大黃酚激活SIRT1/PGC-1α抑制心臟成纖維細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化*

唐 碧， 高 琦， 周 彤， 唐銘銘， 宣 玲，劉進(jìn)軍， 康品方， 吳士禮， 張 恒

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管科，蚌埠 233004

房顫(atrial fibrillation，AF)是臨床上常見的一類持續(xù)性心律失常疾病，常常合并高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病[1-2]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓、慢性炎癥等應(yīng)激刺激下，心臟成纖維細(xì)胞經(jīng)過活化、遷移和過度增殖，纖維化表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和纖維化的發(fā)生，并最終影響心臟舒張功能[3]。因此，研究心臟成纖維細(xì)胞增殖和纖維化的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療藥物和干預(yù)策略，對防治房顫發(fā)病，改善患者生存條件具有重要意義。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang Ⅱ)可以促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞增殖、侵襲和遷移及纖維化表型轉(zhuǎn)化[4]，因而成為研究心房纖維化的重要細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

大黃酚(chrysophanol，CP)，化學(xué)名為1，8-二羥基-3-甲基蒽醌(1，8-dihydroxy-3-methylanthraquinone)，最早是從蓼科植物大黃(Rheumrhabarbarum)分離出的活性成分[5]。近年來，大黃酚被發(fā)現(xiàn)具有抗炎、保護(hù)心血管的藥理作用[6-7]，此外還有研究報(bào)道大黃酚具有抗腎臟纖維化的功能[8]。然而，大黃酚是否影響心臟成纖維細(xì)胞增殖、侵襲和遷移及向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化還不清楚。本研究利用Ang Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心臟成纖維細(xì)胞模型，探究大黃酚對心房纖維化的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

大黃酚(CAS：481-74-3)、選擇性SIRT1抑制劑EX527(CAS：49843-98-3)購自上海阿拉丁生化科技公司；IMDM培養(yǎng)液、胎牛血清、Trizol裂解液購自美國賽默飛世爾科技公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；Ang Ⅱ購自美國MCE科技公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、SYBR Green qPCR Super Mix購自北京天根生化科技公司；RIPA細(xì)胞裂解液、結(jié)晶紫染液、ECL化學(xué)發(fā)光底物購自上海碧云天生物科技公司；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室購自美國BD公司；PVDF膜購自美國密理博科技公司；兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(fibronectin)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國CST公司；HRP山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

原代小鼠心臟成纖維細(xì)胞(mouse cardiac fibroblasts，MCFs)購自美國Sciencell科技公司。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在含10%胎牛血清的IMDM完全培養(yǎng)液中，放置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中，每隔2天換液，待細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%時(shí)用胰酶消化傳代。

1.3 儀器設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋電氣)；超低溫冰箱(青島海爾)；SDS-PAGE凝膠電泳系統(tǒng)(美國伯樂公司)；全波長酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技公司)；凝膠成像儀(上海勤翔科學(xué)儀器公司)；Real-time qPCR儀(美國Applied Biosystems科技公司)；高級正置顯微鏡(美國萊卡公司)。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活性和增殖水平

取對數(shù)生長期的MCFs細(xì)胞，用胰酶消化后收集，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，分別根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入1 μmol/L Ang Ⅱ、1 μmol/L EX527或指定濃度的大黃酚，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出孔板，使用全波長酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光度值。

1.5 免疫熒光染色

經(jīng)超聲清洗后的無菌蓋玻片預(yù)先放置在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞充分貼壁后，棄掉培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液漂洗2次，加入4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，隨后加入0.2% Triton X-100室溫孵育15 min，透化細(xì)胞膜。使用預(yù)冷的2% BSA按1∶400比例稀釋α-SMA抗體，并加入到細(xì)胞中室溫孵育60 min，再加入FITC偶聯(lián)的熒光二抗室溫孵育60 min，最后用終濃度2 μg/mL的DAPI室溫染色5 min，充分漂洗后用封片機(jī)封片，在熒光顯微鏡下拍攝。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

MCFs細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到100%，用移液器吸頭輕輕做一道劃痕，棄掉培養(yǎng)液，并用磷酸鹽緩沖液洗掉剝離細(xì)胞，換液后放在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。于劃痕后0 h、24 h對劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照，用Image J軟件計(jì)算劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

