線粒體代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)及其在微生物細(xì)胞工廠應(yīng)用中的研究進(jìn)展

李昌凡， 林銘鑫， 盧雪瑤， 柳隱芳， 顧 洋， 黃 和

（南京師范大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210046）

真核微生物擁有多個(gè)細(xì)胞器，如線粒體、細(xì)胞核、高爾基體等，各細(xì)胞器將細(xì)胞質(zhì)空間區(qū)域化并執(zhí)行特定的代謝功能[1]。 其中，線粒體是真核微生物細(xì)胞內(nèi)三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)、氧化磷酸化反應(yīng)、支鏈氨基酸及許多輔因子（如硫辛酸）合成的場所，對于幾乎所有真核微生物來說都是必不可少的[2]。 此外，線粒體內(nèi)環(huán)境具有氧化還原電位強(qiáng)、氧濃度低、pH 高、代謝物豐富等特征，與細(xì)胞質(zhì)環(huán)境有顯著差異[3]。 同時(shí)，線粒體空間相對較小，有利于底物的濃縮，促進(jìn)酶促反應(yīng)的正向進(jìn)行。 因此，微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建工作已嘗試將產(chǎn)物合成途徑固定于線粒體內(nèi)[3-5]，例如支鏈醇、類異戊二烯、單萜等代謝產(chǎn)物的合成，通過將產(chǎn)物合成途徑固定于線粒體有利于利用線粒體內(nèi)的優(yōu)勢資源，也可以避免中間代謝物在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中積累對細(xì)胞造成的毒性作用，防止副產(chǎn)物途徑的競爭。

線粒體具有雙膜結(jié)構(gòu)， 由線粒體外膜（outer mitochondrial membrane，OMM）和線粒體內(nèi)膜（inner mitochondrial membrane，IMM）構(gòu)成[6]。 然而，IMM 具有高度的選擇性和不可透性，僅允許一些小的不帶電分子擴(kuò)散通過（O2和CO2等），導(dǎo)致線粒體與細(xì)胞質(zhì)和其他細(xì)胞器間的物質(zhì)交換只能由線粒體膜載體蛋白（mitochondrial carriers ，MCs）或代謝物穿梭通道實(shí)現(xiàn)，極大限制了線粒體工程在代謝工程和微生物細(xì)胞工廠的應(yīng)用。線粒體生物學(xué)研究表明，MCs主要參與了線粒體內(nèi)代謝物的輸出和線粒體外代謝物的輸入，調(diào)控著線粒體內(nèi)物質(zhì)的穩(wěn)態(tài)[7]。 MCs 氨基酸序列高度保守，通常由100 個(gè)氨基酸的3 個(gè)重復(fù)殘基結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)殘基結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)保守的特征序列PX[D/E]XX[K/R]X[K/R]和[D/E]GXXX X[W/Y/F][K/R]G，兩個(gè)保守的序列由20~30 個(gè)氨基酸隔開，該特征序列已被用于識別和預(yù)測生物體中MCs[8]。 目前大部分工業(yè)微生物的MCs 及其生理功能已被鑒定和表征，并且研究者還發(fā)現(xiàn)了幾種負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)乙酰基（CH3CO-）和穩(wěn)定氧化還原力的線粒體/細(xì)胞質(zhì)代謝物穿梭通道[9]。 為此，作者將主要對工業(yè)微生物酵母中已鑒定的MCs 和線粒體/細(xì)胞質(zhì)代謝物穿梭通道進(jìn)行分類和歸納，總結(jié)目前線粒體膜載體蛋白工程在微生物代謝改造中的應(yīng)用，同時(shí)對其未來發(fā)展進(jìn)行展望。

1 碳代謝物線粒體膜載體

線粒體是真核微生物TCA 循環(huán)的發(fā)生場所，而TCA 循環(huán)是糖、 脂肪和蛋白質(zhì)代謝與轉(zhuǎn)化的樞紐，其中間代謝產(chǎn)物（檸檬酸、α-酮戊二酸、 草酰乙酸等）直接參與了糖、氨基酸、脂肪的合成代謝。 因此，線粒體內(nèi)TCA 循環(huán)中間代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)對于真核微生物的生理代謝至關(guān)重要，碳代謝物MCs 是實(shí)現(xiàn)TCA 循環(huán)中間代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)的主要途徑（見圖1）。

