蜈蚣敗毒飲對銀屑病模型鼠外周血中濾泡輔助性T細胞及其主導通路影響的機制研究

任宇坤，張 瓊，張 晴，林 麗，楊素清，安月鵬*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040）

課題組在既往對于T淋巴細胞亞群研究的基礎之上[1]，對濾泡輔助性T細胞（follicular helper T cell，Tfh）與其他T淋巴細胞亞群的交叉因子、B細胞淋巴因子（B cell lymphoma，Bcl）及信號傳導及轉錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）進行了研究并提示中藥干預該通路及其靶點的可行性[2-3]，通過進一步系統(tǒng)總結Tfh細胞的整體通路。本次實驗擬在外周血的水平上，分析Tfh細胞的表達水平，同時對其上游刺激因子 IL-6（interleukin-6，IL-6）、IL-21，轉錄因子Bcl-6、STAT3，下游分泌因子趨化因子受體5（chemokine receptor 5，CXCR5）、可誘導共刺激分子（inducible co-stimulator，ICOS）、程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）、血細胞簇分化抗原40 L（cluster of differentiation 40L，CD40L）進行鏈鎖式研究，同時分析基于中醫(yī)“毒”“瘀”理論的中藥復方制劑蜈蚣敗毒飲的干預機制，為中醫(yī)藥的現代化研究及臨床治療銀屑病提供支持和佐證。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級C57BL/6小鼠30只，其中雌性小鼠15只、雄性小鼠15只，體質量在15～24 g之間，鼠齡在4～7周之間，所有小鼠均來源于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號為SCXK（滬）2017-0005。小鼠經常規(guī)單籠適應性飼養(yǎng)（溫度在20～25 ℃之間，濕度在40%～65%之間，安靜通風）3 d，自由飲水及采食。

1.2 主要試劑

紅細胞裂解液（大連美侖生物技術有限公司，MA0207）；PBS（北京索萊寶科技有限公司，P1022）；Anti-CD4（ 美 國 Biolegend公 司，100510）；Anti-CXCR5（ 美 國 Biolegend公 司，129804）；IL-6試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml002293）；IL-21試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml037878）；Bcl-6試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml028016）；STAT3試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml900517）；CXCR5試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml11179）；ICOS試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml600140）；PD-1試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml628616）；CD40L試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml202193）；甲氨蝶呤片（上海上藥信宜藥廠有限公司，210512）；咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限責任公司，210715）；0.9%氯化鈉注射液（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，21051023）；蜈蚣敗毒飲中藥組分（黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院門診中草藥局）。

1.3 主要儀器

流式細胞儀（美國Agilent公司，NovoCyte 3110）；低溫離心機（美國Thermo Fisher公司，SORVALL ST8/8R）；呼吸麻醉機（上海玉研科學儀器公司，Y1001410002）；電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，ME104E）；振蕩器（美國 Scientific Industries公司，Genie2）。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠分組 30只C57BL/6小鼠隨機分為6組，分別為生理鹽水空白對照組（空白組）、生理鹽水模型對照組（模型組）、甲氨蝶呤西藥對照組（西藥組）、蜈蚣敗毒飲中藥低劑量組（低劑量組）、蜈蚣敗毒飲中藥中劑量組（中劑量組）、蜈蚣敗毒飲中藥高劑量組（高劑量組），每組5只。

1.4.2 小鼠建模 采用外用咪喹莫特誘導建模的方法進行銀屑病模型鼠的建立。具體方法為對除空白組外的其余25只小鼠進行背部皮膚的備皮，備皮區(qū)域選擇背部3 cm×3 cm的光滑平整區(qū)域，盡可能保證每只小鼠的備皮區(qū)面積相同。每日以5%的咪喹莫特乳膏62.5 mg進行局部涂擦1次，且于涂擦前剃除備皮區(qū)前日新生毛發(fā)，以相同的方法建模8 d。第9天時建模完成，觀察此時小鼠的銀屑病皮損指數并進行記錄，再進行后續(xù)的灌胃處理。

