川芎嗪-噠嗪酮耦聯(lián)化合物的合成及其抗血小板聚集活性*

賈學(xué)敏，羅忠福，李毅，湯磊,2，楊元勇*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550004)

血栓可引起動脈粥樣硬化、冠心病以及缺血性腦卒中等心腦血管疾病，嚴(yán)重危害著人類健康[1-2]。血小板是血液中的重要組成成分，不僅在生理性止血中發(fā)揮重要作用，而且在動脈粥樣硬化斑塊破裂、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或外源性物質(zhì)(如心臟內(nèi)支架或手術(shù)過程中的異物)刺激時，都會由靜息轉(zhuǎn)為活化，再通過粘附、聚集形成血栓[3]。因此，通過抗血小板聚集能夠有效預(yù)防和治療血栓。川芎嗪的化學(xué)名稱為2,3,5,6-四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine,TMP)，是從傳統(tǒng)中草藥川芎中提取分離得到的有效活性單體，具有抗血小板聚集、抗阿爾茨海默病及抗缺血再灌注損傷等作用[4-6]，已被開發(fā)應(yīng)用于臨床，如TMP注射液、丹參TMP注射液等[7-8]。有研究表明，由于TMP具有藥代動力學(xué)不佳、半衰期短、代謝較快及藥理活性不強等缺點，研究者對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，以期發(fā)現(xiàn)活性更好的TMP衍生物[9-16]。研究表明，6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮類化合物在體外具有強效的抗血小板作用，如CI-914、CI-930等，通過對6-苯-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮化合物構(gòu)效關(guān)系分析不難發(fā)現(xiàn)，該類小分子的藥效基團為6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮，同時苯環(huán)上對位取代活性最好，但是這些化合物在體內(nèi)的活性較弱，選擇性較差，限制了其應(yīng)用[17-18]。因此，豐富該類化合物的結(jié)構(gòu)類型，尋找活性更佳、選擇性更好及副作用更低的抗血小板聚集化合物具有重要意義。本研究根據(jù)藥物化學(xué)中經(jīng)典的藥效團拼合原理以及生物電子等排原理，將TMP與6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮進(jìn)行耦聯(lián)，設(shè)計、合成3個TMP-噠嗪酮衍生物，并進(jìn)行體外抗血小板聚集活性研究，以期獲得活性更佳、副作用更低的抗血小板聚集候選化合物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 雄性新西蘭兔6只，體質(zhì)量1.5～2.5 kg，年齡90～120 d，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心[合格證號SYXK(黔)2018-0001]，動物于室溫(23±3)℃、相對濕度60%～80%條件下飼養(yǎng)1周后實驗。

1.1.2主要藥物、試劑及儀器 TMP和阿司匹林(aacetylsalicylic acid，ASA；上海皓鴻)，二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP；南京建成)，花生四烯酸(arachidonic acid,AA；北京索萊寶)，柱層析硅膠(青島海洋)，三甲基吡嗪、α-酮戊二酸、乙酰苯胺、丁二酸酐及3-(4-甲氧基苯甲酰基)丙酸(上海皓鴻)；98-Ⅱ-B磁力攪拌電熱套和冷凍機(長城科工)，EYELA N-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和SHE-Ⅲ循環(huán)真空水泵(上海亞榮)，Avance NEO-600或400型核磁共振光譜儀(瑞士Bruker)，UPLC-QTOF型高分辨質(zhì)譜分析儀(美國Waters)，半自動凝血分析儀(北京中勤世帝)。

1.2 合成方法

1.2.12-(溴甲基)-3,5,6-三甲基吡嗪的合成 取TMP 5 g溶于20 mL四氯化碳，加入N-溴代琥珀酰亞胺(N-Bromosuccinimide,NBS)6.54 g，催化量的過氧化二苯甲酰(benzoyl peroxide,BPO)，回流反應(yīng)12 h、抽濾、濾液減壓蒸除溶劑，硅膠層析柱分離純化(V石油醚∶V二氯甲烷=2∶1)，得黃色油狀物4.17 g，產(chǎn)率為53%，放置備用[19]。

