菌酶協(xié)同作用制備鰱魚鮮味劑分析

◎ 任 濤，余 薇，羅 茜，劉 婷，潘篤杰

（武漢工控工業(yè)技術(shù)研究院有限公司，湖北 武漢 430019）

水產(chǎn)品味道鮮美，因其不但具有高蛋白、高度不飽和脂肪酸、微量元素和維生素等營養(yǎng)成分，而且還具有游離氨基酸、?；撬?、琥珀酸、核苷酸、肌肽、鵝肌肽、甜菜堿及氧化三甲胺等具有特殊風(fēng)味的呈味物質(zhì)[1]。

生物體組織細(xì)胞中存在著各種消化酶，在控制條件下，它們能對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等大分子進(jìn)行分解，尤其是這種多酶自溶體系通過激活可以將蛋白質(zhì)分解為氨基酸和肽類，從而改變原料的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)成分組成，進(jìn)一步影響其風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)[2-7]。米曲霉能夠分泌多種水解酶系，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶等，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品工藝中。耐鹽酵母，也被稱為“營養(yǎng)酵母”，具有繁殖快、酶系豐富、不產(chǎn)毒素等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。

本文在對當(dāng)前控制酶解及自然發(fā)酵制備鮮味劑工藝研究的基礎(chǔ)上，以鰱魚為原料，利用魚體內(nèi)源酶系對原料進(jìn)行預(yù)水解，通過米曲霉和耐鹽酵母共發(fā)酵過程分泌的酶系催化原料成分，多級轉(zhuǎn)化制備水產(chǎn)鮮味劑，對制備的鰱魚鮮味劑理化和感官指標(biāo)進(jìn)行了定性、定量分析，以期能夠?yàn)樗a(chǎn)品綜合深加工提供一條新途徑，對調(diào)味品行業(yè)新產(chǎn)品開發(fā)提供參考，為該產(chǎn)品的工業(yè)化應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉、耐鹽酵母，湖北省工業(yè)微生物菌種保藏與研究中心篩選保藏；鰱魚、香菇柄、食鹽，市售；其他試劑均為分析純。

PL2002型電子分析天平，梅特勒—托利多儀器上海有限公司；PHS-25型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WEF.M6/16馬弗爐，沃爾福（上海）實(shí)業(yè)有限公司；膠體磨，天水骨泥機(jī)廠；DV-C粘度計(jì)，Brookfield公司；SPME萃取裝置：SPME手柄；萃取頭；氣質(zhì)聯(lián)用儀：7890A/5975C（Agilent）；頂空采樣瓶：20 mL（Agilent）；氨基酸自動分析儀，日立 L8800；等離子體發(fā)射光譜儀，熱電iCAP6300；原子吸收光譜儀，日立Z5000；自動蛋白質(zhì)分析儀，熱電FLASH 4000 N；發(fā)酵罐，NBS。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌酶協(xié)同作用制備鰱魚鮮味劑的工藝條件

（1）原料準(zhǔn)備。鮮活白鰱魚三去（去頭、去腮、去內(nèi)臟）后清洗干凈，超低溫粉碎成魚糜冷藏待用。香菇柄烘干后，超微粉碎至60～80目待用。定量分析魚糜水分、蛋白質(zhì)、脂肪、灰分和揮發(fā)性風(fēng)味成分。

（2）內(nèi)源酶預(yù)酶解。冷藏的魚糜用0.5 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.0，55 ℃酶解1 h，監(jiān)測內(nèi)源酶處理過程中體系總揮發(fā)性鹽基氮（Total Volatile Basic-Nitrogen，TVB-N）、游離氨基態(tài)氮、黏度的變化。

（3）發(fā)酵。調(diào)整酶解液中香菇柄粉含量為20%，NaCl含量2%，115 ℃滅菌10 min。將擴(kuò)培后的混合菌株（米曲霉∶耐鹽酵母=1∶2）接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH和發(fā)酵溫度，間歇攪拌培養(yǎng)?；景l(fā)酵參數(shù)：混菌接種量3%，pH值為6.0，溫度32 ℃，共發(fā)酵120 h。

