響應(yīng)面法優(yōu)化赤芝、紫芝子實(shí)體總?cè)铺崛」に?/h1>
2022-08-17 08:08:34李思雨崔馨戈祝朋玲袁抒捷
安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào) 2022年4期
李思雨，張 靜，崔馨戈，祝朋玲，袁抒捷，王 雯，周 俊，彭 燦，3，4,5,6
(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽黃山云樂靈芝有限公司，安徽 宣城 242600; 3. 中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；4. 安徽省中醫(yī)藥研究院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012;5. 藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012; 6.省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012)
靈芝作為中國(guó)珍貴的藥食同源類中藥材，是“十大皖藥”之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《中華人民共和國(guó)藥典》記載其為赤芝Ganodermalucidum(Leyss.exFr.) Karst.、紫芝GanodermasinenseZhao, Xu et Zhang的干燥子實(shí)體。中醫(yī)以陰陽五行學(xué)說將靈芝分為五芝，其中赤芝主治胸中結(jié)，可益心氣、補(bǔ)中，增慧智，令人不忘；紫芝主治耳聾，可利關(guān)節(jié)、保神、益精氣、堅(jiān)筋骨、養(yǎng)容顏?，F(xiàn)代研究表明，赤芝對(duì)心腦血管疾病[1-2]引起的心悸、心律不齊等效果較好，紫芝有調(diào)節(jié)免疫功能[3-5]、抑制細(xì)菌[6-7]、治療骨損傷[8]等作用。
靈芝所含有的化學(xué)成分多樣，其中三萜類化合物作為靈芝的主要活性成分之一，具有多種藥理作用[9-12]。既往研究[13]表明，赤芝與紫芝之間的三萜類成分存在差異，應(yīng)基于品種特點(diǎn)建立一種高效簡(jiǎn)便的靈芝三萜提取方法。目前，用于提取靈芝中三萜的方法有索氏回流提取、超臨界CO2提取、亞臨界水提取、超聲波提取等[14]，其中超聲波法在中草藥提取方面具有優(yōu)越性，不僅超聲時(shí)間短，還可加速靈芝中三萜成分的釋放，而且操作簡(jiǎn)便，溶劑消耗低。
基于此，本研究旨在優(yōu)化赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)瞥曁崛」に?，為系統(tǒng)研究赤芝、紫芝成分差異及后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
1 儀器與試劑
1.1 儀器 BT25S十萬分之一分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DF-101T集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵：河南省予華儀器有限公司；UV-1900型紫外-可見分光光度計(jì)：上海元析分析儀器有限公司； YL-060S型超聲波清洗機(jī)：山東省濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司。
1.2 試劑 赤芝、紫芝子實(shí)體(經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山副教授鑒定為多孔菌科赤芝Ganodermalucidum、紫芝Ganodermasinense子實(shí)體)：安徽省旌德縣安徽黃山云樂靈芝有限公司；無水甲醇(分析純)、無水乙醇(分析純)、冰醋酸(分析純)、香草醛(分析純)、乙酸乙酯(分析純)：上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；高氯酸(優(yōu)級(jí)純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；齊墩果酸對(duì)照品(色譜純，純度≥98%，批號(hào) CHB171229)：成都克洛瑪生物科技有限公司。
2 方法
2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及靈芝子實(shí)體總?cè)频奶崛?/p>
2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱定齊墩果酸對(duì)照品適量，加甲醇配制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于15 mL具塞試管中，揮干，冷卻，然后加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得)0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻后在70 ℃水浴中加熱15 min，迅速置冰浴中冷卻，5 min后取出，之后準(zhǔn)確加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法[《中華人民共和國(guó)藥典》(四部)通則0401]，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.1.2 靈芝總?cè)频寐蕼y(cè)定 將超聲提取后的提取液按照“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度，并通過回歸方程計(jì)算出總?cè)瀑|(zhì)量，根據(jù)得到的靈芝子實(shí)體總?cè)瀑|(zhì)量與原料質(zhì)量，計(jì)算靈芝子實(shí)體總?cè)频牡寐省?/p>
2.2 單因素實(shí)驗(yàn)