1.2.24-(4-乙酰氨基苯基)-4-氧代丁酸(中間體2)的合成 取無水三氯化鋁27.37 g置于100 mL反應(yīng)瓶，室溫滴加N,N-二甲基乙酰胺(N,N-Dimethylacetamide,DMF)4.4 mL、待反應(yīng)，降至室溫時移入70 ℃油浴，滴加碾碎的乙酰苯胺2.70 g和丁二酸酐2.03 g的混合物，反應(yīng)2 h，加冰水180 mL，抽濾不溶性雜質(zhì)，收集濾液加濃鹽酸12 mL，4 ℃放置過夜，抽濾，收集濾餅，無水乙醇重結(jié)晶，獲得淺黃色固體(中間體2)1.70 g，產(chǎn)率為36%。

1.2.34-(4-氨基苯基)-4-氧代丁酸(中間體3)的合成 取中間體2500 mg，加6 mol/L鹽酸溶液5 mL，110 ℃反應(yīng)2 h，置于冰浴，無水碳酸鈉pH調(diào)節(jié)至4，米白色固體析出，抽濾收集濾餅，用蒸餾水反復(fù)沖洗濾餅，干燥，得米白色固體(中間體3)381 mg，產(chǎn)率為93%。

1.2.44-(4-氨基苯基)-4-氧代丁酸甲酯(中間體4)的合成 取中間體375 mg置于10 mL反應(yīng)瓶，加甲醇2 mL、濃硫酸1滴，回流反應(yīng)6 h，加飽和碳酸氫鈉至無氣泡產(chǎn)生后，使用乙酸乙酯萃取3次，無水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑，用乙酸乙酯和石油醚進(jìn)行重結(jié)晶，得淺黃色固體(中間體4)69 mg，產(chǎn)率為85%。

1.2.54-氧代-4-{4-[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基甲基)氨基]苯基}丁酸甲酯(中間體5)的合成 取中間體4208 mg、1.2.1項下黃色油狀物200 mg、K2CO3276 mg置于25 mL反應(yīng)瓶中，加丙酮10 mL，氮氣環(huán)境下回流反應(yīng)8 h，放冷，抽濾除去過量K2CO3，減壓蒸除溶劑，經(jīng)硅膠柱分離純化(V石油醚∶V乙酸乙酯=2∶1)，得黃色固體(中間體5)209 mg，產(chǎn)率為61%。

1.2.66-{4-[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基甲基)氨基]苯基}-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮的合成 取中間體5188 mg，溶于乙醇5 mL，加85%水合肼41 mg，回流反應(yīng)5 h，放冷，抽濾，濾餅充分干燥，乙醇重結(jié)晶，得白色固體(目標(biāo)化合物a)166 mg，產(chǎn)率為93%。

1.2.74-(4-羥基苯基)-4-氧代丁酸(中間體7)的合成 取3-(4-甲氧基苯甲?；?丙酸2 g置于50 mL反應(yīng)瓶，加冰醋酸18 mL、40%氫溴酸溶液8 mL，130 ℃反應(yīng)24 h，加適量水，乙酸乙酯萃取，無水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑，乙酸乙酯和石油醚重結(jié)晶，得灰色固體(中間體7)1.40 g，產(chǎn)率為75%。

1.2.84-(4-羥基基苯基)-4-氧代丁酸甲酯(中間體8)的合成 取中間體71.00 g，溶于甲醇20 mL，滴濃硫酸3滴，回流反應(yīng)5 h，加飽和碳酸氫鈉至無氣泡產(chǎn)生，乙酸乙酯萃取，無水Na2SO4干燥，減壓除去溶劑乙酸乙酯和石油醚重結(jié)晶，得到白色固體(中間體8)0.92 g，產(chǎn)率為88%。

1.2.94-氧代-4-[4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲氧基)苯基]丁酸甲酯(中間體9)的合成 取中間體8486 mg、2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(1.2.1項下黃色油狀物)500 mg及K2CO3645 mg置于50 mL反應(yīng)瓶，加丙酮25 mL，氮氣環(huán)境下回流反應(yīng)5 h，放冷，抽濾除去不溶物，減壓蒸溶劑，經(jīng)硅膠柱純化(V石油醚∶V乙酸乙酯=2∶1)，得白色固體(中間體9)480 mg，產(chǎn)率為59.9%。

1.2.106-[4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲氧基)苯基]-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮的合成 取中間體9191 mg，溶于乙醇10 mL，加85%水合肼48 mg，回流反應(yīng)5 h，反應(yīng)完成后，放冷，抽濾，濾餅充分干燥，使用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，得白色固體(目標(biāo)化合物b)178 mg，產(chǎn)率為94.7%。

