同位素內(nèi)標(biāo)稀釋-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 測定花生及其制品中黃曲霉毒素B1的含量

◎ 劉定舟，張丹鶴，周瑩瑩，李 超，趙雪峰，聶阿真，賈松濤，趙林萍

（1.河南中標(biāo)檢測服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450001；2.鄭州中道生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450001）

在目前已知的化學(xué)物質(zhì)中，黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的致癌性較強(qiáng)。在國家質(zhì)檢總局規(guī)定的必檢項(xiàng)目中，AFB1也是大部分食品需要檢測的項(xiàng)目。AFB1對人類和各種動物都有劇毒，其毒性主要損害肝臟[1]。由于花生高親和性的原因，在花生的種收和加工過程中更易受到黃曲霉和黃曲霉毒素的污染?；ㄉ挟a(chǎn)生的黃曲霉毒素有黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1等，其中AFB1是其中毒性最強(qiáng)以及產(chǎn)毒量最大的毒素[2-3]。

目前來說，AFB1的主要檢測方法有液相法、液質(zhì)法、酶聯(lián)免疫法等。通常，黃曲霉毒素在組織里的含量比較低，相比高效色譜法來說，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度和準(zhǔn)確性更高。而在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法中，前處理方法常用的有免疫親和柱凈化法，固相萃取法和QuEChERS法等，這些方法互有優(yōu)劣，但均存在步驟煩瑣、回收率較低，基質(zhì)效應(yīng)殘留影響定性、成本較高等問題[4-5]。本文目的在于建立同位素內(nèi)標(biāo)稀釋-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對市場常見花生及其制品里AFB1含量的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品為花生、油炸花生、水煮花生、烤花生等；TSQ Vantage超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Technologies）；天平，十萬分之一；超聲波清洗器；多管渦旋振蕩器；色譜級甲醇、甲酸、乙腈；超純水；AFB1對照品（批號Lot：1I0E17，純度＞99%，Pribolab）；13C17-AFB1同位素內(nèi)標(biāo)對照品（批號Lot：2A00I13，0.504 μg·mL-1，Pribolab）；0.22 μm微孔及0.45 μm微孔有機(jī)相濾膜，津騰。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備凈化過程

用高速粉碎機(jī)粉碎，稱取5 g樣品（精確至0.01 g），加入20 mL甲醇-水（70∶30，體積比），渦旋振蕩10 min，用超聲清洗器在40 ℃下超聲20 min，于離心機(jī)中8 000 r·min-1冷凍離心5 min，取上清液經(jīng)微孔濾膜過濾至10 mL離心管中，準(zhǔn)確移取1 000 μL濾液，向其中加入13C17黃曲霉毒素B1同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（100 ng·mL-1）30 μL，用甲醇-水（70∶30，體積比）定容至10 mL，振搖均勻，備用。如果樣液中AFB1含量超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，則另做稀釋，增加加入的內(nèi)標(biāo)量，使其上機(jī)濃度保持在0.3 ng·mL-1。

1.2.2 制備對照品溶液

①AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg·mL-1）。準(zhǔn)確稱取AFB1標(biāo)準(zhǔn)品1.01 mg（精確至0.01 mg）至容量瓶中，加入乙腈，定容到10 mL，-18 ℃條件保存。②AFB1標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（100 ng·mL-1）。準(zhǔn)確移取0.1 mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于容量瓶中，加入乙腈，定容到100 mL，-18 ℃條件保存。③13C17-AFB1同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（100 ng·mL-1）。移取200 μg13C17-AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲備液到1 mL的容量瓶里，用乙腈定容，-18 ℃條件保存。④AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。分別吸取AFB1標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 ng·mL-1）0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL于10.00 mL容量瓶中向其中分別加入0.03 mL13C17-AFB1同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（100 ng·mL-1）用甲醇-水（70∶30，體積比）定容，得到AFB1濃度分別為0.1 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)濃度為0.3 ng·mL-1，臨用新配。