1.4.3 藥液灌胃 低劑量組、中劑量組、高劑量組藥液配制時分別取蜈蚣敗毒飲組分蜈蚣3 g，烏梢蛇20 g，紫草30 g，土茯苓30 g，鬼箭羽30 g，甘草10 g，按常規(guī)方法煎煮2次，經人與小鼠的單位體表面積等藥量換算法，將其調配成濃度為0.08 g·mL-1、0.16 g·mL-1、0.32 g·mL-1的溶液，分別相當于人口服蜈蚣敗毒飲藥量的0.5倍、1倍、2倍。西藥組的藥液配制時取甲氨蝶呤片以相同的方法調配成濃度為0.003 mg·mL-1的混懸液，相當于人口服甲氨蝶呤片藥量的1倍?？瞻捉M、模型組的灌胃藥液則直接選擇0.9%氯化鈉注射液。

在第9天建模完成時即進行灌胃，除西藥組外的其余5組均以對應的藥液進行灌胃，灌胃劑量為每次1 mL·200 g-1，頻次為每日2次，均在小鼠早晚進食后的30 min進行，共灌胃8 d。西藥組亦在建模完成時進行灌胃8 d，前4 d選擇甲氨蝶呤混懸液，后4 d選擇0.9%氯化鈉注射液，其灌胃的劑量、頻次、方法同其余各組，因此種灌胃方法與臨床銀屑病患者口服甲氨蝶呤片治療銀屑病的方法相一致，以保證實驗研究結果更加貼近于臨床[4]。

1.4.4 皮損指數評價 采用課題組改良的鼠銀屑病皮損面積和嚴重程度指數（MPASI）評分法對各小鼠的皮損指數進行量化評分。MPASI評分法較之PASI評分法，一方面增加了鼠特有的尾部結構，另一方面重新定義了鼠的各部位體表組織占總體表面積的百分比，依次為頭部20%、上肢10%、軀干50%、下肢10%、尾部10%[5]。

因本實驗銀屑病鼠的皮損均存在于背部（軀干部），其余體表部位無誘導出現的皮損，因此在計算MPASI分值時單純計算軀干部的分值即可。根據皮損嚴重程度情況，對紅斑、浸潤、鱗屑三個指標進行由輕至重的0～4分量化評分；根據皮損所占軀干部整體皮膚的面積情況，對皮損面積比例進行0～6分量化評分；MPASI=MPASI軀干=0.5×（紅斑分值+浸潤分值+鱗屑分值）×皮損面積比例分值，并計算出灌胃前后MPASI分值的變化量（△MPASI），△MPASI= MPASI灌胃前－MPASI灌胃后。

1.4.5 含藥血清制備 在灌胃結束并進行皮損指數評價后，采用呼吸麻醉的方法對各小鼠進行麻醉，在無菌的環(huán)境下取腹主動脈血8 mL，經混勻和離心后制備成含藥的外周血單個核細胞，取部分血液于2 h內進行流式細胞學檢測，其余血液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6 流式細胞法檢測 血液經離心后去上清，應用無菌去離子水稀釋紅細胞裂解液，裂解2 min，再次離心去上清，經洗滌1～2次后使用500 μL的PBS溶液，重懸沉淀。按照1:200的比例加入稀釋后的Anti-CD4、Anti-CXCR5，避光4℃孵育30 min，染色后的細胞經離心5 min，去上清，加入500 μL的PBS溶液，重懸沉淀。選擇FITC、PE、APC、PE/Cyanine7通道，上機40 000個細胞，進行流式細胞檢測分析，以CD4+CXCR5+標記的細胞表示外周血中Tfh細胞的表達量。

1.4.7 ELISA法檢測 血液樣本經離心收集上清，設置標準品孔和樣本孔，除空白組外依次經加樣、加酶、溫育、洗滌、顯色等步驟，最后終止反應（藍色立轉為黃色），在15 min內以450 nm波長依序測量各孔的吸光度，通過軟件描繪標準曲線，并計算出各孔的濃度值。

1.4.8 相關性分析 除空白組外，整體分析其余5組共25只銀屑病模型鼠灌胃前后皮損指數的變化量（△MPASI）與灌胃治療后Tfh細胞表達量、Tfh細胞主導通路中的刺激因子（IL-6、IL-21）、轉錄因子（Bcl-6、STAT3）、分泌因子（CXCR5、ICOS、PD-1、CD40L）之間的相關性，從而分析經不同的藥物干預后，銀屑病小鼠皮損的改善與Tfh細胞及其主導通路之間的關聯(lián)。分別求得回歸方程，描繪回歸曲線，計算相關系數（γ），并分析統(tǒng)計學意義。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件，所有數據均滿足正態(tài)分布，計量資料采用均數±標準差（±s）的形式表示，計數資料采用頻數或百分數的形式表示，計量資料采用配對或獨立樣本的t檢驗，相關性比較采用Pearson相關。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，以P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組皮損指數（MPASI）比較

