高分子聚合物用于siRNA遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展

王富喜 鄧宏圖 王濱

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，濱州 256600

RNA干擾技術(shù)是借助分子生物學(xué)技術(shù)將外部治療性核酸分子例如小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）導(dǎo)入患者病原部位的靶細(xì)胞內(nèi)，通過目的基因的沉默來對引發(fā)疾病的缺陷或者異常基因進(jìn)行修正，從而實現(xiàn)預(yù)防或治療特定疾病的一種新興生物治療技術(shù)，目前主要針對某些病毒引發(fā)的機體感染、人體的部分癌癥以及多種遺傳引發(fā)的病癥等［1］。siRNA 藥物相比于傳統(tǒng)藥物，在某些疾病治療上展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢，即通過序列設(shè)計靶向基因，siRNA 可以達(dá)到治療疾病的目的，并且其合成工藝相對于抗體藥物更為簡單［2］。siRNA 的靶點特異性強，對于同一家族的激酶來說，小分子抑制劑往往會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)而產(chǎn)生不良反應(yīng)，而使用siRNA 作為藥物，通過對序列的精確設(shè)計，可以使脫靶產(chǎn)生的可能性盡可能地降低［3］。siRNA 的優(yōu)點是高效和特異性，但由于siRNA 進(jìn)入體內(nèi)后的不穩(wěn)定性，因此在siRNA藥物的研發(fā)中其載體的構(gòu)建越來越受到關(guān)注，以期提高siRNA 藥物穩(wěn)定性及靶向性。本文將從siRNA 體內(nèi)遞送存在的影響因素及遞送siRNA 的高分子聚合物載體的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

siRNA體內(nèi)遞送的障礙

雖然RNA 干擾等基因技術(shù)為臨床疑難雜癥的治療提供了不同于以往治療手段的新策略，但是這些策略無一例外均需要基因體內(nèi)遞送。只有將治療基因有效遞送至患者病灶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，才能達(dá)成預(yù)期治療目標(biāo)，體外基因?qū)塍w內(nèi)便要克服遞送過程中諸多的遞送障礙，臨床上多遇見的基因遞送障礙有以下幾種。

1、核酸酶降解

由于核酸攜帶負(fù)電荷以及自身尺寸大小限度，故而很難以游離方式直接通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。而電穿孔、基因槍或直接注射靶細(xì)胞等方式雖然可以直接將目的基因注進(jìn)核酸，然而，這些技術(shù)在體內(nèi)傳遞方面存在局限性，如缺乏組織穿透、細(xì)胞和組織損傷誘導(dǎo)以及往往轉(zhuǎn)染效率很低。因此，需要更謹(jǐn)慎和高效的方法來實現(xiàn)siRNA 向腫瘤細(xì)胞的遞送。當(dāng)靶部位不能局部確定時，通過靜脈給藥是首選的策略。同時，體內(nèi)存在很多核酸酶，這些酶能夠短時間內(nèi)降解人體內(nèi)部循環(huán)中的游離核酸［4-5］。為解決核酸被破壞問題，化學(xué)修飾的主干或寡核糖核苷酸的堿基已被用來保護(hù)siRNA，而不損害其結(jié)合靶信使RNA（mRNA）的能力，臨床研究發(fā)現(xiàn)，核酸帶負(fù)電荷的磷酸主鏈與帶正電的陽離子分子可以以靜電相互作用而發(fā)生絡(luò)合生成核酸絡(luò)合物，這種結(jié)構(gòu)的絡(luò)合可以使得絡(luò)合物電荷呈近電中性，同時核酸分子結(jié)構(gòu)被壓縮，從而改善核酸被酶降解［6］。

2、細(xì)胞攝取效率

基因遞送過程中，從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)應(yīng)跨越一層含有類型數(shù)量大的糖蛋白的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜，細(xì)胞的攝取效率便往往影響了基因遞送的療效［7-9］。脂質(zhì)體、高分子載體等包載siRNA 藥物載體納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)主要借助吞噬和胞飲進(jìn)行，不同納米粒（nanoparticles，NPs）進(jìn)入細(xì)胞的方式均各不相同，應(yīng)該選擇合適納米材料作為選擇基因遞送載體材料，同時對納米材料進(jìn)行相應(yīng)修飾，利用靶細(xì)胞所處微環(huán)境差異來提高細(xì)胞攝取效率［10-11］。

3、內(nèi)涵體逃逸障礙

核酸絡(luò)合物進(jìn)入細(xì)胞后，被囊泡包裹會和細(xì)胞器融合，形成內(nèi)吞小泡，內(nèi)吞小泡會逐步從早期內(nèi)涵體轉(zhuǎn)化為晚期內(nèi)涵體，直至成熟為溶酶體，這時溶酶體內(nèi)環(huán)境的pH 值下降、消化酶類增加，為了使核酸絡(luò)合物免于被降解而失去療效，就要使核酸絡(luò)合物及時在溶酶體降解之前從內(nèi)涵體從中逃逸出來并在細(xì)胞質(zhì)中釋放［12-13］。

