次氯酸鈉溶液對(duì)南瓜表面微生物的殺菌條件探索

莊孝飛，顧文佳，顧晟琳

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233)

南瓜（）是人們生活中最常見的蔬菜之一，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較高的藥用價(jià)值。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)南瓜的化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用進(jìn)行了較多的研究，證明南瓜含有多種藥理活性成分，是開發(fā)各種保健食品和藥品的寶貴資源。王勝杰等利用氣相色譜法測(cè)定出南瓜中含有豐富的肌醇，其具有改善細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)，降低血脂，抑制膽固醇的生成及動(dòng)脈硬化等作用?？讘c勝等研究表明，南瓜多糖是較理想的能改善脂類代謝的食療劑。徐國(guó)華等研究表明，南瓜具有一定的抗癌及升高血漿白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的作用和增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫吸附的功能。南瓜作為一種防治糖尿病的特效營(yíng)養(yǎng)保健食材，備受人們的青睞。

我國(guó)是南瓜的主產(chǎn)國(guó)之一，但是新鮮南瓜水分含量較高、不易儲(chǔ)存，若加工銷售不及時(shí)、儲(chǔ)存運(yùn)輸條件不當(dāng)，都會(huì)造成南瓜的腐爛和損耗。南瓜腐爛主要由微生物引起，發(fā)霉腐爛是影響南瓜品質(zhì)的主要因素之一。機(jī)械傷害，更易發(fā)生品質(zhì)劣變和微生物侵染。因此，安全、衛(wèi)生地儲(chǔ)存南瓜，同時(shí)有效保持其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是目前的研究熱點(diǎn)。

有效氯是當(dāng)前最常用的消毒劑之一，采用有效氯對(duì)南瓜表面進(jìn)行消毒是一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效的采后處理方法；然而，目前尚缺乏對(duì)消毒劑濃度和消毒時(shí)間的研究證據(jù)。本研究將探索次氯酸鈉溶液最佳有效殺菌濃度和浸泡時(shí)間，并通過(guò)回接侵染試驗(yàn)確認(rèn)優(yōu)勢(shì)霉菌，驗(yàn)證最佳有效氯濃度的次氯酸鈉溶液的殺菌效果，以期為降低南瓜表面微生物侵染風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)南瓜的貯藏時(shí)間提供依據(jù)，同時(shí)為南瓜等新鮮果蔬的前處理手段提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

供試南瓜品種為“皇家一號(hào)”（上海曹野農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司種植）。試劑有：次氯酸鈉滴定溶液（0.5 mol/L，北京盛世康普化工技術(shù)研究院）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、孟加拉紅培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；高鹽察氏培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式膠回收試劑盒等分子生物學(xué)試劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

設(shè)備有5430R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；KBF240霉菌培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder公司）；VERITI梯度PCR儀（美國(guó)ABI公司）；Geldoc XR＋型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Biorad公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 次氯酸鈉溶液對(duì)新鮮南瓜表面的殺菌效果試驗(yàn)

1.2.1.1 新鮮南瓜表面的菌落總數(shù)統(tǒng)計(jì) 選取27個(gè)新鮮南瓜，分別標(biāo)記序號(hào)后，用棉棒反復(fù)涂抹南瓜尾部表面，涂抹面積為10 cm。將棉棒置于10 mL無(wú)菌生理鹽水中，混勻后進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別吸取0、10、10、10稀釋液1 mL于無(wú)菌平皿中，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，冷凝后倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（48±2）h，計(jì)數(shù)菌落，統(tǒng)計(jì)每個(gè)南瓜表面10 cm內(nèi)菌落總數(shù)值，作為對(duì)照。

1.2.1.2 消毒新鮮南瓜表面的菌落總數(shù)統(tǒng)計(jì) 將上述27個(gè)涂抹過(guò)的南瓜進(jìn)行消毒處理，每3個(gè)南瓜為1組，共9組。采用有效氯濃度為50、200、1 000 mg/kg的次氯酸鈉溶液，分別浸泡3、5、10 min。將浸泡后的南瓜晾干，分別在1.2.1.1所述南瓜10 cm表面相近部位（尾部）再次用棉棒反復(fù)涂抹10 cm大小的區(qū)域，檢測(cè)菌落總數(shù)，方法同1.2.1.1。