1.2.114-氧代-4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)丁酸(中間體12)的合成 取三甲基吡嗪1 g，溶于乙腈50 mL，加過硫酸銨9 g和AgNO30.2 g，氮氣下加乙腈12 mL、水60 mL及α-酮戊二酸 3.6 g，65 ℃攪拌5 h，放冷，加水50 mL，乙酸乙酯萃取，無水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑，層析柱純化后(V二氯甲烷∶V甲醇=20∶1)，得淡黃色固體(中間體12)1.6 g，產(chǎn)率為87.9%。

1.2.126-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮的合成 取中間體12200 mg，溶于乙醇10 mL，加85%水合肼64 mg，回流反應(yīng)4 h，放冷，抽濾收集濾餅，濾餅充分干燥，乙醇打漿，得白色固體(目標(biāo)化合物c)180 mg，產(chǎn)率為91.7%。

1.2.13體外抗血小板聚集活性檢測 體外的抗血小板聚集活性評價采用born比濁法進(jìn)行測試[20]。家兔心臟取血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝(V血液∶V抗凝劑=9∶1)，1 200 r/min離心15 min，取上清得富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)；剩余血漿3 000 r/min離心10 min，取上清得貧血小板血漿(platelet-poor plasma,PPP)。采用半自動凝血分析儀進(jìn)行測試，取PRP 189 μL于測試杯，分別加目標(biāo)化合物或陽性藥ASA 1 μL于37 ℃下孵育3 min，使用10 μmol/L ADP 10 μL或0.5 mmol/L AA 10 μL為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)PRP中血小板聚集，記錄5 min以內(nèi)的最大聚集率，重復(fù)7次取均值，根據(jù)公式計算出目標(biāo)化合物的抗血小板聚集率(aggregation inhibition rate,AIR)[20]，并計算半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration,IC50)。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)表征

2.1.1中間體2系4-(4-乙酰氨基苯基)-4-氧代丁酸，熔點為202～204 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 12.11(s,1H)，10.27(s,1H)，7.94(d,J=8.8 Hz,2H)，7.72(d,J=8.7 Hz,2H)，3.21～3.16(m,2H),2.58～2.54(m,2H)，2.09(s,3H)；HRMS(ESI)C12H14N3O4[M-H]-的理論值和實際值分別為234.076 6和234.076 4。

2.1.2中間體3系4-(4-氨基苯基)-4-氧代丁酸，熔點為180～182 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 12.03(s,1H)，7.69(d,J=8.7 Hz,2H)，6.57(d,J=8.7 Hz,2H)，6.03(s,2H)，3.06(t,J=6.4 Hz,2H)，2.51(t,J=4.3 Hz,2H)；HRMS(ESI)C10H10NO3[M-H]-的理論值和實際值分別為192.066 1和192.066 0。

2.1.3中間體4系4-(4-氨基苯基)-4-氧代丁酸甲酯，熔點為163～165 ℃；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ: 7.69(d,J=8.7 Hz,2H)，6.56(d,J=8.7 Hz,2H)，6.08(s,2H)，3.58(s,3H)，3.18～2.99(m,2H)，2.64～2.53(m,2H)；HRMS(ESI)C11H14NO3[M+H]+的理論值和實際分別為208.097 4和208.096 7。

2.1.4中間體5系4-氧代-4-{4-[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基甲基)氨基]苯基}丁酸甲酯，熔點為93～95 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 7.73(d,J=8.7 Hz,2H)，7.00(t,J=5.2 Hz,1H),6.73(d,J=8.8 Hz,2H)，4.40(d,J=5.2 Hz,2H)，3.57(s,3H)，3.12(t,J=6.3 Hz,2H)，2.58(t,J=6.3 Hz,2H)，2.47(s,3H)，2.44(s,3H)，2.42(s,3H)；HRMS(ESI)C19H24N3O3[M+H]+的理論值和實際值分別為342.181 8和342.181 9。

