木瓜酶促進(jìn)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞成血管的功能研究

楊淑瑩 吳國(guó)鋒

廣州市荔灣中心醫(yī)院腎內(nèi)科，廣州 510170

維持性血液透析治療（maintenance hemodialysis，MHD）的基本支持是擁有一條良好的血管通路，是患者賴以生存的生命線［1］。自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺（arterio venous fistula，AVF）是目前MHD 患者中首選的血管通路，其在維持透析時(shí)所占血管通路的目標(biāo)比例大于80%［2］，具有使用時(shí)間長(zhǎng)、安全性高、并發(fā)癥少等優(yōu)勢(shì)［3］。然而，由于AVF 頻繁的穿刺使用，不可避免地出現(xiàn)內(nèi)瘺狹窄、血栓形成、瘺管疼痛等，直接影響到內(nèi)瘺的使用壽命及透析的質(zhì)量［4-6］。臨床中廣泛采用未成熟的番木瓜去籽瓢切片與高濃度白酒密封浸泡2 周以上，在AVF 穿刺24 h 后進(jìn)行濕敷的護(hù)理措施［7］。馬偉平和胡綺雯［8］研究結(jié)果顯示：木瓜酒濕敷AVF 能改善瘺管狹窄、血流量不足效果顯著。木瓜酶主要存在于番木瓜的莖葉和果實(shí)中，是活性較高的蛋白水解酶［9-11］。木瓜酶在食品、工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。其中在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀、抗凝、抗氧化、抗血栓、抑菌抗炎及促進(jìn)組織修復(fù)等作用［12］。但其促進(jìn)組織修復(fù)機(jī)制，目前尚不明確。因此我們推測(cè)，木瓜酶可能對(duì)組織中血管組織形成具有促進(jìn)的作用。

材料與方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)

采用大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞（EPC）（中科院上海細(xì)胞庫(kù)），以1×104每孔接種于6 孔培養(yǎng)板，每孔加入2 ml 含10%FBS（ThermoFisher，美國(guó)）的 DMEM 培養(yǎng)基（ThermoFisher，美國(guó)），設(shè)置 4 組，分別為空白對(duì)照組，含10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml 木瓜酶（Aladin，中國(guó)）的完全培養(yǎng)基。24 h 后更換為相應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d。

2、VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）及CD31（血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子）表達(dá)水平檢測(cè)

將6 孔板中的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 清洗3 次，除去培養(yǎng)基和其他雜質(zhì)。每孔加入Trizol（Takara，日本）裂解液1 ml，吹打混勻2 min。將吹打后的混合液轉(zhuǎn)移至1 ml 的EP 管中（不立即提取RNA 則轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱備用）。每個(gè)EP 管的混合液中加入200 μl三氯甲烷（廣州化學(xué)試劑廠，中國(guó)），震蕩15 s，待混合液呈乳濁液后置于冰上靜置15 min。待混合液分層后，轉(zhuǎn)入低溫離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），12 000 r/min，離心半徑10 cm，4 ℃離心15 min。離心后小心吸取400 μl上清液，轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入500 μl異丙醇（廣州化學(xué)試劑廠，中國(guó)），顛倒混勻10 s，冰上靜置10 min，12 000 r/min，離心半徑10 cm，4 ℃離心10 min，此時(shí)可見(jiàn)EP 管底部有白色RNA 沉淀。棄去上清，在沉淀中加入75%乙醇1 ml，震蕩，7 500 r/min，4 ℃離心5 min，去上清。在沉淀中加入無(wú)水乙醇1 ml，震蕩，7 500 r/min，離心半徑10 cm，4 ℃離心5 min，去上清。將EP 管倒置于濾紙上，風(fēng)干8～10 min。在沉淀中加入15 μl的DEPC處理水（ThermoFisher，美國(guó)），吹打，充分溶解后檢測(cè) RNA 濃度。將 RNA 稀釋至 1 000 ng/μl，置于冰上備用每個(gè)樣本按說(shuō)明書(shū)體積混合，轉(zhuǎn)移入200 μl 的EP管，吹打均勻。 將 EP 管離心，放入常規(guī) PCR 儀（ThermoFisher，美國(guó)），調(diào)制程序并運(yùn)行。將EP 管取出，吹打混合均勻。將EP 管離心，放入常規(guī)PCR 儀，調(diào)制程序并運(yùn)行。逆轉(zhuǎn)錄完成后，將樣本取出放入-20 ℃冰箱備用。設(shè)計(jì)反應(yīng)板，將96 孔板置于冰上，每個(gè)反應(yīng)孔按照說(shuō)明書(shū)加入逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）各種試劑。用封閉膜將96 孔板封閉，2 000 r/min 離心2 min，離心半徑10 cm。將板放入CFX96 熒光定量PCR 儀（Bio Rad，美國(guó)）的反應(yīng)模塊，調(diào)制程序并運(yùn)行。運(yùn)行結(jié)束后，記錄數(shù)據(jù)。

3、EPC增殖活性檢測(cè)

