梅花鹿成纖維細(xì)胞因子受體2基因多態(tài)性及其與茸重性狀的關(guān)聯(lián)分析

周 雅，張禾垟，劉琳玲，李浩東，鄭軍軍，王桂武

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112)

鹿茸具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力和改善性功能等多種藥理作用，是重要的動(dòng)物藥材之一[1]。梅花鹿是中國(guó)茸鹿養(yǎng)殖的主體，其產(chǎn)茸量是直接關(guān)系到養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)收益的重要經(jīng)濟(jì)性狀，因此該性狀在育種中備受關(guān)注。研究表明，鹿茸的再生是包括軟骨、皮膚、血管和神經(jīng)等組織的完全再生，因而茸重性狀受多基因控制，依靠傳統(tǒng)的育種方法，存在周期長(zhǎng)、效率低等問(wèn)題[2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，梅花鹿育種進(jìn)入分子育種是必然的趨勢(shì)，相關(guān)分子標(biāo)記的研究對(duì)推動(dòng)其分子育種進(jìn)程、提高動(dòng)物產(chǎn)品產(chǎn)量等具有重要意義。

成纖維細(xì)胞因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體家族(fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)的一員，由3個(gè)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、1個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成[3]。其中第二和第三免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是配體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)和肝素的主要結(jié)合位點(diǎn)[4-5]。而第3個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的mRNA存在2個(gè)可變剪切體，形成FGFR2b和FGFR2c 2個(gè)亞型[6]。在上皮細(xì)胞中編碼FGFR2b亞型，主要與FGF7、FGF10結(jié)合，而在間質(zhì)細(xì)胞中編碼FGFR2c亞型，主要與FGF2、FGF4、FGF6、FGF8、FGF9等親和力較高[6-7]。FGFR2與相關(guān)的FGF結(jié)合可激活多個(gè)信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等的增殖和分化，在皮膚和骨等多個(gè)組織發(fā)育中起重要作用，其中1個(gè)配體FGF2已被證明與梅花鹿鹿茸快速生長(zhǎng)密切相關(guān)[8-9]。此外，F(xiàn)GFR2還可能通過(guò)與FGF21的受配體作用，產(chǎn)生相關(guān)信號(hào)分子，誘導(dǎo)毛囊由生長(zhǎng)期和退化期進(jìn)入靜止期，而FGFR2b缺失會(huì)導(dǎo)致毛囊形成遲鈍并減少[10-11]。FGFR2的多種功能與鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程相關(guān)，故推測(cè)該基因可能是促進(jìn)鹿茸生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因。Hu等[12]通過(guò)梅花鹿產(chǎn)茸量相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)篩選到該基因，推測(cè)為茸重性狀候選基因，但尚未進(jìn)一步證明。

本研究以梅花鹿為研究對(duì)象，通過(guò)PCR直接測(cè)序檢測(cè)FGFR2基因外顯子上的突變，并使用飛行質(zhì)譜法分析基因型，與茸重性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在篩選梅花鹿茸重性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為梅花鹿分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在吉林省長(zhǎng)春市某鹿場(chǎng)選取314頭24月齡飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致的梅花鹿作為研究對(duì)象。對(duì)314頭梅花鹿進(jìn)行頸靜脈采血，經(jīng)EDTA抗凝處理，準(zhǔn)確記錄編號(hào)后暫存至冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分裝，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用電子秤稱量生長(zhǎng)45 d左右的二杠茸重量，精確到1 g。所有樣本茸重經(jīng)平均值±3倍標(biāo)準(zhǔn)差(μ±3σ)剔除異常值，近似符合正態(tài)分布。

1.2 主要試劑

血液DNA提取試劑盒和2×TransStart?FastPfu PCR SuperMix (-dye)均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×EsTaqMasterMix(Dye)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA Marker、6×Loading Buffer和10×Loading Buffer均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 DNA提取與PCR擴(kuò)增