2.1.5目標(biāo)化合物a系6-{4-[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基甲基)氨基]苯基}-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮；熔點為199～200 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 10.65(s,1H)，7.51(d,J=8.8 Hz,2H)，6.72(d,J=8.8 Hz,2H)，6.46(s,1H)，4.35(s,2H)，2.83(t,J=8.2 Hz,2H)，2.48(s,3H)，2.45(s,3H)，2.42(s,3H)，2.39～2.34(m,2H)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ: 167.43，150.33，150.00，149.68，148.67，148.06，147.84，127.27，123.95，112.31，46.37，26.70，22.09，21.50，20.65；HRMS(ESI)C18H22N5O[M+H]+的理論值和實際值分別為324.183 1和324.182 4。

2.1.6中間體7系4-(4-羥基苯基)-4-氧代丁酸，熔點為157～159 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 12.00(s,1H)，10.37(s,1H)，7.85(d,J=8.8 Hz,2H)，6.85(d,J=8.7 Hz,2H)，3.17～3.12(m,2H),2.56～2.51(m,2H)；HRMS(ESI)C10H9O4[M-H]-的理論值和實際值分別為193.050 1和193.050 5。

2.1.7中間體8系4-(4-羥基苯基)-4-氧代丁酸甲酯，熔點為169～170 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 10.36(s,1H)，7.85(d,J=8.8 Hz,2H)，6.85(d,J=8.7 Hz,2H)，3.58(s,3H)，3.25～3.13(m,2H)，2.67～2.56(m,2H)；HRMS(ESI)C11H13O4[M+H]+的理論值和實際值分別為209.081 4和209.081 3。

2.1.8中間體9系4-氧代-4-[4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲氧基)苯基]丁酸甲酯，熔點為104～106 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 7.96(d,J=8.9 Hz,2H)，7.14(d,J=8.9 Hz,2H)，5.26(s,2H)，3.59(s,3H)，3.27～3.22(m,2H)，2.65～2.61(m,2H)，2.49(s,3H)，2.45(s,3H)，2.44(s,3H)；HRMS(ESI)C19H23N2O4[M+H]+的理論值和實際值分別為343.165 8和343.165 9。

2.1.9目標(biāo)化合物b系6-[4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲氧基)苯基]-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮，熔點為209～211 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 10.82(s,1H),7.69(d,J=8.8 Hz,2H)，7.07(d,J=8.9 Hz,2H)，5.19(s,2H)，2.90(t,J=8.2 Hz,2H)，2.48(s,3H)，2.45(s,3H)，2.44(s,3H)，2.41(t,J=8.2 Hz,2H)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ: 167.39，159.70，151.50，149.77，149.58，148.76，145.67，129.34，127.64，115.15，69.84，26.51，22.29，21.72，21.43，20.62；HRMS(ESI)C18H21N2O4[M+H]+的理論值和實際值分別為325.166 5和325.166 6。

2.1.10中間體12系4-氧代-4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)丁酸，熔點為159～161 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 12.14(s,1H)，3.33(t,J=6.5 Hz,2H)，2.60(s,3H)，2.57(t,J=6.5 Hz,2H)，2.52(s,6H)；HRMS(ESI)C11H13N2O3[M-H]-的理論值和實際值分別為221.092 6和221.093 1。

2.1.11目標(biāo)化合物c系6-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮，熔點為240～243 ℃；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ: 3.15～3.09(m,2H)，2.66(s,3H)，2.58～2.52(m,2H)，2.50(s,6H)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ: 168.92，150.46，148.74，148.55，144.59，140.86，25.88，22.40，22.25，20.09，19.98；HRMS(ESI)C11H15N4O2[M+H]+的理論值和實際值分別為219.124 6和219.124 7。

2.2 抗血小板聚集活性

目標(biāo)化合物a、b及c對ADP和AA所誘導(dǎo)的血小板聚集均有較好的抑制作用，其中化合物c的活性最佳，在ADP和AA誘導(dǎo)下的抗血小板聚集IC50分別為132.2 μmol/L和118.8 μmol/L，在2種誘導(dǎo)劑作用下，目標(biāo)化合物的抗血小板聚集活性順序一致：c>a>b，優(yōu)于先導(dǎo)化合物TMP和臨床常用藥物ASA。見表1。

表1 化合物a、b及c的體外抗血小板聚集活性

3 討論

由于血小板不僅在血栓形成中扮演重要角色，在生理性止血中同樣具有重要作用，因此血小板作為血栓交聯(lián)的中心，常常成為抗血栓藥物的“明星靶點”。但遺憾的是目前臨床所應(yīng)用的抗血小板聚集藥物或多或少的存在出血時間延長的副作用[21]。因此，如何平衡出血和凝血之間的平衡或?qū)ふ页鲅弊饔眯〉目寡“寰奂幬镆恢倍际茄芯康臒狳c，迫切需要發(fā)現(xiàn)新型的抗血小板聚集的化合物。

