和PPARG間具有較好的PPI，其中IL1B和IL1A的互作評分為0.991，TNF和JUN的互作評分為0.985，IL6和JUN的互作評分為0.978。表明黃芪可能通過TNF、JUN、IL1B、IL6等靶點調(diào)控仔豬腸道菌群失調(diào)性腹瀉。

圖6 交集靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Network model of common targets

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

為進一步探討黃芪治療菌群失調(diào)性腹瀉的作用機制，將交集靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，得到GO功能富集條目94條，其中生物過程(biological process，BP)74條，細胞組分(cellular component，CC)6條，分子功能(molecular function,MF)14條；KEGG通路61條。

選取排名前10的GO功能富集條目繪圖，結(jié)果見圖7。由圖7可知，生物過程主要包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡ promoter)、免疫反應(yīng)(immune response)、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控(positive regulation of sequence-specific DNA binding transcription factor activity)、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控，DNA模板(positive regulation of transcription,DNA-templated)等；細胞組分包括胞外間隙(extracellular space)、細胞核(nucleus)、核染色質(zhì)(nuclear chromatin)、質(zhì)膜外側(cè)面(external side of plasma membrane)等；分子功能主要包括細胞因子活性(cytokine activity)、轉(zhuǎn)錄因子活性,序列特異性DNA結(jié)合(transcription factor activity,sequence-specific DNA binding)、DNA結(jié)合(DNA binding)、相同蛋白結(jié)合(identical protein binding)等。

圖7 GO功能富集分析柱形圖Fig.7 Column chart of GO function enrichment analysis

選取排名前20的KEGG富集通路繪圖，結(jié)果見圖8。由圖8可知，黃芪調(diào)控菌群失調(diào)性腹瀉的靶點主要涉及以下KEGG通路：美國錐蟲病(American trypanosomiasis)、百日咳(pertussis)、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、利什曼病(leishmaniasis)等。

圖8 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接

由圖3可知，黃芪調(diào)控仔豬菌群失調(diào)性腹瀉的主要活性成分為槲皮素、山奈酚和芒柄花素。由圖4可知，槲皮素、山奈酚、芒柄花素作用的靶點主要為TNF、JUN、CASP3、IL6、NFKBIA、IL1B、IL10、TP53、PPARG和CCL2?；诖?，將上述靶點分別與其相對應(yīng)的黃芪活性成分進行分子對接，并計算最低結(jié)合能，結(jié)果見表2。結(jié)合能<0表示2個分子能自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越小，分子結(jié)合能力越強，構(gòu)象越穩(wěn)定。由表2可知，上述10個靶點與黃芪活性成分表現(xiàn)出不同的結(jié)合能力，其中，結(jié)合能最低的是芒柄花素與PPARG靶點的結(jié)合，結(jié)合能為-6.19 kJ/moL，其次是槲皮素與IL1B靶點的結(jié)合，結(jié)合能為-5.37 kJ/moL，槲皮素與TNF靶點的結(jié)合能為-5.10 kJ/moL，山奈酚和TNF靶點的結(jié)合能為-5.30 kJ/moL。

表2 黃芪主要活性成分與蛋白最低結(jié)合能

由圖9可知，芒柄花素結(jié)合到PPARG，與異亮氨酸(Ile)-281殘基形成氫鍵相互作用，鍵長2.2；槲皮素結(jié)合到IL1B，與天冬酰胺(Asn)-99、色氨酸(Trp)-98、天冬氨酸(Asp)-63殘基形成氫鍵相互作用，平均鍵長2.16；槲皮素結(jié)合到TNF，與甘氨酸(Gly)-142、亮氨酸(Leu)-145、蘇氨酸(Thr)-138殘基形成氫鍵相互作用，平均鍵長2.3；山奈酚結(jié)合到TNF，與半胱氨酸(Cys)-150、苯丙氨酸(Phe)-143、甘氨酸(Gly)-142、蘇氨酸(Thr)-138、亮氨酸(Leu)-145和半胱氨酸(Cys)-139殘基形成氫鍵相互作用，平均鍵長2.4。

A,疾病靶點；B,氫鍵；C,黃芪主要活性成分A，Disease target；B,Hydrogen bond；C,Main active ingredients圖9 關(guān)鍵靶點與活性成分的分子對接Fig.9 Molecular docking of important targets and active ingredients