遞送siRNA的高分子聚合物載體

目前研究常見的基因表達(dá)載體主要有利用病毒來做載體和不利用病毒所制備的載體兩種類型。（1）病毒載體：病毒載體是將要導(dǎo)入的治療基因包裹在自然存在的病毒的外殼內(nèi)，利用自然存在的病毒對人細(xì)胞感染性來將治療基因注入人體靶細(xì)胞。實驗中多用的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄型的病毒載體、腺病毒類的載體等［14-16］；（2）非病毒載體：非病毒載體是指借助高分子材料實現(xiàn)基因遞送，常用的該類載體有脂質(zhì)體、樹枝狀大分子、非天然陽離子聚合物、天然多糖等［17-22］。

陽離子聚合物目前已是一類應(yīng)用最為廣泛的非病毒型的基因載體，是絡(luò)合核酸如siRNA 的最有吸引力的生物材料，其作為基因載體的優(yōu)勢較為明顯：（1）來源豐富，結(jié)構(gòu)多樣；（2）容易修飾和多功能化；（3）生物相容性與體內(nèi)可降解性較好等。直至如今，現(xiàn)有很多的陽離子聚合物被實驗發(fā)掘可在基因遞送中應(yīng)用，并在進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

1、聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）

PEI 是一種聚合物載體，用于遞送核酸的研究較多。PEI是一種由胺基的重復(fù)單位和兩個碳脂族CH2CH2間隔體組成的水溶性高分子聚合物，因其結(jié)構(gòu)中含有許多氨基基團，呈現(xiàn)出高密度的正電荷，具有強烈的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，促使其在一定pH 范圍內(nèi)具有更好的絡(luò)合作用和pH 緩沖能力，使核酸免受溶酶體的降解，這也是其轉(zhuǎn)染效率較高的機理［23-24］。PEI 的獨特性能使其成為廣泛應(yīng)用的 siRNA 遞送載體。但PEI 的一個顯著缺點是細(xì)胞毒性問題，其轉(zhuǎn)染效率相對來說雖然較高，但隨著分子量的增加和分支結(jié)構(gòu)的增加，PEI 以線狀和分支狀的形式存在，其表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性也有所增加。目前可知，線性或低分子量的PEI 與分支狀PEI 相比，轉(zhuǎn)染效率好，毒性低。也有報道稱，由于低分子量的PEI供siRNA結(jié)合的位點較少，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性無法在酸性環(huán)境下維持，使PEI 作為遞送載體的能力受到很大限制［25］。為減少其毒性，在不改變其物理和化學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，對PEI 進(jìn)行各種修飾，以優(yōu)化已與殼聚糖、透明質(zhì)酸、環(huán)糊精、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）等其他聚合物結(jié)合形成能保護(hù)siRNA 的NPs，形成促進(jìn)內(nèi)涵體逃逸的PEI 遞送載體。

殼聚糖是一種可生物降解、生物相容性好、無毒的聚合物，但對siRNA 轉(zhuǎn)染效率低。然而，殼聚糖與PEI 的偶聯(lián)可以緩解此缺陷。例如，Huh 等［26］研發(fā)的具有較好的生物相容性并可生物降解的乙二醇?xì)ぞ厶蔷酆衔铮℅C）-PEI-siRNA NPs，其在體內(nèi)表現(xiàn)出很強的腫瘤富集及靶向下調(diào)目標(biāo)mRNA 的效應(yīng)。Zhang 等［27］開發(fā)了一種雙靶向殼聚糖-PEI 納米系統(tǒng)TCPL/siRNA/PPF NPs，同時負(fù)載抗腫瘤藥物氯尼達(dá)明及siRNA。包裹的siRNA 靶向凋亡抑制蛋白Bcl-2，同時納米粒被一層聚乙二醇-聚（丙烯酸）-葉酸［PEG-Poly（acrylic acid）-folic acid］覆蓋，以延長循環(huán)、增強腫瘤細(xì)胞靶向性，同時載體將線粒體靶向配體三苯基膦加入殼聚糖-PEI 聚合物中，在體外也顯示出了顯著的抗腫瘤效應(yīng)。

HA 是一種由D-葡萄糖醛酸與N-乙酰D-葡萄糖胺（NAG）二糖單元交替組成的多糖，其是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和滑膜液的組成部分，是帶負(fù)電荷的、可生物降解的、無毒的、無免疫原性的，并已被用于靶向CD44，顯示出了顯著的抗腫瘤效應(yīng)。Ganesh等［28］開發(fā)了HA-PEI/PEG NPs，攜帶靶向SSB 和PLK1 蛋白的siRNA，在異種移植瘤模型中顯示了siRNA 具有體內(nèi)活性。此外，siRNA 的沉默效率高度依賴于腫瘤的血管化，這表明腫瘤部位的積累并不僅僅是由靶向配體HA介導(dǎo)的。