按照血液DNA提取試劑盒操作步驟提取血液樣品DNA。用NanoDrop 2000檢測(cè)所提取DNA 的純度和濃度，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，將質(zhì)量合格的DNA樣品保存?zhèn)溆?。根?jù)梅花鹿基因組中FGFR2基因序列[13]，使用NCBI中的Primer-BLAST設(shè)計(jì)FGFR2基因第1～17外顯子擴(kuò)增引物，擴(kuò)增產(chǎn)物包含全部外顯子和部分內(nèi)含子序列，引物序列見(jiàn)表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×EsTaqMasterMix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)充至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(各引物退火溫度見(jiàn)表1)30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN和Chromas 2軟件進(jìn)行比對(duì)，篩選SNPs位點(diǎn)。

表1 梅花鹿FGFR2基因各外顯子的引物信息

1.4 基因分型

FGFR2基因候選位點(diǎn)利用MassARRAY?技術(shù)進(jìn)行分型，該步驟交由北京閱微基因技術(shù)股份有限公司完成，相關(guān)分型引物信息如表2所示，具體操作步驟如下：①將質(zhì)檢合格的DNA樣本放入384孔板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系5 μL/孔：PCR Buffer(含15 mmol/L MgCl2) 0.625 μL，MgCl2(25 mmol/L) 0.325 μL，dNTP Mix(4種dNTP 各自濃度為25 mmol/L) 0.1 μL，擴(kuò)增引物Mix(上、下游引物各自濃度為500 nmol/L) 1 μL，HotStarTaq(5 U/μL) 0.1 μL，DNA模板(10 ng/μL) 1 μL，ddH2O 1.850 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min；4 ℃保存。②PCR產(chǎn)物進(jìn)行SAP純化反應(yīng)，反應(yīng)體系2 μL/孔：SAP Buffer(10×) 0.17 μL，SAP Enzyme(1 U/μL) 0.3 μL，ddH2O 1.53 μL。PCR反應(yīng)程序：37 ℃溫育40 min，85 ℃熱失活5 min，4 ℃保存。③單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系2 μL/孔：iPLEX buffer plus 0.2 μL，iPLEX terminator 0.2 μL，擴(kuò)增引物Mix 0.940 μL，iPlex Enzyme 0.041 μL，ddH2O 0.619 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸180 s，4 ℃保存。④樹(shù)脂純化：將反應(yīng)產(chǎn)物(共9 μL)稀釋3倍，使用樹(shù)脂進(jìn)行脫鹽，脫鹽處理后的樣品點(diǎn)在樣品靶上，自然結(jié)晶。⑤上機(jī)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，并收集數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019計(jì)算梅花鹿FGFR2基因的基因型頻率、基因頻率及相關(guān)遺傳多樣性參數(shù)：觀測(cè)雜合度(heterozygosity observed，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)和多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)，并進(jìn)行χ2適合性檢驗(yàn)，檢測(cè)是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。利用Haploview 4.2軟件進(jìn)行單倍型分析。利用SPSS 25.0軟件中一般線性模型(general linear model，GLM)單因素方差分析對(duì)梅花鹿群體中各位點(diǎn)基因型以及單倍型與茸重性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，存在群體數(shù)量低于5%的基因型的位點(diǎn)采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，使用最小顯著差異法(least significant difference,LSD)進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。模型：Yij=μ+Gi+eij。其中，Yij為茸重性狀觀察值，μ為群體均值，Gi為基因型固定效應(yīng)，eij為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

表2 SNPs引物信息

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，17對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均呈現(xiàn)清晰、明亮的特異性條帶(圖1)，且與預(yù)期產(chǎn)物大小一致，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

M,DL2000 DNA Marker;1～17分別為FGFR2基因第1～17外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物M,DL2000 DNA Marker;1-17，Amplification products of exons 1 to 17 of FGFR2 gene圖1 梅花鹿FGFR2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of FGFR2 gene in sika deer