見表1。

表1 各組皮損指數（MPASI）比較（±s，n = 5） 分

表1 各組皮損指數（MPASI）比較（±s，n = 5） 分

注：與模型組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.05

組別 灌胃前MPASI 灌胃后MPASI △MPASI空白組 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 10.20±1.13 9.80±1.02 0.40±0.02西藥組 11.00±1.82 2.20±0.47## 8.20±2.32##低劑量組 10.60±2.01 7.80±3.08#△ 2.40±0.59#△中劑量組 9.60±1.76 5.60±1.59##△ 3.60±1.01##△高劑量組 10.40±1.85 2.40±0.55## 7.80±1.87##

2.2 各組外周血中Tfh細胞表達量比較

見表2。組別 Tfh細胞數/個 Tfh細胞比例/%

表2 各組外周血中Tfh細胞表達量比較（±s，n= 5）

表2 各組外周血中Tfh細胞表達量比較（±s，n= 5）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.05

空白組 647.33±263.23 0.14±0.03模型組 2 773.00±350.66## 0.42±0.15西藥組 1 200.67±259.39##△△ 0.20±0.02低劑量組 1 981.00±307.36##△△▲ 0.32±0.13中劑量組 1 768.33±201.16##△△▲ 0.22±0.02高劑量組 1 242.00±146.50##△△ 0.19±0.05

2.3 各組血清中Tfh細胞通路各因子含量比較

見表3、表4。

表3 各組Tfh細胞通路中刺激因子IL-6、IL-21及轉錄因子Bcl-6、STAT3含量比較（±s，n= 5）

表3 各組Tfh細胞通路中刺激因子IL-6、IL-21及轉錄因子Bcl-6、STAT3含量比較（±s，n= 5）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.05

組別 IL-6/（pg·mL-1） IL-21/（pg·mL-1） Bcl-6/（ng·mL-1） STAT3/（ng·mL-1）空白組 97.33±8.75 268.08±15.56 22.58±3.59 105.26±5.85模型組 163.75±37.79## 367.77±36.80## 47.73±9.36## 188.68±19.21##西藥組 119.76±15.28#△△ 308.41±22.67##△△ 30.61±5.24#△△ 120.03±8.20##△△低劑量組 140.03±22.61##△▲ 340.05±25.52##△▲ 45.50±10.21##▲ 161.22±17.74##△▲中劑量組 131.18±16.56##△▲ 334.69±29.77##△▲ 39.29±6.63##△▲ 158.81±18.29##△▲高劑量組 122.31±10.20#△△ 315.50±30.38##△△ 28.34±5.60#△△ 117.73±10.10##△△

表4 各組Tfh細胞通路中分泌因子CXCR5、ICOS、PD-1、CD40L含量比較（±s，n= 5）

表4 各組Tfh細胞通路中分泌因子CXCR5、ICOS、PD-1、CD40L含量比較（±s，n= 5）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.05

組別 CXCR5/（pg·mL-1） ICOS/（ng·mL-1） PD-1/（pg·mL-1） CD40L/（ng·mL-1）空白組 4.46±1.61 5.58±0.25 14.20±2.14 7.80±0.50模型組 15.42±2.05## 9.59±0.43# 2.59±0.31## 13.02±2.76#西藥組 5.95±1.48△△ 6.42±0.39△ 10.05±1.38#△△ 8.52±0.77△△低劑量組 11.57±2.23##△▲ 8.85±0.57#▲ 5.61±2.22##△△▲ 8.59±0.51△△中劑量組 7.15±1.89#△△ 8.28±0.50#▲ 5.35±1.97##△△▲ 8.54±0.80△△高劑量組 5.60±0.90△△ 6.11±0.72△ 9.64±2.00#△△ 8.25±0.57△△