MCFs細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、離心并用IMDM完全培養(yǎng)液重懸，制備成為2×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取200 μL細(xì)胞懸液加入到Transwell上層小室，并將小室置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入600 μL無血清IMDM培養(yǎng)液。細(xì)胞放置在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽擦去上層小室中的細(xì)胞，后用4%多聚甲醛固定，放入結(jié)晶紫染色液中染色15 min。充分漂洗后，取下小室膜，在顯微鏡下拍照，用Image J軟件統(tǒng)計(jì)遷移的細(xì)胞數(shù)。

1.8 Western blot檢測

MCFs細(xì)胞加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解15 min，在4℃，12000 r/min離心10 min，后加入5×SDS上樣緩沖液，100℃沸水加熱10 min。用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品，電壓100 V，恒壓電泳90 min。隨后用轉(zhuǎn)印槽將蛋白樣品轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，冰浴100 V恒壓轉(zhuǎn)印2 h。PVDF膜首先用5%脫脂奶粉室溫封閉30 min，隨后分別與稀釋后的抗MMP-2(1∶1000)、MMP-9(1∶1000)、collagenⅠ(1∶2000)、fibronectin(1∶2000)、CTGF(1∶1000)和GAPDH(1∶3000)抗體室溫孵育1 h，最后用稀釋后的二抗孵育液(1∶5000)室溫孵育45 min，加入ECL發(fā)光底物，用凝膠成像儀獲取蛋白印跡。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大黃酚處理抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞增殖

用不同濃度的大黃酚處理MCFs細(xì)胞24 h后，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量大黃酚(1 μmol/L)和中劑量大黃酚(10、50 μmol/L)對細(xì)胞存活率沒有顯著影響，而高劑量大黃酚(100 μmol/L)處理細(xì)胞存活率為(86.5±3.9)%，與Control組相比下降(P<0.05，圖1A)。這表明高濃度大黃酚具有一定細(xì)胞毒性，會抑制細(xì)胞生長。

聯(lián)合使用1 μmol/L Ang Ⅱ和大黃酚共處理MCFs細(xì)胞，并在處理后的24、48和72 h檢測細(xì)胞增殖活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ可以促進(jìn)細(xì)胞增殖(均P<0.01)。而Ang Ⅱ聯(lián)合大黃酚處理可以抑制細(xì)胞增殖活性(均P<0.01)，且抑制程度隨著大黃酚濃度升高而增加，見圖1B。

1：Control；2：1 μmol/L CP；3：10 μmol/L CP；4：50 μmol/L CP；5：100 μmol/L CP；A：CCK-8檢測大黃酚細(xì)胞毒性；B：CCK-8檢測大黃酚對Ang Ⅱ誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞增殖的影響；與Control組比較，*P<0.05 **P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，##P<0.01;Ang Ⅱ:血管緊張素Ⅱ，CP：大黃酚圖1 大黃酚抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞增殖Fig.1 Chrysophanol inhibits Ang Ⅱ-induced proliferation of MCFs

2.2 大黃酚抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞遷移和侵襲

聯(lián)合使用Ang Ⅱ和大黃酚處理MCFs細(xì)胞24 h后，利用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ組劃痕愈合面積增加(P<0.01)，與Ang Ⅱ組相比，大黃酚聯(lián)合用藥組劃痕愈合面積隨著大黃酚濃度的升高逐漸減小(P<0.05)，見圖2A。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ組侵襲到下層小室細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01)，與Ang Ⅱ組相比，大黃酚聯(lián)合用藥組侵襲細(xì)胞數(shù)隨著大黃酚濃度的升高逐漸減少(P<0.01)，見圖2B。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ang Ⅱ組MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平升高，而隨大黃酚濃度增加，大黃酚聯(lián)合用藥組細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平逐漸降低(圖2C)。