2.2.1 溶劑的選擇及溶劑容積分?jǐn)?shù)的選擇 準(zhǔn)確稱取赤芝、紫芝子實(shí)體粉末2.00 g，料液比為1∶20 g/mL、超聲時(shí)間為20 min、超聲溫度為50 ℃，用于提取靈芝，考察甲醇或乙醇溶劑以及溶劑容積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%條件下赤芝、紫芝總?cè)频寐省?/p>
2.2.2 料液比的選擇 準(zhǔn)確稱取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶劑及溶劑容積分?jǐn)?shù)由“2.2.1”項(xiàng)確定，超聲時(shí)間為20 min、超聲溫度為50 ℃，以靈芝子實(shí)體全部浸于甲醇中為起始值，即1∶20 g/mL，故考察料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL條件下赤芝、紫芝總?cè)频寐省?/p>
2.2.3 超聲時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶劑及溶劑容積分?jǐn)?shù)由“2.2.1”項(xiàng)確定，料液比由“2.2.2”項(xiàng)確定，超聲溫度為50 ℃，考察超聲時(shí)間為10、20、30、40、50 min條件下的赤芝、紫芝總?cè)频寐省?/p>
2.2.4 超聲溫度的選擇 準(zhǔn)確稱取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶劑及溶劑容積分?jǐn)?shù)由“2.2.1”項(xiàng)確定，料液比由“2.2.2”項(xiàng)確定，超聲時(shí)間由“2.2.3”項(xiàng)確定，考察超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃條件下赤芝、紫芝總?cè)频寐省?/p>
2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、料液比(C)3個(gè)因素對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?，設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。見表1。
表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平
3 結(jié)果
3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按照“2.1.1”項(xiàng)下方法得到齊墩果酸線性回歸方程：y=9.03x+0.042 2，R2=0.999 2。式中y為吸光值；x為齊墩果酸濃度。
3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果
3.2.1 溶劑及其容積分?jǐn)?shù)的選擇 本實(shí)驗(yàn)觀察了無水甲醇和無水乙醇對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊?。以甲醇為提取溶劑時(shí)，赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)频寐史謩e為1.12%、0.62%；以乙醇為提取溶劑時(shí)，赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)频寐史謩e為0.88%、0.46%。圖1顯示不同容積分?jǐn)?shù)的甲醇對(duì)赤芝、紫芝中總?cè)频寐实挠绊?，結(jié)果表明以100%甲醇為提取溶劑時(shí)，靈芝子實(shí)體中總?cè)频寐首罡摺?/p>
圖1 甲醇容積分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?/p>
3.2.2 料液比的選擇 在1∶20 g/mL至1∶40 g/mL料液比范圍內(nèi)，靈芝總?cè)频寐手饾u升高，在料液比為1∶40 g/mL時(shí)總?cè)频寐首罡?，之后得率反而隨著料液比的增加而降低。見圖2。此現(xiàn)象產(chǎn)生的原因：起初靈芝粉末和溶劑的接觸面積隨著液料比的增加而擴(kuò)大，更有利于總?cè)频奶崛?，但料液比超過1∶40 g/mL后，溶質(zhì)已經(jīng)達(dá)到溶解平衡，故提取率不再增加。因此，料液比選用1∶40 g/mL為宜。
圖2 料液比對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?/p>
3.2.3 超聲時(shí)間的選擇 由圖3可知，適當(dāng)延長(zhǎng)超聲時(shí)間能夠提高靈芝總?cè)频牡寐?，?dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)得率最大。但當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間時(shí)，得率卻呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此，超聲時(shí)間應(yīng)選在30 min為宜。
圖3 超聲時(shí)間對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?/p>
3.2.4 超聲溫度的選擇 由圖4可知，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)，靈芝子實(shí)體總?cè)频牡寐蔬_(dá)到峰值，進(jìn)一步升高超聲溫度，得率反而下降。因此，超聲溫度應(yīng)以50 ℃為最佳選擇。
圖4 超聲溫度對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?/p>
3.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