2.4 皮損指數變化量（△MPASI）與Tfh細胞及其主導通路的相關性分析

見表5、圖1-9。

表5 皮損指數變化量（△MPASI）與Tfh細胞及其主導通路的相關性分析（n= 5）

圖1 △MPASI與Tfh回歸曲線

圖2 △MPASI與IL-6回歸曲線

圖3 △MPASI與IL-21回歸曲線

圖4 △MPASI與Bcl-6回歸曲線

圖5 △MPASI與STAT3回歸曲線

圖6 △MPASI與CXCR5回歸曲線

圖7 △MPASI與ICOS回歸曲線

圖8 △MPASI與PD-1回歸曲線

圖9 △MPASI與CD40L回歸曲線

3 討論

基于對Tfh細胞復雜免疫學通路的認識，課題組以體現“毒”“瘀”致病理論的中藥制劑蜈蚣敗毒飲為干預藥物，研究其針對于Tfh細胞及其主導通路的相關靶點，從中醫(yī)的毒邪致病到銀屑病皮損的瘀滯所成，有機的結合西醫(yī)學Tfh通路的細胞因子紊亂到紅斑鱗屑的病理狀態(tài)，將中西醫(yī)二者從病因、病機、臨床表現等方面進行合理的整合。蜈蚣敗毒飲是課題組多年來致力于銀屑病治療研究的經驗方劑，其由蜈蚣、烏梢蛇、紫草、土茯苓、鬼箭羽、甘草組成，以蜈蚣、烏梢蛇為君，紫草、土茯苓、鬼箭羽為臣，甘草為佐使，在發(fā)揮蟲類藥物以毒攻毒、熄風散毒、走竄通路的“解毒”“化瘀”作用的同時，與臣藥相互配合，發(fā)揮清熱毒、除濕毒、化瘀毒的“祛毒”作用，以及活血瘀、除痹瘀、逐滯瘀的“祛瘀”功效，加之甘草的解百毒、和諸藥之品，六藥配伍，充分體現出中醫(yī)學“毒”“瘀”理論在銀屑病辨治中的特色和獨到之處。

本次研究結果可以看出，在作用療效方面，蜈蚣敗毒飲各劑量組均能夠降低銀屑病模型鼠的皮損指數，其程度依次為高劑量組＞中劑量組＞低劑量組，且高劑量組的作用療效與甲氨蝶呤相似。在影響Tfh細胞方面，建模后的銀屑病小鼠表現出外周血中Tfh細胞數的顯著升高，模型組Tfh細胞比例為空白組均數的3倍左右，藥物干預后的外周血中Tfh細胞數均有不同程度的降低，干預程度依次為西藥組≈高劑量組＞中劑量組＞低劑量組。在對Tfh細胞通路的檢測方面，銀屑病小鼠的Tfh細胞通路因子均呈現出異常表達，以刺激、轉錄因子高表達，CXCR5、ICOS、CD40L的分泌因子高表達，及PD-1的分泌因子低表達為主要變化趨勢。在經藥物的干預后，高劑量組和西藥組均能夠顯著影響Tfh細胞通路的各關鍵因子，調控其恢復平衡狀態(tài)，尤其對于CD40L的干預作用，不同濃度的蜈蚣敗毒飲均表現出相似的調控功效，體現出藥物干預的敏感性，對PD-1的干預呈現出上調趨勢，這與文獻[6]所述的PD-1具有反向抑制T細胞活化和增殖作用，PD-1的不足是銀屑病發(fā)病的內在重要因素的闡述相互吻合。在相關性的研究方面，經過整體分析小鼠皮損指數的變化與藥物干預后Tfh細胞及其通路中各因子表達量的相關程度，結果發(fā)現，皮損的緩解與Tfh細胞及其通路因子間均具有較為密切的關系，除與PD-1呈正相關外（皮損緩解程度越大，PD-1越高表達），△MPASI與Tfh、IL-6、IL-21、Bcl-6、STAT3、CXCR5、ICOS、CD40L均呈現負相關（皮損緩解程度越大，各細胞或因子越低表達），相關性的研究也是對本實驗中皮損、通路研究內容的有機整合。

本研究初步對蜈蚣敗毒飲干預下的Tfh細胞主導通路的靶點進行了探索，在深化中醫(yī)學“毒”“瘀”理論辨治銀屑病的同時，也為后續(xù)針對于T淋巴細胞機制網絡的系統(tǒng)研究奠定了基礎，將中醫(yī)經典理論與西醫(yī)微觀機制相互融合，對中西醫(yī)結合方法在銀屑病臨證中的科學應用具有重要的促進和推動作用。