CD 是一個由α-1，4 糖苷鍵連接的葡萄糖亞基組成的大環(huán)環(huán)寡糖。β-CD 納米系統(tǒng)的特點是內(nèi)部疏水，外部親水，它們被用于增強負(fù)載疏水藥物的藥代動力學(xué)特性，其與siRNA 已成為協(xié)同藥物傳遞的理想候選載體。有研究開發(fā)了一種吸附在金納米棒上的CD-PEI偶聯(lián)物，用于多西他賽（docetaxel，DTX）與靶向p65 蛋白的 siRNA 共同遞送，結(jié)果表明，p65 抑制核因子-κB 通路及其下游級聯(lián)反應(yīng)，增強了DTX效應(yīng)，抑制了體內(nèi)腫瘤的生長［29］。

2、多聚賴氨酸（poly-L-lysine，PLL）

與PEI 類似，PLL 也是被廣泛用于核酸傳遞的納米載體。PLL 比PEI 具有更好的生物相容性和生物降解性。然而，PLL/siRNA 和PLL-PEG/siRNA 多聚物更容易與血清蛋白相互作用，降低了其沉默靶mRNA 的能力。研究表明，血清白蛋白和其他聚陰離子可以與siRNA 競爭結(jié)合PLL，導(dǎo)致顆粒不穩(wěn)定性和siRNA 解體。有趣的是，鎖相環(huán)衍生物能夠通過提高血清穩(wěn)定性來緩解這一缺點。例如，聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）已 被 用 于 開 發(fā) 一 種 新 型PEG-PCL-PLL 聚合物，它能夠結(jié)合siRNA 并形成膠束。該制劑的體外沉默效率與lipofectamine 2000 相似，優(yōu)于PEI［30］。

PLL 還利用其優(yōu)異的光熱特性與生物相容性與黑色素結(jié)合。黑色素在近紅外照射下產(chǎn)生熱量，這可能被用來促進(jìn)siRNA 內(nèi)涵體逃逸。生成的黑色素-PLL 聚合物負(fù)載以存活蛋白（survivin）為靶點的siRNA，在體內(nèi)和體外均對4T1 腫瘤細(xì)胞生長有很強的抑制作用，同時與對照組相比，能夠明顯抑制小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤的進(jìn)展［31］。研究表明，Wang等［29］開發(fā)了一種新型三嵌段聚合物，由聚天冬氨酸［N-（N’，N’-二異丙基氨基乙基）］（PAD）與PLL-PEG 結(jié)合組成。PAD 用于賦予聚合物的pH 值敏感性，從而增強siRNA 和阿霉素向腫瘤細(xì)胞的傳遞。載體通過負(fù)載抗腫瘤藥物阿霉素，以及靶向Bcl-2 的siRNA 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。HepG2/阿霉素荷瘤小鼠的生物分布分析顯示，注射6 h 后腫瘤部位出現(xiàn)NP 積累，24 h 時達(dá)到最大值，持續(xù)時間長達(dá)48 h。此外，負(fù)載阿霉素/siRNA 治療組與對照組相比，PAD-PEG-PLL NPs 能夠抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長并增加其生存時間，同時體外分析顯示，治療后Bcl-2 和Ki67 的表達(dá)減少，提示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞增殖，從而控制了荷瘤小鼠的腫瘤生長［32］。

3、聚乳酸-乙醇酸（polylactic-co-glycolicacid，PLGA）

PLGA 是一種安全的高分子聚合物，具有生物可降解性，廣泛用于包括siRNA 遞送在內(nèi)的藥物的遞送。在細(xì)胞水平上，PLGA 容易通過內(nèi)吞作用穿透細(xì)胞膜或促使siRNA進(jìn)入細(xì)胞，并迅速釋放到目標(biāo)位置，直到溶酶體降解siRNA。但有報道稱，單獨與siRNA 結(jié)合，可能受siRNA 陰離子電荷和極性的影響，PLGA 的封裝效率、藥物釋放和轉(zhuǎn)染效率都受到限制［30］。利用經(jīng)過PEI 修飾的PLGA 納米微粒，提高了siRNA 的包封效率和釋放度，提高了siRNA 在聚合物中的保留性，促使siRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中［33］。

siRNA 藥物是目前受到重點關(guān)注的新型藥物。理論上，它能沉默任何疾病相關(guān)基因的表達(dá)。這使其成為治療各種惡性難治性疾?。ò[瘤等重大疾?。┑南Ｍ?。但它同時也存在血漿穩(wěn)定性差、生物利用度低等問題。這已成為制約其應(yīng)用的致命性缺點。如何將其有效地遞送至體內(nèi)、提高其生物利用度，是目前亟須解決的問題，而尋找優(yōu)良載體、合理設(shè)計遞送體系至關(guān)重要。目前關(guān)于siRNA 的遞送系統(tǒng)的開發(fā)研究越來越多，隨著研究的不斷深入，相信在不久的將來會設(shè)計出更多的siRNA 高分子聚合物遞送載體，在治療腫瘤疾病及多種疾病方面會有很大的貢獻(xiàn)。