2.2 測(cè)序驗(yàn)證

經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，梅花鹿FGFR2基因存在12個(gè)SNPs，其中g(shù).80998742 G>A、g.80987708 G>A、g.80975864 T>G、g.80936928 C>T和g.80928230 C>T位點(diǎn)分別位于外顯子2、外顯子4、外顯子5、外顯子12和外顯子15上；g.80943673 T>C和g.80943683 C>A位點(diǎn)均位于內(nèi)含子8；g.80940697 T>G、g.80938545 G>A、g.80938352 C>T、g.80928299 C>T和g.80928115 A>G分別位于內(nèi)含子9、內(nèi)含子10、內(nèi)含子11、內(nèi)含子14和內(nèi)含子15(部分結(jié)果見(jiàn)圖2，外顯子2為反向測(cè)序其余均為正向測(cè)序)。80998742 G>A、g.80987708 G>A、g.80975864 T>G、g.80936928 C>T和g.80928230 C>T 5個(gè)外顯子上的突變均未引起氨基酸改變，為同義突變。

圖2 梅花鹿FGFR2基因部分SNPs位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of partial SNPs in FGFR2 gene in sika deer

2.3 質(zhì)譜分型

分型結(jié)果顯示，g.80975864 T>G位點(diǎn)未分型成功，其余11個(gè)位點(diǎn)可做后續(xù)分析。其中g(shù).80940697 T>G和g.80936928 C>T僅存在2種基因型，其余位點(diǎn)均存在3種基因型(部分結(jié)果見(jiàn)圖3)。

圖3 梅花鹿FGFR2基因部分SNPs位點(diǎn)分型結(jié)果Fig.3 Typing results of partial SNPs in FGFR2 gene in sika deer

2.4 梅花鹿FGFR2基因多態(tài)性分析

梅花鹿FGFR2基因各位點(diǎn)基因型頻率、基因頻率、相關(guān)遺傳多樣性參數(shù)及χ2檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，各位點(diǎn)Ho和He基本一致，g.80943673 T>C、g.80943683 C>A及g.80938352 C>T位點(diǎn)屬于中度多態(tài)(0.25A和g.80987708 G>A位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)，其余位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表3 梅花鹿FGFR2基因SNPs位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)分析

2.5 FGFR2基因多態(tài)性與梅花鹿茸重性狀的關(guān)聯(lián)分析

FGFR2基因11個(gè)SNPs位點(diǎn)的不同基因型與梅花鹿茸重性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示11個(gè)位點(diǎn)各基因型之間茸重差異均不顯著(P>0.05)。

表4 梅花鹿FGFR2基因SNPs位點(diǎn)各基因型與茸重的關(guān)聯(lián)分析

2.6 FGFR2基因單倍型與梅花鹿茸重性狀的關(guān)聯(lián)分析

對(duì)梅花鹿群體FGFR2基因11個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡和單倍型分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。FGFR2基因g.80987708 G>A位點(diǎn)檢出率較低，在分析中剔除，g.80938545 G>A、g.80940697 T>G、g.80943673 T>C和g.80943683 C>A位點(diǎn)之間處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)(D′>0.96，r2>0.72)。

通過(guò)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，梅花鹿群體中存在5種單倍型，分別為GTCA、GTTA、ATTC、GTTC和GGTC。由表5可知。FGFR2基因各單倍型間茸重差異均不顯著(P>0.05)。

圖4 梅花鹿FGFR2基因SNPs連鎖不平衡分析Fig.4 Linkage disequilibrium analysis of SNPs of FGFR2 gene in sika deer