3.3.1 靈芝子實(shí)體響應(yīng)面結(jié)果及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)17個(gè)三因素、三水平的試驗(yàn)，分別得出赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)频牡寐?。見?。
表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
3.3.2 赤芝子實(shí)體中總?cè)铺崛」に嚨腂ox-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 以靈芝子實(shí)體總?cè)频寐蕿轫憫?yīng)值，將表2中赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)频寐蕯?shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，可得到赤芝子實(shí)體中總?cè)铺崛」に嚨幕貧w方程:Y=1.19+0.042 50A+0.005 9B-0.018 7C+0.005 5AB-0.023 4AC+0.002BC-0.074 2A2-0.082 8B2-0.033C2；紫芝子實(shí)體總?cè)铺崛」に嚨幕貧w方程：Y=0.909 25+0.033 1A+0.004 4B-0.016 2C+0.004AB+0.018 4AC-0.000 2BC-0.054 7A2-0.062 3B2-0.026 6C2，式中Y為總?cè)频寐?，A為超聲溫度，B為超聲時(shí)間，C為料液比。
表3 赤芝子實(shí)體總?cè)铺崛」に嚨腂ox-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果
表4 紫芝子實(shí)體總?cè)铺崛」に嚨腂ox-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果
3.3.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)圖形分析 依據(jù)響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design Expert 13軟件進(jìn)行回歸擬合分析，得到液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?，三維響應(yīng)面圖見圖5、圖6、圖7。
a.赤芝響應(yīng)面圖；b.紫芝響應(yīng)面圖圖5 溫度和時(shí)間的交互作用對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>
a.赤芝響應(yīng)面圖；b.紫芝響應(yīng)面圖圖6 溫度和料液比的交互作用對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>
a.赤芝響應(yīng)面圖；b.紫芝響應(yīng)面圖圖7 料液比和時(shí)間的交互作用對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>
從圖5可以看出，溫度與時(shí)間的交互作用接近正圓形，說明這兩者交互作用較小，對(duì)靈芝總?cè)频寐视绊懖淮?。而圖6、圖7中料液比與超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比的交互作用接近橢圓形，表明兩者的交互作用較大，對(duì)靈芝總?cè)频寐视绊戄^大，其中超聲溫度與料液比對(duì)靈芝總?cè)频寐实慕换プ饔镁哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這與表3、表4中方差分析的結(jié)果一致。
3.3.4 赤芝、紫芝子實(shí)體總?cè)谱罴压に嚄l件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)
利用Design-Expert 13軟件對(duì)赤芝、紫芝子實(shí)體總?cè)频腂ox-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得出赤芝子實(shí)體總?cè)频淖罴烟崛l件：料液比為1∶38.09 g/mL，超聲時(shí)間為30.416 min，超聲溫度為52.584 ℃，最佳條件下，總?cè)祁A(yù)測(cè)最高提取率為1.194%；得出紫芝子實(shí)體總?cè)频淖罴烟崛l件：料液比為1∶27.787 g/mL，超聲時(shí)間為30.444 min，超聲溫度為52.685 ℃。最佳條件下，總?cè)祁A(yù)測(cè)最高提取率為0.915%。為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，兼顧操作的便利性，將赤芝子實(shí)體總?cè)谱罴烟崛l件進(jìn)行修正：料液比為1∶38 g/mL，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為53 ℃；將紫芝子實(shí)體總?cè)谱罴烟崛l件修正為：料液比為1∶28 g/mL，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為53 ℃。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得赤芝子實(shí)體總?cè)频钠骄崛÷蕿?.202 3%，與預(yù)測(cè)值比較，其RSD值為1.13%；紫芝子實(shí)體總?cè)频钠骄崛÷蕿?.923 7%，與預(yù)測(cè)值比較，其RSD值為0.86%。結(jié)果表明，Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)選的赤芝、紫芝子實(shí)體提取工藝模型真實(shí)、可靠，適用于其子實(shí)體總?cè)频奶崛 ?/p>
4 討論