3 討 論

研究表明，腸道菌群在保護宿主健康中發(fā)揮著重要作用。仔豬在受到外界環(huán)境、抗生素藥物等影響下，腸道菌群失調(diào)，正常菌群豐度減少，條件致病菌等病原微生物豐度得到提高，誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)[9]。腹瀉是腸道菌群失調(diào)的臨床表現(xiàn)之一，一旦仔豬發(fā)生腹瀉，若沒有得到及時救治，極易導(dǎo)致大量仔豬脫水死亡[10]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了“黃芪-活性成分-潛在靶點”和“黃芪-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，最終篩選到9個主要活性成分，主要為槲皮素、華良姜素、異鼠李素、美迪紫檀素、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、芒柄花素、毛蕊異黃酮和山奈酚等，對應(yīng)25個交集靶點。

PPI結(jié)果顯示，黃芪與菌群失調(diào)性腹瀉靶點中的JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2、PPARG等有較大互作頻率。前10個靶點所對應(yīng)的黃芪活性成分主要為槲皮素、山奈酚、芒柄花素。槲皮素是一種天然的黃酮類物質(zhì)，存在于各種植物的花、葉、果實等之中，具有良好的抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)腸道微生物多樣性等生物活性，且具有較高的食用安全性[11]。研究表明，槲皮素能提高腸道中擬桿菌門的豐度，降低變形桿菌的豐度，具有良好的調(diào)節(jié)機體菌群平衡的能力[12]。陳櫻萌等[13]通過光電比濁法觀測槲皮素對小鼠腸道菌群失調(diào)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示，槲皮素對腸球菌表現(xiàn)為強烈抑制作用，對乳桿菌表現(xiàn)為一定程度的促生長作用。山奈酚是一種天然的黃酮醇類物質(zhì)，存在于水果、蔬菜及藥食同源植物中，具有保護神經(jīng)、抗腦血管疾病、防治代謝型疾病、緩解腸道炎癥等作用[14-15]。曲一帆[16]研究表明，山奈酚能增加結(jié)腸長度，調(diào)節(jié)結(jié)腸中炎性轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)緊密連接蛋白表達，并進一步通過提高厚壁菌門與擬桿菌門的比例，降低變形桿菌等致病菌相對豐度，增加腸道菌群多樣性和豐富度。芒柄花素是廣泛存在于紅三葉草、黃芪等中的黃酮類物質(zhì)，具有較強的抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用[17]。盡管芒柄花素被證實能有效抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移擴散[18]和改善腸道屏障[19]，但沒有直接證據(jù)表明芒柄花素能夠調(diào)整腸道微生物多樣性。

在黃芪調(diào)控菌群失調(diào)性腹瀉關(guān)鍵靶點中，JUN是DNA結(jié)合蛋白，是轉(zhuǎn)錄因子AP-1的組成部分，轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性收到絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的調(diào)控。當(dāng)機體腸道受到病原微生物侵染后，腸道上皮細胞MAPK通路被激活，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AP-1的DNA結(jié)合活性，進而產(chǎn)生IL-8[20]。TNF、IL6、IL1B、IL10等與炎癥有關(guān)，可能是黃芪免疫調(diào)節(jié)的核心靶點[21]，當(dāng)機體受到病原微生物侵染發(fā)生炎癥反應(yīng)時，其水平升高并激活相關(guān)信號通路，調(diào)節(jié)巨噬細胞等非特異性免疫，還可進一步激活特異性免疫釋放炎癥因子[22]。CASP3在細胞凋亡中起到重要作用，研究表明，細胞凋亡過程實際為Caspase被激活進而發(fā)生凋亡蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)，當(dāng)宿主發(fā)生氧化應(yīng)激后，凋亡誘導(dǎo)因子自線粒體釋放至胞漿中，激活CASP3，誘導(dǎo)細胞凋亡[23-24]。NFKBIA通過屏蔽NF-κB蛋白的核定位信號將其隔離在細胞質(zhì)中抑制NF-κB信號通路，NF-κB信號通路的激活可調(diào)節(jié)一系列與炎癥和免疫相關(guān)的基因表達[25]。TP53是蛋白質(zhì)和基因組的保護者，在防止基因組突變中起著保持穩(wěn)定的作用，此外，TP53在控制氧化應(yīng)激、DNA損傷、調(diào)控核糖體功能障礙和缺氧等方面發(fā)揮免疫作用[26]。CCL2又稱單核細胞趨化蛋白-1(MAP-1)，是首個發(fā)現(xiàn)的人類CC趨化因子家族成員，研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)趨化因子都能作為促炎因子參與感染、炎癥等機體生理和病理過程，目前，趨化因子已被確定為多種疾病的潛在治療靶點[27]。PPARG參與多種代謝途徑，通過控制脂肪酸的過氧化物酶體β-氧化途徑，調(diào)節(jié)脂肪細胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，還可介導(dǎo)腸道脂質(zhì)代謝，影響腸道中脂質(zhì)生成、脂質(zhì)吸收和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運[28]。