圖1 碳代謝物線粒體膜載體Fig. 1 Carbon metabolites mitochondrial carriers

1.1 丙酮酸載體

細(xì)胞質(zhì)丙酮酸是糖酵解途徑的最終代謝物，同時(shí)也是TCA 循環(huán)的起始代謝物，因此需要將細(xì)胞質(zhì)的丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體。 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 中， 已鑒定的丙酮酸MCs 包括亞基Mpc1p、Mpc2p 和Mpc3p[10]。 其中，亞基Mpc1p 和Mpc2p 復(fù)合物在有氧條件下具有丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性，而Mpc1p 和Mpc3p 復(fù)合物在厭氧條件下表現(xiàn)出轉(zhuǎn)運(yùn)活性。 為了使丙酮酸代謝通量轉(zhuǎn)向目標(biāo)化學(xué)品生產(chǎn)，Morita 等對S. cerevisiae的線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因（MPC1）進(jìn)行敲除以抑制線粒體代謝，減少不必要的丙酮酸消耗，結(jié)果顯示敲除MPC1后乙醇產(chǎn)量增加14.3 倍，達(dá)到（336.4±113.5） mg/L，表明基于線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)控制線粒體代謝能提高酵母化學(xué)物質(zhì)的生產(chǎn)力[11]。

1.2 琥珀酸/富馬酸載體

基因ACR1編碼的Sfc1p 是S. cerevisiae的琥珀酸/富馬酸線粒體載體[12]，其將線粒體內(nèi)的富馬酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)的同時(shí)會將等量的細(xì)胞質(zhì)琥珀酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)。有研究表明，Sfc1p 參與了S.cerevisiae的乙醇代謝，Sfc1p 的缺失會導(dǎo)致S. cerevisiae無法在以乙酸或乙醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長[13]。Yuzbasheva 等報(bào)道了Y. lipolytica的線粒體琥珀酸/富馬酸載體YlSfc1， 其控制著線粒體的異檸檬酸外流[14]。 對YlSfc1 純化后載體功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)除異檸檬酸外，其還可以轉(zhuǎn)運(yùn)琥珀酸、富馬酸、草酰乙酸、異檸檬酸和α-酮戊二酸。

1.3 檸檬酸/α-酮戊二酸載體

S. cerevisiae的檸檬酸/α-酮戊二酸載體Yhm2p由基因YMR241w編碼，其對檸檬酸鹽和α-酮戊二酸的Km值分別為0.2 mmol/L 和1.2 mmol/L[15]。 檸檬酸/α-酮戊二酸載體在將乙酰輔酶A 以檸檬酸的形式從線粒體輸出到細(xì)胞質(zhì)中起著核心作用，進(jìn)而連接碳水化合物分解代謝和脂肪生成。 Yuzbasheva 等對Y. lipolytica中編碼檸檬酸/α-酮戊二酸載體的基因YlCTP1和YlYHM2進(jìn)行敲除， 發(fā)現(xiàn)ΔYlctp1菌株在生長速度、有機(jī)酸和脂質(zhì)產(chǎn)量方面與野生型菌株無顯著差異，但ΔYlyhm2菌株不能在含有少量檸檬酸鹽的液體培養(yǎng)基中生長。 此外，在含糖、脂肪生長培養(yǎng)基中，YlYHM2突變株不產(chǎn)生檸檬酸，且異檸檬酸和脂質(zhì)的產(chǎn)量也顯著下降， 但將基因YlYHM2重新引入ΔYlyhm2菌株能恢復(fù)在檸檬酸培養(yǎng)基中的生長。 載體功能分析發(fā)現(xiàn)，ΔYlyhm2菌株的檸檬酸/檸檬酸和α-酮戊二酸/α-酮戊二酸同交換活性分別降低了87%和40%，而檸檬酸（進(jìn)）/α-酮戊二酸（出）和α-酮戊二酸（進(jìn)）/檸檬酸（出）的異質(zhì)交換活性分別降低了87%和95%[16]。

1.4 二羧酸載體

Oac1p 和Dic1p 是S. cerevisiae的二羧酸線粒體載體，其中Oac1p 是草酰乙酸/硫酸鹽載體[17]，而Dic1p 負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)琥珀酸和蘋果酸[10]。Oac1p 存在于線粒體膜內(nèi)，能運(yùn)輸丙二酸、草酰乙酸、硫酸鹽和硫代硫酸鹽，其基因的缺失會大大減少草酰乙酸、硫代硫酸鹽和丙二酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，Oac1p 缺失的突變體可以在全合成培養(yǎng)基（CSM）和復(fù)合培養(yǎng)基（YPD）上生長， 但Oac1p 和Dic1p 的雙重缺失的突變體在CSM 和YPD 上無法生長[18]。研究表明細(xì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶可以催化草酰乙酸生成蘋果酸， 然后通過Dic1p 轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中， 從而維持細(xì)胞對草酰乙酸的需求[17]。

2 NAD(P)H 的線粒體/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通道和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