在96孔板中接種各組細(xì)胞（1×103個(gè)/孔），加入適量培養(yǎng)液定容為100 μl，接種3板，以24 h、48 h、72 h為時(shí)間點(diǎn)，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中（5%CO2，飽和濕度）。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出96孔板，每孔加入10 μl的CCK-8溶液。將96孔板用錫箔紙遮光處理，重新放入培養(yǎng)箱中，孵育2 h。取出96孔板，將板放入酶標(biāo)儀中，檢測(cè)450 nm吸光度值，記錄數(shù)據(jù)。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，用（）表示，多組間比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）結(jié)果顯示，在培養(yǎng)7 d、14 d 后，添加木瓜酶組的 EPC VEGF 及 CD31 表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組，且隨著木瓜酶濃度升高，其表達(dá)亦隨之升高。在0 d、7 d、14 d 時(shí)間點(diǎn)VEGF 表達(dá)水平，較之空白對(duì)照組：10 μg/ml 組表達(dá)倍率為1.04、1.56、2.14，50 μg/ml 組為1.02、2.42、3.28，100 μg/ml 組為1.01、2.02、3.05；50 μg/ml顯著高于 10 μg/ml 組，100 μg/ml 組較 50 μg/ml 組無(wú)顯著升高（圖1A）。在0 d、7 d、14 d 時(shí)間點(diǎn)CD31 表達(dá)水平較之空白對(duì)照組：10 μg/ml 組表達(dá)倍率為1.03、1.60、2.02，50 μg/ml組 為 1.02、2.22、3.65，100 μg/ml 組 為 1.01、2.66、3.66；CD31 表達(dá)水平隨著木瓜酶濃度升高而逐漸升高（圖1B）。CCK-8 顯示，EPC 的增殖能力隨培養(yǎng)基中木瓜酶濃度升高而升高。在 0 d、7 d、14 d 時(shí)間點(diǎn)，10 μg/ml 組增殖活性為108%、117%、126%，50 μg/ml 組為 103%、123%、121%，100 μg/ml組為104%、138%、142%（圖2）。

圖1 4組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞成血管相關(guān)因子VEGF（A）和CD31（B）表達(dá)水平

圖2 4組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性

討 論

木瓜酒濕敷是當(dāng)前臨床護(hù)理工作者對(duì)透析患者廣泛使用的護(hù)理干預(yù)措施，其能夠有效地減少AVF因反復(fù)的穿刺導(dǎo)致的局部的炎癥因子激活，產(chǎn)生氧化反應(yīng)、血管內(nèi)皮功能紊亂［13］。木瓜作為中醫(yī)常用藥材，具有活血化瘀，促進(jìn)愈合的功效。當(dāng)前臨床使用木瓜酒多為患者自行制作，其護(hù)理效果、質(zhì)量統(tǒng)一性參差不齊。木瓜酶是木瓜中主要的生物活性成分，已廣泛應(yīng)用于食品，制藥工業(yè)。其生物安全性、生物相容性已得到廣泛證實(shí)［14］。木瓜酶具有消炎、溶栓、促進(jìn)組織修復(fù)的功能。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明木瓜酶可能是木瓜酒濕敷療法中發(fā)揮功效的活性因子［15-16］。然而，對(duì)于木瓜酶在該療法中的功效、作用機(jī)制以及功效與用量關(guān)系等方面，目前尚欠缺相關(guān)研究。因此，如何定量分析木瓜酶對(duì)創(chuàng)口愈合及血管形成的作用，以及分析木瓜酶促血管形成，創(chuàng)口愈合的作用機(jī)理，是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。本研究通過(guò)采用添加木瓜酶的完全培養(yǎng)基對(duì)EPC進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)EPC成血管分化水平及增殖水平。EPC為大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，是實(shí)驗(yàn)室常用研究血管形成的細(xì)胞。木瓜酶為水溶性蛋白酶，能夠溶解于常規(guī)培養(yǎng)液中。結(jié)果表明，木瓜酶可有效促進(jìn)EPC成血管分化，且對(duì)細(xì)胞增殖水平具有促進(jìn)作用。本研究在常規(guī)培養(yǎng)液中添加木瓜酶，通過(guò)木瓜酶與細(xì)胞直接作用，檢測(cè)EPC成血管分化相關(guān)指標(biāo)及增殖水平。VEGF和CD31為血管內(nèi)皮形成的標(biāo)志性因子，其表達(dá)水平可在一定程度上反映出細(xì)胞內(nèi)皮向分化的水平［17］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)液中木瓜酶濃度在10 μg/ml和50 μg/ml時(shí)，能夠顯著提高成血管分化相關(guān)因子VEGF 表達(dá)，當(dāng)木瓜酶濃度達(dá)到100 μg/ml時(shí)，其成血管分化水平及增殖水平無(wú)顯著上升。表明該濃度下木瓜酶對(duì)VEGF作用無(wú)明顯提高。而CD31的表達(dá)水平隨培養(yǎng)液中木瓜酶濃度升高而呈上升趨勢(shì)。此外，EPC細(xì)胞增殖活性亦隨木瓜酶濃度提高而增加。因此，本研究結(jié)果表明，木瓜酶能夠在體外促進(jìn)EPC的成血管向分化及細(xì)胞增殖。然而，如何獲得促進(jìn)EPC成血管向分化的木瓜酶最優(yōu)濃度，木瓜酶通過(guò)何種機(jī)制促進(jìn)成血管分化及細(xì)胞增殖，在體內(nèi)模型中是否發(fā)揮同樣的功效，仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突