（4）自溶。調(diào)整發(fā)酵液NaCl含量至5%，溫度60 ℃以促進(jìn)菌體裂解釋放胞內(nèi)核苷酸、谷胱甘肽、B族維生素等多種成分。

（5）滅菌并低度熱反應(yīng)。自溶后的反應(yīng)液升溫至105 ℃并維持10 min。在此過程中原料中各種代謝產(chǎn)物之間發(fā)生輕度美拉德反應(yīng)，使得產(chǎn)品質(zhì)地均一、香味柔和本真。定量分析產(chǎn)品營養(yǎng)成分、揮發(fā)性成分、氨基酸組成、重金屬含量和衛(wèi)生指標(biāo)。

1.2.2 檢測方法水分的測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）；灰分的測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）；蛋白質(zhì)含量測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白

質(zhì)的測定》（GB 5009.5—2016）；脂肪含量測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》（GB 5009.6—2016）；氨基酸態(tài)氮含量測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》（GB 5009.235—2016）；砷含量的測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機(jī)砷的測定》（GB 5009.11—2014）；鉛含量的測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉛的測定》（GB 5009.12—2017）；鎘含量的測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎘的測定》（GB 5009.15—2014）；汞含量的測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總汞及有機(jī)汞的測定》（GB 5009.17—2021）；揮發(fā)性鹽基氮的測定的測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》（GB 5009.228—2016）；氨基酸組成分析參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》（GB 5009.124—2016）；呈味核苷酸二鈉測定參照《雞精調(diào)味品》（SB/T 10371—2003）；微生物檢測：GB4789系列；揮發(fā)性成分分析：固相微萃?。⊿olid Phase Micro-Extraction，SPME）結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源酶酶解前后魚糜TVB-N和氨基酸態(tài)氮含量的對比分析

初始鰱魚的TVB-N值為14.25 mg/100 g，氨基酸態(tài)氮含量為18.5 mg/100 g，黏度為5 156 cp，3 h時(shí)內(nèi)源酶水解液的TVB-N值為27.7 mg/100 g，黏度為418 cp，此時(shí)氨基酸態(tài)氮含量為131.3 mg/100 g。進(jìn)一步延長內(nèi)源酶解時(shí)間，游離氨基酸態(tài)氮含量無顯著變化，而TVB-N值逐漸升高，這是因?yàn)殡S著內(nèi)源酶活性降低，來自原料及開放體系的腐敗菌快速增殖，分解蛋白質(zhì)生成氨、二甲胺、三甲胺等揮發(fā)性含氮化合物。這些成分的存在會嚴(yán)重影響水解液的感官特性，因此控制內(nèi)源酶水解過程的TVB-N值低于30 mg/100 g。此外內(nèi)源酶水解會顯著降低反應(yīng)體系的黏度，有利于增強(qiáng)設(shè)備利用率和降低工序能耗便于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2 原料及產(chǎn)品營養(yǎng)成分分析

通過表1和表2可以看出，鰱魚經(jīng)內(nèi)源酶預(yù)酶解、發(fā)酵、自溶、滅菌并低度熱反應(yīng)處理后得到的鮮味劑產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量高，脂肪及氯化物含量低，總氨基酸含量在18.82%。氨基酸種類齊全，必需氨基酸含量占氨基酸總含量的36.2%，必需氨基酸含量與非必需氨基酸含量之比（EAA/NEAA）為0.57，接近FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.4和0.6。此外還含有肌肽、γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid，GABA）和豐富的鈣質(zhì)。

表1 原料與產(chǎn)品成分表

表2 鮮味劑氨基酸組成分析表

2.3 原料和產(chǎn)品中揮發(fā)性風(fēng)味化合物比較分析

鰱魚肉中揮發(fā)性風(fēng)味成分經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀40 min內(nèi)即能完全解析，解析出的成分以揮發(fā)性羰基化合物和醇類為主，也含有少量的酯類和硫醚類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，新鮮鰱魚魚肉中的氣味活性物質(zhì)主要有己醛、庚醛、戊醇、辛醛和(Z)-2-戊烯-1-醇等烯醇、烯酮、烯醛類化合物，如六碳化合物己醛可以產(chǎn)生一種明顯的原生味、鮮香類植物香和醛的特征香味，8個(gè)碳原子的揮發(fā)性醇和羰基化合物能產(chǎn)生特殊的類似植物的新鮮香氣，9個(gè)碳原子的化合物(E)-2-壬烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛和3,6-壬二烯-1-醇是新鮮魚類中類黃瓜香和類蜜瓜香的來源[10-12]。