1：Control；2：Ang Ⅱ；3：Ang Ⅱ+1 μmol/L CP；4：Ang Ⅱ+10 μmol/L CP；5：Ang Ⅱ+50 μmol/L CP；A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測MCFs細(xì)胞遷移能力；B：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測MCFs細(xì)胞侵襲能力；C：Western blot檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平；與Control組比較，**P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，#P<0.05 ##P<0.01圖2 大黃酚抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞遷移和侵襲Fig.2 Chrysophanol inhibits Ang Ⅱ-induced MCFs migration and invasion

2.3 大黃酚抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞纖維化因子的分泌

免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ組細(xì)胞內(nèi)源α-SMA染色熒光強(qiáng)度增加，而大黃酚聯(lián)合用藥組細(xì)胞α-SMA熒光強(qiáng)度隨大黃酚濃度升高而下降(圖3A)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ組細(xì)胞collagen Ⅰ、fibronectin和CTGF表達(dá)水平升高(均P<0.05)，而與Ang Ⅱ組相比，大黃酚聯(lián)合用藥組細(xì)胞隨大黃酚濃度增加collagenⅠ、fibronectin和CTGF蛋白表達(dá)水平逐漸下降(均P<0.01)，見圖3B。

1：Control；2：Ang Ⅱ；3：Ang Ⅱ+1 μmol/L CP；4：Ang Ⅱ+10 μmol/L CP；5：Ang Ⅱ+50 μmol/L CP；A:免疫熒光染色檢測α-SMA表達(dá)；B:Western blot檢測纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)；與Control組比較，**P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，##P<0.01圖3 大黃酚抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞纖維化Fig.3 Chrysophanol inhibits Ang Ⅱ-induced fibrosis of cardiac fibroblasts

2.4 大黃酚激活MCFs細(xì)胞SIRT1/PGC-1α信號通路

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組相比，Ang Ⅱ組細(xì)胞SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)水平下降(均P<0.01)，而與Ang Ⅱ組相比，大黃酚聯(lián)合用藥組細(xì)胞隨著大黃酚濃度升高SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)水平逐漸增加(均P<0.01)，50 μmol/L大黃酚處理組細(xì)胞中SIRT1和PGC-1α的表達(dá)水平接近Control組，見圖4。

1：Control；2：Ang Ⅱ；3：Ang Ⅱ+1 μmol/L CP；4：Ang Ⅱ+10 μmol/L CP；5：Ang Ⅱ+50 μmol/L CP；Western blot檢測SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)水平，與Control組比較，**P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，##P<0.01圖4 大黃酚激活MCFs細(xì)胞SIRT1/PGC-1α信號通路Fig.4 Chrysophanol activates SIRT1/PGC-1α signaling pathway in cardiac fibroblasts

后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇50 μmol/L為大黃酚作用濃度。

2.5 大黃酚通過激活SIRT1/PGC-1α信號通路抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組劃痕愈合面積下降，加入EX527后，劃痕愈合面積增加(圖5A)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組侵襲到下層小室的細(xì)胞數(shù)減少，而Ang Ⅱ+CP+EX527組侵襲到下層小室的細(xì)胞數(shù)增加，見圖5B。

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組細(xì)胞增殖活性下降(P<0.01)，而加入SIRT1抑制劑EX527后，細(xì)胞增殖活性升高(P<0.01)，見圖5C。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)水平下降(均P<0.01)，Ang Ⅱ+CP+EX527組細(xì)胞，MMP-2和MMP-9表達(dá)水平回升(均P<0.01)，見圖5D。

1：Control；2：Ang Ⅱ；3：Ang Ⅱ+CP；4：Ang Ⅱ+CP+EX527；A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力；B：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測MCFs細(xì)胞侵襲能力；C：CCK-8檢測細(xì)胞活性；D：Western blot檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平；與Control組比較，**P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，#P<0.05；##P<0.01；與Ang Ⅱ+CP組比較，△△P<0.01圖5 大黃酚通過激活SIRT1/PGC-1α信號通路抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲Fig.5 Chrysophanol inhibits Ang Ⅱ-induced cell proliferation、migration and invasion by activating SIRT1/PGC-1α signaling pathway