NADH/NAD+和NADPH/NADP+不僅是細(xì)胞分解代謝和合成代謝中必不可少的電子供體和受體，而且還作為還原力來維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)[19]。NADH/NAD+和NADPH/NADP+分別存在于740 個(gè)和887 個(gè)生物代謝反應(yīng)中[20]，其生理功能包括驅(qū)動(dòng)生化過程、控制代謝通量、調(diào)節(jié)能量代謝、影響線粒體功能和細(xì)胞壽命[21-22]。 然而，細(xì)胞內(nèi)的NADH/NAD+和NADPH/NADP+具有高度區(qū)域化分布的特點(diǎn)，這在很大程度上歸因于NADH/NAD+和NADPH/NADP+特定的亞細(xì)胞器代謝途徑[23]，比如線粒體中就含有大量的NADH/NAD+和NADPH/NADP+，據(jù)報(bào)道細(xì)胞中約有50%的NADH/NAD+和NADPH/NADP+存在于線粒體中[24]。 然而，由于IMM 具有NADH/NAD+和NADPH/NADP+不可滲透的特性，所以線粒體和細(xì)胞質(zhì)之間的NADH/NAD+和NADPH/NADP+的交換只能通過線粒體載體或代謝物穿梭通道實(shí)現(xiàn)[25]。 迄今為止，酵母中鑒定的NAD+載體包括Ndt1p 和Ndt2p[26]，但其主要生理功能是通過單向交換的方式轉(zhuǎn)運(yùn)NAD+[18]。 因此，維持線粒體和細(xì)胞質(zhì)的氧化還原穩(wěn)態(tài)主要依賴于線粒體代謝物穿梭通道[27]，包括3-磷酸甘油穿梭通道、乙醇/乙醛穿梭通道、蘋果酸/草酰乙酸穿梭通道、蘋果酸/天冬氨酸穿梭通道、蘋果酸/丙酮酸穿梭通道、異檸檬酸/α-酮戊二酸穿梭通道、丙酮酸/草酰乙酸/蘋果酸（POM）穿梭通道、蘋果酸/檸檬酸穿梭通道、一碳代謝穿梭通道和脂肪酸穿梭通道等（見圖2）[7，23，27-28]。 蘋果酸/檸檬酸穿梭通道、一碳代謝穿梭通道和脂肪酸穿梭通道主要存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中， 在酵母中不起作用，因此不詳細(xì)討論。

圖2 NAD（P）H 的線粒體/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通道Fig. 2 NAD（P）H mitochondrial/cytoplasmic shuttles

2.1 3-磷酸甘油穿梭通道

以葡萄糖或其他還原性高的底物進(jìn)行發(fā)酵合成還原性低的產(chǎn)物時(shí)，微生物會在生長和產(chǎn)物合成階段產(chǎn)生大量的NADH，如微生物合成1 mol 的N-乙酰氨基葡萄糖會產(chǎn)生2 mol 的NADH，因此N-乙酰氨基葡萄糖合成時(shí)極易導(dǎo)致重組工程菌細(xì)胞內(nèi)積累NADH， 造成細(xì)胞內(nèi)還原力失衡， 進(jìn)而合成NADH 依賴型副產(chǎn)物或消耗O2氧化過剩的NADH[29]。不論哪種方式都會消耗額外的碳源，降低底物經(jīng)濟(jì)性，所以維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和平衡對于分解代謝和合成代謝至關(guān)重要[30]。其中，3-磷酸甘油穿梭通道是一種在有氧條件下處理細(xì)胞內(nèi)多余NADH 的途徑， 其通過線粒體電子呼吸鏈間接氧化細(xì)胞質(zhì)NADH 再生NAD+[31]， 由位于線粒體內(nèi)膜上的3-磷酸甘油脫氫酶Gut2p 和細(xì)胞質(zhì)NAD+依賴性3-磷酸甘油脫氫酶Gpd1p/Gpd2p 組成[32]。 具體而言，3-磷酸甘油穿梭通道的作用如下：1）Gpd1p/Gpd2p 將細(xì)胞質(zhì)脫羥基丙酮磷酸（DHAP）轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油（G3P），并將細(xì)胞質(zhì)NADH 氧化為NAD+；2）產(chǎn)生的G3P 通過OMM（OMM 包含膜孔，可以允許相對分子質(zhì)量小于5 000 的物質(zhì)自由擴(kuò)散） 擴(kuò)散至線粒體IMM 和OMM 之間的空間；3）Gut2p 催化G3P 氧化，重新生成DHAP，并產(chǎn)生FADH2進(jìn)入線粒體呼吸鏈參與氧化磷酸化產(chǎn)生ATP （腺嘌呤核苷三磷酸）；4）最后，生成的DHAP通過自由擴(kuò)散返回細(xì)胞質(zhì)[27]。 值得說明的是，3-磷酸甘油穿梭通道催化過程是不可逆的[9]，敲除Gut2p編碼基因GUT2可以阻斷3-磷酸甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高甘油產(chǎn)量，且對S.cerevisiae的細(xì)胞生長沒有影響[31，33]。 此外，Y. lipolytica中基因GUT2的缺失能導(dǎo)致脂質(zhì)產(chǎn)量增加3 倍[34]，表明3-磷酸甘油穿梭通道的破壞有利于合成還原性代謝物。