計(jì)算殺菌率，殺菌率＝（新鮮南瓜表面的菌落總數(shù)－消毒南瓜表面的菌落總數(shù)）／新鮮南瓜表面的菌落總數(shù)×100%。

1.2.2 腐爛南瓜中優(yōu)勢(shì)霉菌的分離與純化

將從已腐敗的南瓜中分離出的各種霉菌分別接種至PDA培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，從中挑取5株具有典型特征的腐敗霉菌進(jìn)行分離純化。用無(wú)菌剪刀在新鮮南瓜表面上剪出1 cm×1 cm大小的傷口，將分離純化的霉菌分別回接至南瓜表面大小為1 cm ×1 cm的傷口上，以接種無(wú)菌水為對(duì)照，常溫貯藏3～5 d，觀察傷口處的霉菌生長(zhǎng)情況，確定優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌。將分離的優(yōu)勢(shì)霉菌接種于高鹽察氏培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～7 d，觀察并記錄霉菌在培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，包括菌落特征以及菌絲體生長(zhǎng)狀況等。同時(shí)，提取優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌分離株DNA，通過(guò)PCR技術(shù)獲得優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌rDNA-ITS序列，并使用NCBI進(jìn)行序列相似度比對(duì)，從而鑒定優(yōu)勢(shì)霉菌種類。

1.2.3 最佳殺菌條件對(duì)腐爛南瓜中優(yōu)勢(shì)霉菌的最佳殺菌效果

將優(yōu)勢(shì)霉菌g1、w2、w3分別接種至PDA培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d，用0.9%的生理鹽水將孢子洗至無(wú)菌三角瓶中（內(nèi)裝滅菌玻璃珠），搖勻、過(guò)濾出菌絲體，分別制備濃度為2.0×10、2.6×10、6.0×10個(gè)/mL的孢子懸液。取已消毒的9個(gè)新鮮南瓜，每3個(gè)南瓜為1組，共3組。分別標(biāo)記序號(hào)后，在南瓜表面劃出10 cm大小的區(qū)域，將0.1 mL孢子懸液均勻涂至該區(qū)域上，晾干；再經(jīng)1.2.1方法中得出的最佳濃度次氯酸鈉溶液和浸泡時(shí)間處理后，晾干，用棉棒反復(fù)涂抹該區(qū)域，回收南瓜表面的孢子。將棉棒置于10 mL無(wú)菌生理鹽水中，混勻，并進(jìn)行10倍梯度稀釋，取0、10、10、10稀釋度各1 mL于無(wú)菌平皿中，傾注沙氏培養(yǎng)基，冷凝后28 ℃下培養(yǎng)5～7 d，計(jì)數(shù)霉菌。計(jì)算殺菌率，殺菌率＝（初始涂至南瓜表面的霉菌孢子數(shù)值－消毒處理后回收南瓜表面的霉菌孢子數(shù)值）／初始涂至南瓜表面的霉菌孢子數(shù)值×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

殺菌率作為計(jì)量資料采用mean±SD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述?？紤]到3次平行試驗(yàn)條件結(jié)果的相關(guān)性，同一浸泡時(shí)間不同有效氯濃度進(jìn)行比較，同一有效氯濃度不同浸泡時(shí)間進(jìn)行比較，采用線性混合模型（linear mixed model）進(jìn)行分析，得到最佳殺菌條件（有效氯濃度和浸泡時(shí)間）組合。采用SAS 9.4統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 次氯酸鈉溶液對(duì)南瓜表面的殺菌效果

如表1所示，在不同浸泡時(shí)長(zhǎng)下，隨著有效氯濃度的升高，殺菌率也隨之升高（＜0.05）。在10 min浸泡時(shí)長(zhǎng)下，有效氯50 mg/kg與有效氯200 mg/kg溶液的殺菌率差異的值處于0.05臨界（＝0.044 9），有效氯200 mg/kg與有效氯1 000 mg/kg溶液的殺菌率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＝0.705 7）。在有效氯200 mg/kg和有效氯50 mg/kg濃度下，隨浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，殺菌率也隨之升高（＜0.05），在有效氯1 000 mg/kg濃度下，殺菌率達(dá)到高峰，不同浸泡時(shí)間下的殺菌率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＞0.05）。兼顧食品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和感官質(zhì)量，在達(dá)到一定殺菌效果的同時(shí)盡量采用較低濃度次氯酸鈉溶液；因此，本試驗(yàn)確定最佳消毒條件為有效氯200 mg/kg的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，南瓜表面的殺菌率達(dá)到99.53%。

表1 不同有效氯濃度、不同浸泡時(shí)間南瓜表面殺菌率

2.2 腐爛南瓜中優(yōu)勢(shì)霉菌的分離與純化

經(jīng)培養(yǎng)后，腐爛南瓜表面上的霉菌在2種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出形態(tài)各異的霉菌。從中挑取5株具有典型特征的腐敗霉菌分離純化并進(jìn)行回接后，有3株霉腐的菌絲生長(zhǎng)旺盛，侵染較快，1個(gè)月后南瓜傷口處已腐敗潰爛（圖1），由此確認(rèn)這3株霉菌為優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌，其形態(tài)特征如表2所示。