本次實(shí)驗(yàn)檢出此類化合物相對百分含量高達(dá)55.42%。在用鰱魚制備鮮味劑的過程中，其經(jīng)過菌酶協(xié)同作用、菌體自溶和輕度美拉德反應(yīng)后，其揮發(fā)性羰基化合物和醇類的相對百分含量降低至5.53%，雜環(huán)類化合物含量顯著增加，可能是經(jīng)美拉德和熱解反應(yīng)生成的，其中2-芐基（苯甲基）異氰化含量高達(dá)66.19%，有典型香氣[13-15]?？傮w來說，與鮮味劑氣味相關(guān)的化合物多為六碳至九碳化合物、含氮類物質(zhì)[16-19]，且相對分子質(zhì)量分布范圍主要在80～200，這些化合物通過協(xié)同增效構(gòu)成了鰱魚鮮味劑獨(dú)特滋味和氣味。原料和產(chǎn)品中揮發(fā)性成分的種類及相對含量具體見表3。

表3 原料和產(chǎn)品中揮發(fā)性成分的種類及相對含量比較分析表

2.4 產(chǎn)品中呈味物質(zhì)分析

一般呈味氨基酸主要包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、組氨酸和脯氨酸，從表1數(shù)據(jù)可看出本產(chǎn)品中呈味氨基酸占游離氨基酸總量的55.68%。谷氨酸鈉的呈味閾值為0.012 g·kg-1，而天門冬氨酸鈉的呈味閾值0.01 g·kg-1，本產(chǎn)品中谷氨酸、天門冬氨酸的含量分別為3.02%和1.74%，為主要的呈鮮味物質(zhì)，而鳥氨酸的呈味閾值為0.012 g·kg-1，肌苷酸二鈉的呈味閾值為0.025 g·kg-1[20]，本產(chǎn)品中I+G的含量為0.166%。谷氨酸鈉、天門冬氨酸鈉與I+G的協(xié)同增效作用極大地提升了產(chǎn)品的鮮度。

2.5 產(chǎn)品重金屬含量和衛(wèi)生指標(biāo)分析

鮮味劑中重金屬砷、鉛、鎘和汞的含量分別為0.036 g·kg-1、0.005 g·kg-1、0.001 g·kg-1、0.029 g·kg-1，均遠(yuǎn)低于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）中規(guī)定的砷1.0 g·kg-1、鎘0.1 g·kg-1、汞0.1 g·kg-1的限量。鮮味劑中菌落總數(shù)＜10 CFU/100 g，大腸桿菌數(shù)＜30 MPN/100 g，遠(yuǎn)低于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)調(diào)味品》（GB 10133—2014）中規(guī)定的菌落總數(shù)和大腸桿菌限量要求。

3 結(jié)論

以鰱魚為原料，通過菌酶協(xié)同作用聯(lián)合輕度美拉德反應(yīng)技術(shù)制備鮮味劑，對產(chǎn)品進(jìn)行了綜合分析，可以得出如下結(jié)論：與目前的酶解法和自然發(fā)酵法生產(chǎn)過程相比，本工藝省去了大量商品酶的使用，極大地降低了成本，全部生產(chǎn)時(shí)間僅130 h，提高了生產(chǎn)效率。產(chǎn)品呈味化合物含量豐富，谷氨酸鈉、天門冬氨酸鈉與I+G的總含量高達(dá)4.926%，揮發(fā)性化合物中2-芐基（苯甲基）異氰化含量高達(dá)66.19%；產(chǎn)品營養(yǎng)素全面，鈣質(zhì)含量為1.9%，富含18種氨基酸，其中EAA/NEAA值為0.57；產(chǎn)品衛(wèi)生安全，重金屬含量遠(yuǎn)低于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）中的限量要求，菌落總數(shù)、大腸菌群及致病菌含量符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)調(diào)味品》（GB 10133—2014）規(guī)定要求，是一種營養(yǎng)、安全的魚制調(diào)味品。