2.2 乙醇/乙醛穿梭通道

乙醇/乙醛穿梭通道由線粒體乙醇脫氫酶Adh3p 和細(xì)胞質(zhì)乙醇脫氫酶Adh1p/Adh2p 組成，其可以輸出線粒體內(nèi)還原力將細(xì)胞質(zhì)NAD+還原為NADH[27]。 由于乙醇和乙醛具有磷脂膜可透的特點(diǎn)，因此乙醇/乙醛穿梭通道中沒有轉(zhuǎn)運(yùn)載體。有研究推測乙醇/乙醛穿梭通道在好氧條件下沒有生理功能，但在厭氧條件下對細(xì)胞代謝起重要作用[27，35]，因?yàn)樵趨捬鯒l件下細(xì)胞NADH 主要由線粒體中丙酮酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶合成谷氨酸產(chǎn)生[36]。 據(jù)報(bào)道， 編碼線粒體乙醇脫氫酶Adh3p 基因缺失后，在厭氧條件下S. cerevisiae生長速率顯著降低[35]，表明乙醇/乙醛穿梭通道參與了細(xì)胞代謝。

2.3 蘋果酸/草酰乙酸穿梭通道

蘋果酸/草酰乙酸穿梭通道由線粒體/細(xì)胞質(zhì)NAD+特異性蘋果酸脫氫酶Mdh1p 和Mdh2p、 蘋果酸線粒體載體Dic1p 和草酰乙酸線粒體載體Oac1p組成，可將細(xì)胞質(zhì)NADH 轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體進(jìn)行氧化[27]。此外， 蘋果酸/草酰乙酸穿梭通道在過氧化物酶體β-氧化循環(huán)中也發(fā)揮著重要作用，它可以將過氧化物酶體NADH 轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體，將NADH 重新氧化為NAD+， 從而平衡過氧化物酶體還原當(dāng)量[37]，Mdh1p缺失的S. cerevisiae突變體無法代謝脂肪酸[38]。

2.4 蘋果酸/天冬氨酸穿梭通道

蘋果酸/天冬氨酸穿梭通道是哺乳動(dòng)物和微生物中細(xì)胞質(zhì)NADH 氧化的主要途徑[39]：1）細(xì)胞質(zhì)草酰乙酸被細(xì)胞質(zhì)NAD+特異性蘋果酸脫氫酶Mdh2p還原為蘋果酸， 同時(shí)消耗1 分子細(xì)胞質(zhì)NADH，產(chǎn)生1 分子NAD+；2）產(chǎn)生的細(xì)胞質(zhì)蘋果酸在二羧酸載體Dic1p 的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)， 同時(shí)運(yùn)出等量的α-酮戊二酸；3）線粒體NAD+特異性蘋果酸脫氫酶Mdh1p 將蘋果酸氧化為草酰乙酸， 并產(chǎn)生1分子NADH；4）草酰乙酸通過線粒體轉(zhuǎn)氨酶Aat1p以谷氨酸作為氨供體轉(zhuǎn)氨生成天冬氨酸；5）線粒體天冬氨酸通過天冬氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Agc1p 運(yùn)出到細(xì)胞質(zhì)；6）最后，天冬氨酸通過細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)氨酶Aat2p 重新轉(zhuǎn)化為草酰乙酸。 Agc1p 將天冬氨酸從線粒體轉(zhuǎn)出到細(xì)胞質(zhì)取決于線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子動(dòng)力， 轉(zhuǎn)運(yùn)1 分子天冬氨酸需要消耗1分子谷氨酸分子和1 個(gè)質(zhì)子[39-41]，因此基于這個(gè)特征蘋果酸/天冬氨酸穿梭通道在呼吸條件下進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)NADH 向線粒體的單向轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致線粒體中的NADH 與NAD+比值遠(yuǎn)高于細(xì)胞質(zhì)[39]。