表5 FGFR2基因單倍型對(duì)梅花鹿茸重的影響

3 討 論

鹿茸具有很高的藥用價(jià)值，價(jià)格昂貴，故茸重性狀也廣受關(guān)注。近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子育種技術(shù)已廣泛應(yīng)用于畜禽育種中，并取得了良好的效果。鹿茸屬于限性性狀，通過(guò)傳統(tǒng)的育種方法具有很大的局限性，利用分子遺傳標(biāo)記對(duì)梅花鹿鹿茸生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，可以有效地克服傳統(tǒng)育種方法的不足，提高梅花鹿鹿茸產(chǎn)量。鹿茸生長(zhǎng)機(jī)制復(fù)雜，其相關(guān)分子標(biāo)記也相當(dāng)匱乏。胡鵬飛等[14]選用飼養(yǎng)條件基本一致的高、低產(chǎn)梅花鹿各50只做重測(cè)序的全基因組關(guān)聯(lián)分析，篩選出與茸重性狀顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn)96個(gè)。Jia等[15]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序挖掘梅花鹿茸重性狀相關(guān)的表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag,EST)微衛(wèi)星，篩選出了8個(gè)EST微衛(wèi)星，特別是M009和M027，可作為二杠茸茸重性狀的分子標(biāo)記。二者分別從基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序挖掘與茸重性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，豐富了篩選高產(chǎn)梅花鹿的遺傳資源。杜志恒等[16]對(duì)生長(zhǎng)激素(growth hormone 1,GH1)基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果表明，其內(nèi)含子2上存在G→A突變，存在3種基因型，各基因型在第五鋸產(chǎn)茸量存在一定差異。Yang等[17]發(fā)現(xiàn)，褪黑激素Ⅰ型受體a亞型(melatonin receptor 1A,MTNR1A)基因外顯子2上存在G629C突變，存在3種基因型，CC基因型產(chǎn)茸估測(cè)值顯著高于GC基因型，GC基因型產(chǎn)茸估測(cè)值顯著高于GG基因型。

FGFR2基因位于梅花鹿第9號(hào)染色體，共17個(gè)外顯子，編碼區(qū)長(zhǎng)2 460 bp，編碼819個(gè)氨基酸。既往研究發(fā)現(xiàn)FGFR2在骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的募集和增殖，通過(guò)正向調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，在骨損傷后修復(fù)中研究廣泛[18]。FGFR2還可調(diào)節(jié)癌癥干細(xì)胞的增殖和凋亡，在乳腺癌[19-20]、胃癌[21]、食管鱗癌[22]和膽管癌[23]等多種癌癥的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究采用直接測(cè)序法檢測(cè)FGFR2基因17個(gè)外顯子及部分內(nèi)含子的多態(tài)性，共發(fā)現(xiàn)12個(gè)SNPs位點(diǎn)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，g.80943673 T>C、g.80943683 C>A及g.80938352 C>T位點(diǎn)雜合度較高，多態(tài)信息含量為0.3597、0.3307及0.3655，為中度多態(tài)位點(diǎn)，這3個(gè)位點(diǎn)的群體遺傳變異程度較大，遺傳多樣性比較豐富，具有一定的選擇潛力，而其余8個(gè)位點(diǎn)雜合度較低，為低度多態(tài)位點(diǎn)，選擇潛力較小。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，g.80998742 G>A和g.80987708 G>A位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，其他位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。連鎖不平衡和單倍型分析結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR2基因4個(gè)位點(diǎn)處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)，產(chǎn)生5種單倍型。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，11個(gè)位點(diǎn)各基因型及5種單倍型之間茸重差異均不顯著。

4 結(jié) 論

本研究梅花鹿群體中FGFR2基因存在12個(gè)SNPs，其中5個(gè)為同義突變，有1個(gè)同義突變位點(diǎn)(g.80975864 T>G)未分型成功。該基因有4個(gè)SNPs處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)，產(chǎn)生5種單倍型。FGFR2基因各位點(diǎn)基因型及單倍型間茸重差異均不顯著，說(shuō)明這11個(gè)SNPs均不適用于梅花鹿茸重性狀的選育。