圖1 優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌回接侵染試驗(yàn)

分別以菌株g1、w2、w3基因組DNA為模板，采用真核生物ITS通用擴(kuò)增引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，獲得609、565、586 bp的ITS片段的PCR產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測(cè)，3個(gè)分離株ITS基因擴(kuò)增片段如圖2所示。N C B I序列相似度比對(duì)結(jié)果如表2所示，鑒定得出3株霉腐，分別是黑曲霉（）、西瓜蔓枯病菌（）、芽枝霉屬（）。

圖2 優(yōu)勢(shì)菌株g1、w2、w3的ITS序列電泳檢測(cè)結(jié)果

表2 優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的形態(tài)特征、ITS序列鑒定及NCBI比對(duì)結(jié)果

2.3 最佳殺菌條件對(duì)腐爛南瓜表面優(yōu)勢(shì)霉菌的殺菌效果

如表3所示，在有效氯200 mg/kg的次氯酸鈉溶液浸泡10 min的殺菌條件下，對(duì)腐爛南瓜表面優(yōu)勢(shì)霉菌g1、w2、w3的殺菌率均在99.1%及以上，殺菌效果顯著。

表3 最佳殺菌條件對(duì)優(yōu)勢(shì)霉菌的殺菌率

3 結(jié)論與討論

南瓜的保鮮儲(chǔ)存問(wèn)題一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)，研究表明南瓜最佳儲(chǔ)存環(huán)境為10 ℃左右，濕度不超過(guò)80%，通風(fēng)、防碰傷。一旦出現(xiàn)傷口，則容易腐爛。本研究發(fā)現(xiàn)，南瓜最先出現(xiàn)腐爛的部位一般都在瓜蒂和尾部，還有采摘運(yùn)輸中形成的傷口位置。因瓜蒂和傷口有破損，微生物易侵入，外加濕熱的儲(chǔ)存環(huán)境，會(huì)加速南瓜的腐爛。在采收后及時(shí)對(duì)南瓜表面進(jìn)行消毒，去除有害易致腐微生物，將是簡(jiǎn)單有效且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的延長(zhǎng)南瓜貯藏時(shí)間的方式之一。

本研究表明，采用次氯酸鈉溶液對(duì)南瓜表面消毒，能夠有效殺滅南瓜表面大部分微生物。經(jīng)線性混合模型分析，并考慮到食品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和感官質(zhì)量，南瓜采后處理盡量在達(dá)到一定的殺菌效果的同時(shí)采用低濃度消毒溶液，因此得到殺菌條件組合為：有效氯200 mg/kg的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，對(duì)南瓜表面的殺菌率可達(dá)到99.53%。這與方宗壯等的研究結(jié)果相似，經(jīng)200 mg/kg次氯酸鈉溶液處理的鮮切菠蘿能更好地保持產(chǎn)品品質(zhì)，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間。

劉程惠等從腐敗的蘋果中分離出優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌黑曲霉。陳悅等從發(fā)病西瓜葉片上獲得334株西瓜蔓枯病菌。何祎對(duì)邳州地區(qū)霉腐蒜頭的微生物進(jìn)行了分離鑒定，確定腐霉的種類主要為芽枝霉菌、黑霉菌等。本研究從腐敗南瓜中分離純化出的優(yōu)勢(shì)霉菌為黑曲霉（）、西瓜蔓枯病菌（）和芽枝霉屬（），可引起多種食品腐敗變質(zhì)，這為后續(xù)食品貯藏中腐敗微生物的防治提供了有力的信息支持。將分離得到的3種優(yōu)勢(shì)霉菌分別接種至新鮮南瓜后，經(jīng)本研究探索出的最佳殺菌條件進(jìn)行處理，殺菌率依然在99.1%及以上，證明該最佳殺菌條件對(duì)南瓜表面的腐敗霉菌能夠起到很好的消殺作用。

綜上，有效氯200 mg/kg的次氯酸鈉溶液浸泡10 min是本研究探索出的最佳殺菌條件；該殺菌條件對(duì)腐敗霉菌的殺菌效果得到了驗(yàn)證，能夠?qū)δ瞎媳砻嫖⑸锇?xì)菌和腐敗霉菌起到良好的消殺作用，可作為采后南瓜表面殺菌的有效手段。