2.5 異檸檬酸/α-酮戊二酸穿梭通道

異檸檬酸/α-酮戊二酸穿梭通道由線粒體NADP+特異性異檸檬酸脫氫酶Idh1p、 細(xì)胞質(zhì)NADP+特異性異檸檬酸脫氫酶Idp2p、 檸檬酸/蘋果酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ctp1p 和α-酮戊二酸/檸檬酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Yhm2p 組成。 NADPH 是微生物細(xì)胞重要的輔因子和能源物質(zhì)，其以氫和電子供體/載體的形式直接參與了細(xì)胞內(nèi)586 個(gè)酶催化的1 058 個(gè)生化反應(yīng)， 這些反應(yīng)通過NADPH 的再生與競爭性利用影響著微生物物質(zhì)的代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和底物轉(zhuǎn)運(yùn)[30，42]。 NADPH 則專一用于還原性物質(zhì)的合成，比如在以葡萄糖或乙酸為底物合成脂肪酸和固醇類物質(zhì)時(shí)， 需要消耗NADPH 作為氫原子或電子供體將酮基還原為亞甲基[43-45]。 因此，NADPH 的供給被認(rèn)為是影響微生物合成還原性物質(zhì)（脂肪酸和固醇類物質(zhì)等）的關(guān)鍵因素之一。 微生物細(xì)胞內(nèi)NADPH主要來源于磷酸戊糖途徑，然而磷酸戊糖途徑作為糖酵解的支路代謝受到多層次、 多時(shí)空的調(diào)控，通過代謝工程手段很難迫使代謝流向磷酸戊糖途徑增加NADPH 的供應(yīng)[44]。 理論上講，異檸檬酸/α-酮戊二酸穿梭通道可以解決上述問題，該穿梭通道可以將線粒體內(nèi)NADPH 外排至細(xì)胞質(zhì)中， 具體過程包括：1）線粒體NADP+特異性異檸檬酸脫氫酶Idh1p 催化α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為異檸檬酸， 同時(shí)將NADPH 氧化為NADP+；2）線粒體異檸檬酸在檸檬酸/蘋果酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ctp1p 的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)轉(zhuǎn)入等量的蘋果酸；3）異檸檬酸在細(xì)胞質(zhì)NADP+特異性異檸檬酸脫氫酶Idh2p 催化下轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，并產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)NADPH；4）最后，細(xì)胞質(zhì)α-酮戊二酸通過α-酮戊二酸/檸檬酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Yhm2p 轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中[28]。 然而到目前為止，異檸檬酸/α-酮戊二酸穿梭通道在代謝工程中還沒有得到實(shí)際應(yīng)用。

2.6 丙酮酸/草酰乙酸/蘋果酸（POM）穿梭通道

丙酮酸/草酰乙酸/蘋果酸穿梭通道由線粒體NADP+特異性蘋果酸酶Mae2p、 細(xì)胞質(zhì)NADP+特異性蘋果酸酶Mae1p 和二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Dic1p 組成，該穿梭通道已被用于將線粒體內(nèi)的NADPH轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)[46]。 在代謝工程改造Y. lipolytica合成脂質(zhì)的研究中，Qiao 等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)NADP+依賴的蘋果酸酶增強(qiáng)POM 循環(huán)， 從毛霉中克隆并表達(dá)MCE2，使得工程菌株的脂質(zhì)產(chǎn)量從0.17 g/g 增加到0.21 g/g，同時(shí)生物量也略有增加[44]。

3 輔因子線粒體載體

輔因子（ADP、ATP、GDP、GTP、FAD 等）被廣泛用作代謝反應(yīng)的底物、抑制劑和激活劑[47]，影響細(xì)胞許多生理和生化功能，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、主動(dòng)運(yùn)輸、細(xì)胞形態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)以及蛋白質(zhì)定位和磷酸化[48]。在線粒體中，輔因子還參與許多合成代謝和分解代謝[49]，然而線粒體缺乏一些參與輔因子合成和再生途徑的關(guān)鍵酶，且IMM 對大多數(shù)輔因子（包括ATP、GTP、FAD、硫辛酸等）是不可透的。因此，輔因子線粒體載體對維持細(xì)胞生理代謝和生理功能是必不可少的。

3.1 ADP/ATP 載體

細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ATP 有兩種合成途徑，即氧化磷酸化和底物水平磷酸化。 與底物水平磷酸化相比，氧化磷酸化在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ADP/ATP 水平方面更為重要，因?yàn)榇送緩绞窃偕鶤TP 的主要途徑[48]。 具體來說， 真核微生物的氧化磷酸化發(fā)生在線粒體中，其中ATP 合酶以ADP 和磷酸鹽為前體， 催化ATP 的再生。 線粒體內(nèi)的ADP 通常由ADP/ATP 載體由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入，同時(shí)向細(xì)胞質(zhì)輸出等量的線粒體ATP[50]，因此ADP/ATP 載體在有氧條件下對細(xì)胞能量代謝發(fā)揮著重要作用。 目前， 已確定的釀酒酵母ADP/ATP 載體包括Aac1p、Aac2p 和Aac3p，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)有氧條件下僅需要Aac2p[51]，而厭氧條件下Aac3p 發(fā)揮作用[52]。 在厭氧條件下細(xì)胞內(nèi)ATP 主要是由底物水平的磷酸化產(chǎn)生，Aac3p 可以將細(xì)胞質(zhì)中合成的ATP 導(dǎo)入線粒體以維持線粒體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[52]。