1.2.3 檢測

（1）儀器條件。色譜條件：色譜柱為waters ACQUITY UPLC BEH C18，粒徑1.7 μm，2.1 mm×50 mm；流動相采用乙腈+0.1%甲酸水溶液；0.25 mL·min-1流速；25℃柱溫、2 μL進(jìn)樣量。質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源、350 ℃、正離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測（SRM）監(jiān)測方式。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。依次把標(biāo)準(zhǔn)系列工作液注入液相，測定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，以AFB1和13C17-AFB1峰面積比值為縱坐標(biāo)，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）試樣溶液的測定。將試液注入液相之后，以保留出峰時間作為定性，以離子豐度比來確認(rèn)定性，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中代入AFB1和13C17-AFB1的峰面積比值，得出定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜優(yōu)化

將試液直接注入質(zhì)譜，切換離子條件，優(yōu)化得知響應(yīng)度最好的為正離子模式，在此模式下再對AFB1及13C17-AFB1的母離子與子離子進(jìn)行優(yōu)化選取，分別得到1個母離子與3個最優(yōu)的子離子，以及對應(yīng)的離子條件（表1）和離子流圖（圖1、2）。

表1 質(zhì)譜監(jiān)測條件表

2.2 線性范圍及限量

分別配制試液濃度0.001 ng·mL-1、0.005 ng·mL-1、0.010 ng·mL-1、0.050 ng·mL-1、0.100 ng·mL-1、0.500 ng·mL-1、1.000 ng·mL-1、5.000 ng·mL-1、10.000 ng·mL-1、50.000 ng·mL-1、100.000 ng·mL-1和500.000 ng·mL-1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過以上質(zhì)譜條件測定后，繪制濃度比峰面積的曲線。結(jié)果表明濃度范圍為0.010～100.000 ng·mL-1時線性擬合度較好，線性方程Y=2.648e-1X，相關(guān)系數(shù)（r2）=0.999 6，以SN＞3和SN＞10時的濃度分別對應(yīng)檢出限和定量限，本法AFB1的檢出限和定量限分別為0.03 ng·mL-1和0.10 ng·mL-1（以1 g樣品定容體積為100 mL計(jì)）。

2.3 回收率及重復(fù)性

在花生、油炸花生、水煮花生、烤花生中添加13C17-AFB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，質(zhì)控濃度溶液分別為0.1 ng·mL-1、0.3 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1，進(jìn)行10次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算結(jié)果見表2，從表2可以看出，以上待測物回收率均大于86.4%，精密度均小于10.0%。

表2 AFB1回收率和精密度表

2.4 實(shí)際樣品的檢測

采用本方法對402份市場售賣花生及其制品（花生、油炸花生、水煮花生、烤花生）進(jìn)行AFB1含量的測定，其中110份有檢出，62份超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)20 μg·kg-1，含量在0.2～1 000.0 ng·mL-1不等，這從一方面反映了市售花生及其制品中AFB1污染率較高，對食用花生及其制品的群體來說存在隱患。

2.5 特殊樣品的舉例

霉變的花生并非一定含有AFB1?？蛻羲蜋z過兩份生花生樣品，樣品1中小部分花生胚部有肉眼可見的黑色霉斑，經(jīng)連續(xù)3次檢測后，未檢測到AFB1殘留；樣品2無可見霉斑，物理性狀無異常，經(jīng)連續(xù)3次檢測后，AFB1均檢出超出國家限量標(biāo)準(zhǔn)20 μg·kg-1，平均值為232 μg·kg-1。

3 結(jié)論

基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法所建立的花生及其制品中AFB1的快速定性定量分析方法，采用稀釋的手段來降低基質(zhì)干擾，結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)來校正基質(zhì)效應(yīng)，減少了上柱凈化、氮吹復(fù)溶等步驟，避免了免疫親和柱等對目標(biāo)物造成的損失，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了實(shí)驗(yàn)效率，降低了實(shí)驗(yàn)成本，簡單易行，分析時間短，靈敏度高，重復(fù)性好，可滿足日常檢測需求，也對痕量樣品的分析適用。