本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并采用Design-Expert 13軟件分析優(yōu)化赤芝、紫芝子實(shí)體總?cè)铺崛」に嚒５玫匠嘀プ訉?shí)體總?cè)谱罴烟崛l件：料液比為1∶38 g/mL，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為53 ℃；紫芝子實(shí)體總?cè)谱罴烟崛l件：料液比為1∶28 g/mL，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為53 ℃。兩個(gè)品種的預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間具有良好的相關(guān)性，說明此模型可靠，可運(yùn)用于超聲提取赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)频墓に囇芯俊?/p>
靈芝作為珍貴的藥食同源類中藥材，所含成分應(yīng)用廣泛，在醫(yī)藥、保健、化妝品及食品行業(yè)潛力較大，是天然的食用、藥用滋補(bǔ)良品。響應(yīng)面法可對(duì)單因素的作用以及因素之間的交互作用進(jìn)行回歸分析，能克服正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)只能剖析離散數(shù)據(jù)、預(yù)測(cè)性不高的弊端。本研究結(jié)果表明，在優(yōu)化的提取條件下，赤芝子實(shí)體中總?cè)铺崛〉寐瘦^紫芝子實(shí)體更高，本研究可為進(jìn)一步精確分析赤芝、紫芝中差異成分提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
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靈芝所含有的化學(xué)成分多樣，其中三萜類化合物作為靈芝的主要活性成分之一，具有多種藥理作用[9-12]。既往研究[13]表明，赤芝與紫芝之間的三萜類成分存在差異，應(yīng)基于品種特點(diǎn)建立一種高效簡(jiǎn)便的靈芝三萜提取方法。目前，用于提取靈芝中三萜的方法有索氏回流提取、超臨界CO2提取、亞臨界水提取、超聲波提取等[14]，其中超聲波法在中草藥提取方面具有優(yōu)越性，不僅超聲時(shí)間短，還可加速靈芝中三萜成分的釋放，而且操作簡(jiǎn)便，溶劑消耗低。
基于此，本研究旨在優(yōu)化赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)瞥曁崛」に?，為系統(tǒng)研究赤芝、紫芝成分差異及后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
1 儀器與試劑
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2 方法
2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及靈芝子實(shí)體總?cè)频奶崛?/p>
2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱定齊墩果酸對(duì)照品適量，加甲醇配制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于15 mL具塞試管中，揮干，冷卻，然后加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得)0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻后在70 ℃水浴中加熱15 min，迅速置冰浴中冷卻，5 min后取出，之后準(zhǔn)確加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法[《中華人民共和國(guó)藥典》(四部)通則0401]，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.1.2 靈芝總?cè)频寐蕼y(cè)定 將超聲提取后的提取液按照“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度，并通過回歸方程計(jì)算出總?cè)瀑|(zhì)量，根據(jù)得到的靈芝子實(shí)體總?cè)瀑|(zhì)量與原料質(zhì)量，計(jì)算靈芝子實(shí)體總?cè)频牡寐省?/p>
2.2 單因素實(shí)驗(yàn)
2.2.1 溶劑的選擇及溶劑容積分?jǐn)?shù)的選擇 準(zhǔn)確稱取赤芝、紫芝子實(shí)體粉末2.00 g，料液比為1∶20 g/mL、超聲時(shí)間為20 min、超聲溫度為50 ℃，用于提取靈芝，考察甲醇或乙醇溶劑以及溶劑容積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%條件下赤芝、紫芝總?cè)频寐省?/p>
2.2.2 料液比的選擇 準(zhǔn)確稱取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶劑及溶劑容積分?jǐn)?shù)由“2.2.1”項(xiàng)確定，超聲時(shí)間為20 min、超聲溫度為50 ℃，以靈芝子實(shí)體全部浸于甲醇中為起始值，即1∶20 g/mL，故考察料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL條件下赤芝、紫芝總?cè)频寐省?/p>
2.2.3 超聲時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶劑及溶劑容積分?jǐn)?shù)由“2.2.1”項(xiàng)確定，料液比由“2.2.2”項(xiàng)確定，超聲溫度為50 ℃，考察超聲時(shí)間為10、20、30、40、50 min條件下的赤芝、紫芝總?cè)频寐省?/p>
2.2.4 超聲溫度的選擇 準(zhǔn)確稱取赤芝、紫芝粉末2.00 g，溶劑及溶劑容積分?jǐn)?shù)由“2.2.1”項(xiàng)確定，料液比由“2.2.2”項(xiàng)確定，超聲時(shí)間由“2.2.3”項(xiàng)確定，考察超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃條件下赤芝、紫芝總?cè)频寐省?/p>