2.6 大黃酚通過激活SIRT1/PGC-1α信號通路抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組細(xì)胞α-SMA熒光強(qiáng)度下降，Ang Ⅱ+CP+EX527組細(xì)胞α-SMA熒光強(qiáng)度升高，見圖6A。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+CP組細(xì)胞collagenⅠ、fibronectin和CTGF蛋白表達(dá)水平下降，Ang Ⅱ+CP+EX527組細(xì)胞，collagenⅠ、fibronectin和CTGF蛋白回升，見圖6B。

1：Control；2：Ang Ⅱ；3：Ang Ⅱ+CP；4：Ang Ⅱ+CP+EX527；A：免疫熒光染色檢測α-SMA表達(dá)；B：Western blot檢測纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)；與Control組比較，**P<0.01；與Ang Ⅱ組比較，##P<0.01；與Ang Ⅱ+CP組比較，△△P<0.01圖6 大黃酚激活SIRT1/PGC-1α信號通路抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞纖維化Fig.6 Chrysophanol inhibits Ang Ⅱ-induced cell fibrosis by activating SIRT1/PGC-1α signaling pathway

3 討論

心房顫動(dòng)(AF)是一種非常常見的臨床心律失常疾病，患病率隨著年齡的增長而增加。房顫患病率的增加與高血壓、冠心病等心臟疾病的高發(fā)密切相關(guān)[9]。心肌纖維化是包括心房顫動(dòng)在內(nèi)的許多心血管疾病的病理生理基礎(chǔ)，是心肌重構(gòu)的重要特征[10]。心臟成纖維細(xì)胞(CF)是心臟的主要細(xì)胞類型，在心肌纖維化中起主要作用[11]，在正常心臟中，成纖維細(xì)胞保持靜止，并負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)的基礎(chǔ)沉積和降解[12]。在壓力條件下，心臟成纖維細(xì)胞增殖侵襲和遷移并分化為肌成纖維細(xì)胞，分泌更高水平的細(xì)胞外基質(zhì)成分，導(dǎo)致心肌纖維化和收縮功能障礙[13]，因此有效抑制心臟成纖維細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化對抑制心房顫動(dòng)至關(guān)重要。

近年來一系列的研究證實(shí)，大黃酚具有抗炎和抗纖維化的作用[14-16]，同時(shí)在心肌損傷中，大黃酚通過抑制炎癥、氧化應(yīng)激和纖維化阻止高脂引起的心肌損傷[17]，表明大黃酚對心肌損傷有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量大黃酚能夠減輕Ang Ⅱ引起的心臟成纖維細(xì)胞增殖、侵襲和遷移及抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)。MMP-2和MMP-9是通過調(diào)節(jié)ECM穩(wěn)態(tài)參與心臟纖維化和肥厚的發(fā)病機(jī)制[18]。同時(shí)不同劑量大黃酚能夠減輕Ang Ⅱ引起的心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中α-SMA、collagenⅠ、fibronectin和CTGF的表達(dá)，α-SMA蛋白是成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因[19]，CTGF也被認(rèn)為是纖維化的生物標(biāo)志物[20]，collagenⅠ和fibronectin被認(rèn)為是參與心臟纖維化的主要誘導(dǎo)因素[21-22]，表明不同劑量大黃酚能夠減輕Ang Ⅱ引起的心臟成纖維細(xì)胞損傷的作用。此外，通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)不同劑量大黃酚能夠激活SIRT1和PGC-1α的表達(dá)。SIRT1是一類NAD+依賴的組蛋白去乙?；?，能夠去乙酰化激活PGC-1α的表達(dá)[23]，在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌組織和心臟成纖維細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)降低[24-25]，PGC-1α干擾后能夠加重Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化[26]，表明有效激活SIRT1/PGC-1α對恢復(fù)Ang Ⅱ引起的心臟成纖維細(xì)胞損傷具有重要的保護(hù)作用。本研究利用SIRT1選擇性抑制劑EX527逆轉(zhuǎn)大黃酚的保護(hù)作用，進(jìn)一步表明大黃酚能夠通過激活SIRT1/PGC-1α信號蛋白的表達(dá)減輕Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖、侵襲和遷移及向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。

綜上所述，大黃酚可減弱Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖、侵襲和遷移及向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，其分子機(jī)制可能與SIRT1/PGC-1α信號通路激活有關(guān)。