3.2 GDP/GTP 載體

5′-三磷酸鳥苷（GTP）對線粒體功能至關(guān)重要，是RNA 合成、 蛋白質(zhì)合成及糖異生反應(yīng)的必需前體，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)重要的能量物質(zhì)[53]。 一般而言，細(xì)胞內(nèi)合成GTP 的生物反應(yīng)包括：1）琥珀酰輔酶A合成酶將琥珀酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為琥珀酸， 同時(shí)生成GTP；2）通過核苷二磷酸激酶將磷酸基團(tuán)從ATP 轉(zhuǎn)移到5′-二磷酸鳥苷（GDP）。然而，S. cerevisiae線粒體內(nèi)的琥珀酰輔酶A 合成酶底物偏好性為ADP，而不是GDP， 且線粒體中不存在核苷二磷酸激酶，其定位在線粒體膜間隙中[54]，因此需要將細(xì)胞質(zhì)GTP導(dǎo)入線粒體。 基因YDL198c編碼的Ggc1p 已被鑒定為S. cerevisiae的GDP/GTP 線粒體載體，其可以介導(dǎo)GTP、GDP、脫氧鳥苷-5′-三磷酸（dGTP）、脫氧鳥苷-5′-二磷酸（dGDP）、三磷酸肌苷（ITP）和二磷酸肌苷（IDP）的轉(zhuǎn)運(yùn)，其中Ggc1p 對GDP/GTP 的親和力比dGDP/dGTP 高10 倍左右， 是IDP/ITP 的100 倍[55]。此外，Ggc1p 的缺失會導(dǎo)致S. cerevisiae線粒體中GDP 水平升高，GTP 水平降低， 證明了Ggc1p 的主要生理功能是介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)GTP 的轉(zhuǎn)入[55]。

3.3 黃素腺嘌呤二核苷酸載體

黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是黃素輔酶不可缺少的輔因子，在氧化還原穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)折疊、DNA 修復(fù)、脂肪酸β-氧化、氨基酸氧化和膽堿代謝等方面發(fā)揮重要作用[56-58]。S. cerevisiae中的FAD 由線粒體FAD 合成酶（EC 2.7.7.2）在線粒體內(nèi)合成，并通過一種不同于核黃素的吸收系統(tǒng)被輸出到細(xì)胞質(zhì)中。為了解S. cerevisiae的線粒體FAD 載體Flx1p 的作用，Bafunno 等構(gòu)建了一個(gè)Flx1p 基因敲除突變株，對突變株與原始株線粒體就吸收核黃素、合成FAD以及FAD 輸出到細(xì)胞質(zhì)的能力進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)突變株的線粒體特異性地失去了輸出FAD 的能力，但沒有失去吸收核黃素、黃素單核苷酸以及合成FAD的能力，表明Flx1p 是線粒體FAD 外排載體[59]。 此外， 基因FLX1的缺失導(dǎo)致線粒體硫辛酰胺脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性的特異性降低。

3.4 輔酶A 載體

輔酶A （CoA） 是一種普遍分布的細(xì)胞內(nèi)輔因子，據(jù)估計(jì)CoA 及其衍生物酰基輔酶A 參與4%的已知生化反應(yīng)，涉及碳代謝、氨基酸代謝、脂肪酸合成和乙酰膽堿合成[60]。在S. cerevisiae中，已鑒定的CoA 載 體Leu5p 由 基 因YHR002w編 碼， 基 因YHR002w缺失會導(dǎo)致線粒體CoA 濃度降低至1/15，但不影響細(xì)胞質(zhì)CoA 水平[61]。

3.5 硫胺素焦磷酸載體

硫胺素焦磷酸鹽（ThPP）是細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)酮酶、線粒體乙酰乳酸合酶、細(xì)胞質(zhì)丙酮酸脫羧酶、線粒體α-酮戊二酸脫氫酶和線粒體丙酮酸脫氫酶E1 組分的必需輔酶[62]。 基因YGR096w編碼的S. cerevisiae的ThPP 線粒體載體Tpc1p 生理功能是將細(xì)胞質(zhì)ThPP輸入線粒體并將生成的硫胺素磷酸鹽（ThMP） 輸出到細(xì)胞質(zhì)，缺失Tpc1p 的突變菌株在不添加硫胺素或支鏈氨基酸的情況下無法生長[62]。

4 氨基酸線粒體載體

線粒體在細(xì)胞氮代謝中也起著關(guān)鍵作用，包括：1）部分氨基酸直接在線粒體中合成，同時(shí)氨基酸的碳骨架來源于線粒體TCA 循環(huán)；2）細(xì)胞內(nèi)NH4+去除的關(guān)鍵反應(yīng)發(fā)生在線粒體中[63]。 在線粒體中直接合成的氨基酸包括丙氨酸和支鏈氨基酸纈氨酸和異亮氨酸， 其中丙氨酸由線粒體轉(zhuǎn)氨酶Alt1p 合成，消耗前體丙酮酸和谷氨酸[64]，而纈氨酸和異亮氨酸由丙酮酸在乙酰乳酸合酶llv2p、乙酰乳酸變位酶llv5p、 二羥酸脫水酶llv3p 和支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶Bat1p 催化下合成[6]。 此外，利用線粒體TCA 循環(huán)中代謝物作為碳骨架的氨基酸包括谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸[25]。然而，迄今為止僅鑒定和表征了5種氨基酸的線粒體載體[63]，包括谷氨酸、天冬氨酸/谷氨酸、鳥氨酸、甘氨酸、S-腺苷甲硫氨酸。