2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、料液比(C)3個(gè)因素對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?，設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。見表1。
表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平
3 結(jié)果
3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按照“2.1.1”項(xiàng)下方法得到齊墩果酸線性回歸方程：y=9.03x+0.042 2，R2=0.999 2。式中y為吸光值；x為齊墩果酸濃度。
3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果
3.2.1 溶劑及其容積分?jǐn)?shù)的選擇 本實(shí)驗(yàn)觀察了無水甲醇和無水乙醇對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊?。以甲醇為提取溶劑時(shí)，赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)频寐史謩e為1.12%、0.62%；以乙醇為提取溶劑時(shí)，赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)频寐史謩e為0.88%、0.46%。圖1顯示不同容積分?jǐn)?shù)的甲醇對(duì)赤芝、紫芝中總?cè)频寐实挠绊?，結(jié)果表明以100%甲醇為提取溶劑時(shí)，靈芝子實(shí)體中總?cè)频寐首罡摺?/p>
圖1 甲醇容積分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?/p>
3.2.2 料液比的選擇 在1∶20 g/mL至1∶40 g/mL料液比范圍內(nèi)，靈芝總?cè)频寐手饾u升高，在料液比為1∶40 g/mL時(shí)總?cè)频寐首罡?，之后得率反而隨著料液比的增加而降低。見圖2。此現(xiàn)象產(chǎn)生的原因：起初靈芝粉末和溶劑的接觸面積隨著液料比的增加而擴(kuò)大，更有利于總?cè)频奶崛?，但料液比超過1∶40 g/mL后，溶質(zhì)已經(jīng)達(dá)到溶解平衡，故提取率不再增加。因此，料液比選用1∶40 g/mL為宜。
圖2 料液比對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?/p>
3.2.3 超聲時(shí)間的選擇 由圖3可知，適當(dāng)延長(zhǎng)超聲時(shí)間能夠提高靈芝總?cè)频牡寐?，?dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)得率最大。但當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間時(shí)，得率卻呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此，超聲時(shí)間應(yīng)選在30 min為宜。
圖3 超聲時(shí)間對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?/p>
3.2.4 超聲溫度的選擇 由圖4可知，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)，靈芝子實(shí)體總?cè)频牡寐蔬_(dá)到峰值，進(jìn)一步升高超聲溫度，得率反而下降。因此，超聲溫度應(yīng)以50 ℃為最佳選擇。
圖4 超聲溫度對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?/p>
3.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
3.3.1 靈芝子實(shí)體響應(yīng)面結(jié)果及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)17個(gè)三因素、三水平的試驗(yàn)，分別得出赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)频牡寐?。見?。
表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
3.3.2 赤芝子實(shí)體中總?cè)铺崛」に嚨腂ox-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 以靈芝子實(shí)體總?cè)频寐蕿轫憫?yīng)值，將表2中赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)频寐蕯?shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，可得到赤芝子實(shí)體中總?cè)铺崛」に嚨幕貧w方程:Y=1.19+0.042 50A+0.005 9B-0.018 7C+0.005 5AB-0.023 4AC+0.002BC-0.074 2A2-0.082 8B2-0.033C2；紫芝子實(shí)體總?cè)铺崛」に嚨幕貧w方程：Y=0.909 25+0.033 1A+0.004 4B-0.016 2C+0.004AB+0.018 4AC-0.000 2BC-0.054 7A2-0.062 3B2-0.026 6C2，式中Y為總?cè)频寐?，A為超聲溫度，B為超聲時(shí)間，C為料液比。
表3 赤芝子實(shí)體總?cè)铺崛」に嚨腂ox-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果