GO功能富集分析顯示，黃芪治療菌群失調(diào)性腹瀉的過程主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫反應(yīng)、細胞對脂多糖的反應(yīng)等。KEGG通路富集結(jié)果表明，黃芪治療仔豬菌群失調(diào)性腹瀉主要與美國錐蟲病、炎癥性腸病、阿米巴病、細胞因子-細胞因子受體相互作用、A型流感、瘧疾、T細胞受體信號通路、沙門菌感染等信號通路密切相關(guān)。通過對KEGG代謝通路的富集分析發(fā)現(xiàn)，造成仔豬腹瀉的可能原因主要為病原微生物入侵后誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，在多個信號通路中存在交集靶點，如黃芪可通過調(diào)控IL10、NFKBIA、JUN、IL6、CCL2、TNF等靶點對美國錐蟲病發(fā)揮作用，還可通過調(diào)控IL10、JUN、IL6、TNF等靶點對炎癥性腸病發(fā)揮作用等，進一步說明了黃芪在仔豬菌群失調(diào)性腹瀉方面并非通過一個靶點進行治療的，而是通過多靶點進行疾病治療[29]。

黃芪主要活性成分與靶點分子對接結(jié)果顯示，槲皮素與TNF、IL1B具有良好的結(jié)合活性，山奈酚與TNF具有良好的結(jié)合活性，芒柄花素與PPARG具有良好的結(jié)合活性。研究表明，腸道中革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的脂多糖作為炎癥觸發(fā)因子激活 NF-κB 信號通路，促進炎性因子 TNF-α、IL6、IL1B的合成和釋放，從而導(dǎo)致腸道組織產(chǎn)生炎癥[30]；槲皮素、山奈酚可通過調(diào)節(jié)腸道菌群和增強腸道屏障功能，減少脂多糖的產(chǎn)生，減少腸道炎癥反應(yīng)[31]；此外，槲皮素能通過降低TNF-α、IL6和IL1B的表達水平，進而抑制腸道炎癥反應(yīng)[32]。這與GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果相一致，即黃芪通過調(diào)節(jié)細胞對脂多糖的反應(yīng)或增強腸道屏障，減少病原微生物入侵治療仔豬菌群失調(diào)性腹瀉。已有研究證明，芒柄花素參與多種炎癥反應(yīng)，可降低炎性因子的表達水平[33]，本研究中芒柄花素與PPARG具有較好的結(jié)合能力，這還有待于進一步分析。同時，本研究再次證明了中草藥在治療疾病時是由多個活性組分發(fā)揮作用的。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，黃芪調(diào)控仔豬菌群失調(diào)性腹瀉的主要活性成分可能為槲皮素、華良姜素、異鼠李素、芒柄花素、毛蕊異黃酮、山奈酚等，涉及的核心靶點主要有JUN、TNF、IL6、CASP3、IL1B、NFKBIA、TP53、IL10、CCL2、PPARG，黃芪調(diào)控仔豬菌群失調(diào)性腹瀉的可能通路主要為美國錐蟲病、炎癥性腸病、阿米巴病、細胞因子-細胞因子受體相互作用、A型流感、瘧疾、T細胞受體信號通路、沙門菌感染等，為黃芪后期的研究和開發(fā)提供了參考依據(jù)。