藥物化學(xué)中的藥效團拼合原理和生物電子等排原理是藥物開發(fā)的經(jīng)典策略之一，常?？傻玫剿幮f(xié)同或藥效增加的目標(biāo)化合物[22-25]。TMP作為傳統(tǒng)中藥提取出的有效單體，以各種形式的制劑或復(fù)方應(yīng)用于臨床，TMP具有一定的抗血小板聚集活性，但其活性較弱[19]；TMP的分子結(jié)構(gòu)簡單，可修飾空間較小，所以其結(jié)構(gòu)修飾多與其他活性小分子化合物進(jìn)行耦聯(lián)[12-14]。小分子6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮已經(jīng)被證明具有較好的抗血小板聚集作用，但副作用較多[17]，同樣有待進(jìn)一步研究。因此，本研究通過3條合成路線，以TMP為原料，經(jīng)溴代得到關(guān)鍵中間體2-(溴甲基)-3,5,6-三甲基吡嗪；然后以乙酰苯胺為原料，分別經(jīng)傅-克反應(yīng)、脫乙?；?、與水合肼環(huán)合，最后與2-(溴甲基)-3,5,6-三甲基吡嗪發(fā)生取代反應(yīng)得到目標(biāo)化合物a；以3-(4-甲氧基苯甲?；?丙酸為原料，分別經(jīng)脫甲基、與水合肼環(huán)合，再與2-(溴甲基)-3,5,6-三甲基吡嗪發(fā)生取代反應(yīng)得目標(biāo)化合物b；以三甲基吡嗪和α-酮戊二酸為原料，分別經(jīng)Minisci反應(yīng)和水合肼環(huán)合得到目標(biāo)化合物c。這3條路線合成路線中的原料廉價易得，合成過程中操作簡單方便，以高產(chǎn)率得到目標(biāo)化合物a～c，目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)HRMS、1H NMR、13C NMR表征，且經(jīng)Scifinder檢索均為新化合物。

ADP和AA是血小板聚集的常用誘導(dǎo)劑，涉及到不同的機制通路，ASA通過抑制環(huán)氧化酶-1(cyclooxygenase-1,COX-1)使AA代謝為前列腺素G2受阻，使血栓烷A2(thromboxane,TXA2)的生成減少從而發(fā)揮抑制血小板聚集的作用[26]。而血小板二磷酸腺苷受體亞基12(platelet adenosine diphosphate receptor subunit 12,P2Y12)是ADP的受體，ADP與P2Y12受體結(jié)合后，可使血小板激活，從而形成血栓[27]。因此，作用于這兩種通路的任一通路都可以影響血小板的聚集。Born比濁法廣泛用于抗血小板聚集活性研究，其原理是在正常情況下、低轉(zhuǎn)速下收集的富血小板血漿為米黃色的渾濁液體，加入誘導(dǎo)劑后，血漿中的血小板被激活，血小板發(fā)生聚集，血漿的透光度增加，通過透光度的變化反應(yīng)血小板的聚集情況，該法具有操作簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點[28-30]。因此，本研究以ADP和AA為誘導(dǎo)劑，采用Born比濁法進(jìn)行目標(biāo)化合物的抗血小板聚集活性測試，結(jié)果顯示，與ASA不同，化合物a～c不僅能夠發(fā)揮抗AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用，對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集同樣具有較好的抑制效果，提示該類化合物可以通過多重作用機制發(fā)揮抗血小板聚集活性。

綜上所述，在保留TMP活性母核的條件下，通過O、N橋與6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮進(jìn)行耦聯(lián)，得到化合物a和b；另外，根據(jù)生物電子等排原理將6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮的苯基替換為TMP環(huán)，合成了化合物c，并對目標(biāo)化合物進(jìn)行體外的抗家兔的血小板聚集活性測試。如預(yù)期的那樣，目標(biāo)化合物在AA和ADP誘導(dǎo)下的抗血小板聚集活性優(yōu)于先導(dǎo)化合物TMP和ASA，具有進(jìn)一步研究的價值。此研究為后續(xù)抗血小板聚集化合物的研究提供了實驗依據(jù)和理論參考。