4.1 谷氨酸載體

在S. cerevisiae中， 已鑒定的線粒體谷氨酸載體 是Ymc2p，由 基 因YBR104wp編 碼[63]，Ymc2p 對谷氨酸的Km值約為15 μmol/L，Ymc2p 催化的谷氨酸單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Vmax達(dá)到4 μmol/（min·g）[65]。 然而，與已鑒定的人類谷氨酸載體不同，Ymc2p 缺乏與谷氨酸結(jié)合的功能域。 并且， 在某些特定條件下，Ymc2p 可以反向輸出谷氨酸，目前Ymc2p 的機(jī)制尚不清晰。 此外，Ymc1p 與Ymc2p 具有65%的序列同源性，也被認(rèn)為是線粒體谷氨酸載體[66]。

4.2 天冬氨酸/谷氨酸載體

Agc1p 已被確定為S. cerevisiae中天冬氨酸/谷氨酸線粒體載體，其能將細(xì)胞質(zhì)谷氨酸輸入線粒體從而合成鳥氨酸，并將線粒體中天冬氨酸、半胱氨酸亞磺酸輸出到細(xì)胞質(zhì)[63]。 Agc1p 是線粒體蘋果酸/天冬氨酸線粒體穿梭通道的重要組成部分，可以平衡細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，并維持細(xì)胞在乙酸鹽和脂肪酸上的生長，Agc1p 缺失突變體不能在以醋酸鹽和油酸為碳源的合成培養(yǎng)基上生長[8]。

4.3 鳥氨酸載體

鳥氨酸線粒體載體Ort1p 轉(zhuǎn)運(yùn)鳥氨酸出線粒體的同時(shí)可能伴有瓜氨酸、精氨酸和賴氨酸的交換[67]，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)精氨酸或賴氨酸濃度較高時(shí)，Ort1p 可以催化賴氨酸或精氨酸進(jìn)入線粒體，同時(shí)轉(zhuǎn)出鳥氨酸[18]。 Ort1p 的轉(zhuǎn)運(yùn)活性可被甲基汞、5′-磷酸吡哆醛、對氯汞苯磺酸鹽、對羥基汞苯甲酸鹽和N-乙基馬來酰亞胺抑制[63]。 此外，人來源的Ort1p 可以運(yùn)輸一些堿性氨基酸，如組氨酸、賴氨酸、精氨酸、單甲基精氨酸、高精氨酸和不對稱二甲基精氨酸[63]，且在尿素代謝中發(fā)揮重要作用，從線粒體轉(zhuǎn)出瓜氨酸參與細(xì)胞質(zhì)尿素循環(huán)，將瓜氨酸轉(zhuǎn)化為無毒的鳥氨酸和尿素[68]。

4.4 甘氨酸載體

基因YDL119cp編碼的甘氨酸線粒體載體Hem25p，其缺陷突變體中的線粒體對細(xì)胞質(zhì)甘氨酸的吸收減少，同時(shí)呼吸效率降低，表明Hem25p 負(fù)責(zé)將細(xì)胞質(zhì)甘氨酸輸入線粒體[69]。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)Hem25p 不是唯一的線粒體甘氨酸載體，SLC25家族成員Ymc1 也是甘氨酸線粒體載體[70]。

4.5 S-腺苷甲硫氨酸載體

S-腺苷甲硫氨酸載體為Sam5p，可以將細(xì)胞質(zhì)的S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中， 參與DNA、RNA、蛋白質(zhì)和甾醇甲基化反應(yīng)，同時(shí)作為生物素和硫辛酸合成的輔助因子[71]。研究表明，Sam5p 也參與線粒體與細(xì)胞質(zhì)之間S-腺苷高半胱氨酸的交換[18]。