表4 紫芝子實(shí)體總?cè)铺崛」に嚨腂ox-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果
3.3.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)圖形分析 依據(jù)響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design Expert 13軟件進(jìn)行回歸擬合分析，得到液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频寐实挠绊?，三維響應(yīng)面圖見圖5、圖6、圖7。
a.赤芝響應(yīng)面圖；b.紫芝響應(yīng)面圖圖5 溫度和時(shí)間的交互作用對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>
a.赤芝響應(yīng)面圖；b.紫芝響應(yīng)面圖圖6 溫度和料液比的交互作用對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>
a.赤芝響應(yīng)面圖；b.紫芝響應(yīng)面圖圖7 料液比和時(shí)間的交互作用對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>
從圖5可以看出，溫度與時(shí)間的交互作用接近正圓形，說明這兩者交互作用較小，對(duì)靈芝總?cè)频寐视绊懖淮?。而圖6、圖7中料液比與超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比的交互作用接近橢圓形，表明兩者的交互作用較大，對(duì)靈芝總?cè)频寐视绊戄^大，其中超聲溫度與料液比對(duì)靈芝總?cè)频寐实慕换プ饔镁哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這與表3、表4中方差分析的結(jié)果一致。
3.3.4 赤芝、紫芝子實(shí)體總?cè)谱罴压に嚄l件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)
利用Design-Expert 13軟件對(duì)赤芝、紫芝子實(shí)體總?cè)频腂ox-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得出赤芝子實(shí)體總?cè)频淖罴烟崛l件：料液比為1∶38.09 g/mL，超聲時(shí)間為30.416 min，超聲溫度為52.584 ℃，最佳條件下，總?cè)祁A(yù)測(cè)最高提取率為1.194%；得出紫芝子實(shí)體總?cè)频淖罴烟崛l件：料液比為1∶27.787 g/mL，超聲時(shí)間為30.444 min，超聲溫度為52.685 ℃。最佳條件下，總?cè)祁A(yù)測(cè)最高提取率為0.915%。為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，兼顧操作的便利性，將赤芝子實(shí)體總?cè)谱罴烟崛l件進(jìn)行修正：料液比為1∶38 g/mL，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為53 ℃；將紫芝子實(shí)體總?cè)谱罴烟崛l件修正為：料液比為1∶28 g/mL，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為53 ℃。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得赤芝子實(shí)體總?cè)频钠骄崛÷蕿?.202 3%，與預(yù)測(cè)值比較，其RSD值為1.13%；紫芝子實(shí)體總?cè)频钠骄崛÷蕿?.923 7%，與預(yù)測(cè)值比較，其RSD值為0.86%。結(jié)果表明，Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)選的赤芝、紫芝子實(shí)體提取工藝模型真實(shí)、可靠，適用于其子實(shí)體總?cè)频奶崛 ?/p>
4 討論
本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并采用Design-Expert 13軟件分析優(yōu)化赤芝、紫芝子實(shí)體總?cè)铺崛」に嚒５玫匠嘀プ訉?shí)體總?cè)谱罴烟崛l件：料液比為1∶38 g/mL，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為53 ℃；紫芝子實(shí)體總?cè)谱罴烟崛l件：料液比為1∶28 g/mL，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為53 ℃。兩個(gè)品種的預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間具有良好的相關(guān)性，說明此模型可靠，可運(yùn)用于超聲提取赤芝、紫芝子實(shí)體中總?cè)频墓に囇芯俊?/p>
靈芝作為珍貴的藥食同源類中藥材，所含成分應(yīng)用廣泛，在醫(yī)藥、保健、化妝品及食品行業(yè)潛力較大，是天然的食用、藥用滋補(bǔ)良品。響應(yīng)面法可對(duì)單因素的作用以及因素之間的交互作用進(jìn)行回歸分析，能克服正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)只能剖析離散數(shù)據(jù)、預(yù)測(cè)性不高的弊端。本研究結(jié)果表明，在優(yōu)化的提取條件下，赤芝子實(shí)體中總?cè)铺崛〉寐瘦^紫芝子實(shí)體更高，本研究可為進(jìn)一步精確分析赤芝、紫芝中差異成分提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
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