5 其他線粒體載體和穿梭通道

5.1 乙?；┧笸ǖ?/h3>

乙酰輔酶A 是一種重要的中心碳代謝物，是線粒體TCA 循環(huán)的前體，同時(shí)也是各種合成代謝反應(yīng)的底物，對于細(xì)胞生長和能量代謝至關(guān)重要[72]。真核微生物以葡萄糖為碳源生長時(shí)，不需要線粒體膜載體轉(zhuǎn)運(yùn)乙酰輔酶A，因?yàn)橐阴］o酶A 直接由線粒體內(nèi)丙酮酸脫氫酶（PDH）催化丙酮酸合成。 然而，在醋酸鹽、乙醇和脂肪酸等其他碳源上生長時(shí)，就需要線粒體載體來運(yùn)輸乙?；?，因?yàn)樯傻囊阴］o酶A 來源于細(xì)胞質(zhì)或過氧化物酶體，而不是線粒體[73]。目前， 在S. cerevisiae中已經(jīng)確定了的乙酰基線粒體穿梭通道為肉堿穿梭通道：1）肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶將乙?；鶑囊阴］o酶A 轉(zhuǎn)移到肉堿， 產(chǎn)生乙酰肉堿；2）乙酰肉堿通過由基因YOR100cp編碼的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Crc1p 轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中；3）乙?；诰€粒體肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化下從乙酰肉堿中釋放出來[74-75]。 基因組注釋顯示S. cerevisiae具有3種肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，包括Cat2、Yat1 和Yat2。 其中，Cat2 定位于過氧化物酶體和線粒體[76]，而Yat1 定位于線粒體外膜[77]，Yat2 定位于細(xì)胞質(zhì)[78]。 另外，以葡萄糖為底物時(shí)乙酰輔酶A 需轉(zhuǎn)出線粒體，因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)諸多代謝反應(yīng)也需要乙酰輔酶A 的參與（如脂質(zhì)合成），所以有必要將線粒體乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。 其中，檸檬酸穿梭通道是線粒體乙酰輔酶A 外排至細(xì)胞質(zhì)的主要途徑：1）線粒體檸檬酸合酶催化乙酰輔酶A 與草酰乙酸縮合，生成線粒體檸檬酸；2）線粒體檸檬酸通過檸檬酸鹽載體Dic1p 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中；3）細(xì)胞質(zhì)檸檬酸被外源表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)檸檬酸裂解酶ACL 裂解為草酰乙酸和乙酰輔酶A，進(jìn)而參與細(xì)胞質(zhì)的其他反應(yīng)。 目前，已經(jīng)證實(shí)肉堿穿梭通道和檸檬酸穿梭通道都是S.cerevisiae中乙?；D(zhuǎn)運(yùn)的途徑[72]。

5.2 嘧啶核苷酸載體

在線粒體中，嘧啶核苷三磷酸（PyNTPs）是合成線粒體DNA 和各種類型的RNA 所必需的[79-80]。 然而，PyNTPs 兩種合成方式（即從頭合成和補(bǔ)救途徑合成）都發(fā)生在線粒體外[81]，因此必須將細(xì)胞質(zhì)PyNTPs 導(dǎo)入線粒體。 Rim2p 已被鑒定為S.cerevisiae中的嘧啶核苷酸線粒體載體，其通過交換線粒體嘧啶核苷單磷酸來轉(zhuǎn)運(yùn)PyNTPs[81]。 一般來說，Rim2p 的主要生理功能是輸入細(xì)胞質(zhì)PyNTPs用于線粒體DNA、RNA 合成， 同時(shí)輸出線粒體嘧啶（脫氧）核苷單磷酸[81]。

5.3 磷脂酸載體

Ups1 被鑒定為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將磷脂酸轉(zhuǎn)運(yùn)通過線粒體膜[82]。 磷脂酸的轉(zhuǎn)運(yùn)需要Ups1 與Mdm35（保證Ups1 不被降解）動(dòng)態(tài)組裝，并在線粒體內(nèi)膜中將磷脂酸轉(zhuǎn)化為心磷脂[82]。

除了上述線粒體載體和穿梭通道，還有其他一些已被報(bào)道的載體及通道， 如由基因YMR166c編碼的Mme1p 被發(fā)現(xiàn)能夠轉(zhuǎn)運(yùn)Mg2+， 敲除Mme1p 基因的突變體會導(dǎo)致線粒體中Mg2+水平升高[83]；基因YNL083w編碼的Sal1p 在Ca2+刺激下轉(zhuǎn)運(yùn)ADP、ATP 和Pi[84]；基因YJR077c和YER053c編碼的Mir1p 和Pic2p 被認(rèn)為是轉(zhuǎn)運(yùn)Pi 的線粒體載體[85-86]；基因YJL133w和YKR052c編碼的Mrs3p 和Mrs4p對線粒體中的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用[87]。

6 展 望

作者討論了MCs 和代謝物穿梭通道在線粒體與細(xì)胞質(zhì)和其他細(xì)胞器之間的代謝物交換，包括碳代謝物MCs、NAD（P）H 和NAD（P）+代謝物線粒體穿梭通道、輔因子MCs、氨基酸MCs 和其他一些已鑒定的其他線粒體載體和穿梭通道。 盡管在過去的20 年中已經(jīng)開展了大量工作來識別和表征微生物MCs，但仍有許多轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚不清晰。 此外，在早期研究中MCs 的一些特征性可能會被忽視，因此未來的工作應(yīng)側(cè)重于挖掘潛在的MCs 及其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，如氨基酸和谷胱甘肽線粒體輸入。 此外，研究MCs 的活性與生理功能之間的相關(guān)性可有助于設(shè)計(jì)新的代謝途徑，重塑細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)。 更重要的是，闡明跨細(xì)胞器膜代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制能夠加深對細(xì)胞內(nèi)代謝的理解，為MCs 設(shè)計(jì)應(yīng)用于微生物細(xì)胞工廠奠定基礎(chǔ)。