AKR1C1 在良性前列腺增生細(xì)胞系中的功能

葉林朋 呂 源 楊中華

1黃梅縣人民醫(yī)院泌尿外科 湖北 黃岡 435500；

2武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科 湖北 武漢 430071

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是導(dǎo)致中老年男性排尿障礙的常見泌尿系統(tǒng)疾病［1］，其以尿頻、尿急、夜尿增多等膀胱刺激癥狀以及排尿時間延長、尿線變細(xì)、進(jìn)行性排尿困難等尿路梗阻癥狀為主要臨床表現(xiàn)，并可伴有小腹部墜脹感或腰骶痛等其他表現(xiàn)，嚴(yán)重時可引起急性尿潴留或上尿路病變等繼發(fā)癥［2］。前列腺與雄激素之間聯(lián)系非常緊密［3］，雄激素作用是BPH 發(fā)生發(fā)展的必要條件。雄激素與前列腺細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，通過抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖作用引起前列腺細(xì)胞的增殖凋亡失調(diào)，繼而導(dǎo)致前列腺增生。雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）［4］雖然對前列腺的正常生長發(fā)育起促進(jìn)作用，但同時也會導(dǎo)致前列腺增生等病理性改變。DHT 通過刺激間質(zhì)組織并引發(fā)其細(xì)胞增殖，同時誘發(fā)上皮細(xì)胞發(fā)生分裂，促進(jìn)BPH 的發(fā)生發(fā)展。

醛酮還原酶家族1 成員C1（aldoketo reductase family 1 member C1，AKR1C1）［5］基因?qū)儆谌┩€原酶超家族，該家族共有5 個家族成員，在人類類固醇代謝中有重要作用。AKR1C 家族成員包括AKR1C1、 AKR1C2、 AKR1C3、 AKR1C4 和AKR1D1，這些基因均位于10號染色體p14 上［6］。研究發(fā)現(xiàn)AKR1C 家族成員在不同腫瘤中有重要作用，并與BPH 等良性疾病密切相關(guān)［7］。AKR1C1 是前列腺細(xì)胞自身合成睪酮與DHT 的關(guān)鍵酶，AKRIC1 可使DHT 轉(zhuǎn)化為3β?二醇，3β?二醇結(jié)合雄激素受體β 參與細(xì)胞的增殖和凋亡。但是關(guān)于AKR1C1 在BPH 中的作用尚不明確。有文獻(xiàn)報道證實AKR1C1 在BPH 組織中異常高表達(dá)［8］，因此，本研究旨在明確AKR1C1 在前列腺細(xì)胞中的功能。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人良性前列腺增生上皮細(xì)胞系BPH?1（資源編號BNCC339850）、人正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞系 WPMY?1（資源編號BNCC100291）購于上海中科院細(xì)胞庫。BPH?1 細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco，澳大利亞）中培養(yǎng)，WPMY?1 細(xì)胞在含5%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco，澳大利亞）中培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均在37 ℃，95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 轉(zhuǎn)染siRNA 和轉(zhuǎn)染試劑購自蘇州吉瑪基因股份有限公司，小干擾RNA 序列（5'—3'）如下：si?AKR1C1?1：AAGGAGCTTTCCGGACC；si?AKR1C1?2：GGGAACTTAGAGCAAGCC；si?AKR1C1?3：TTAACGAGATTACCGGC；si?con：GGAAGTCCCGATCTATACG。 細(xì)胞計數(shù)后接種于6 孔板，每孔密度約為106個。當(dāng)6 孔板里的細(xì)胞匯合度達(dá)到30%～50%時更換新鮮培養(yǎng)基。根據(jù)試劑制造商提供的說明書配置轉(zhuǎn)染體系后，室溫孵育15～30 min，隨后每孔加入200 μL 復(fù)合物，在37 ℃，95%空氣和5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后，再次更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 流式細(xì)胞學(xué)分析用預(yù)冷PBS 離心洗滌，收集106個細(xì)胞（含上清液中的細(xì)胞）。用雙蒸水稀釋5×Binding Buffer 為1×工作液，取500 μL 1×Bind?ing Buffer 重懸細(xì)胞，每管加入5 μL Annexin V?FITC 和10 μL PI（聯(lián)科生物，杭州），輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。用預(yù)冷PBS 離心洗滌，收集106個細(xì)胞，加入1 mL DNA Staining solution 和10 μL Permea?bilization solution（聯(lián)科生物，杭州），渦旋振蕩5～10 s 混勻，室溫避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.4 細(xì)胞MTT 檢測轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞并計數(shù)，在96 孔板中每孔接種3 000～5 000 個細(xì)胞，每孔體積為200 μL。經(jīng)過0、1、2、3 d 的培養(yǎng)后，每孔加入10 μL MTT 溶液/100 μL 培養(yǎng)基，在37 ℃，95%空氣和5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后在微平板閱讀器（Thermo Scientific）上讀取其在450 nm 處的吸光度。

1.5 RNA 提取和實時熒光定量PCR根據(jù)試劑制造商提供的說明書，利用Hipure Total RNA Mini Kit（Cat. R4111?03，Magen）提取細(xì)胞中的總RNA。實時定量PCR 采用Bio?Rad（美國）CFX96 體系進(jìn)行。所有基因的表達(dá)水平由GAPDH 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有的樣本均獨立重復(fù)3 次（引物序列見表1）。

表1 用于PCR 的引物序列

1.6 免疫蛋白印跡分析將106個細(xì)胞于含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA（Sigma?Aldrich）中超聲處理后，放置于冰上裂解30 min。12 000g離心15 min，收集上清。30 μg 總蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠分離，用Bio?Rad 濕轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜（Millipore，Billerica，MA，美國）。用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液室溫孵育2 h，4 ℃條件下一抗孵育過夜（主要抗體見表2）。用TBST 溶液洗滌3 次后，室溫條件下二抗孵育2 h。再次TBST 洗滌3 次，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測所有反應(yīng)抗原。所有蛋白的表達(dá)水平由GAPDH 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有的樣本均獨立重復(fù)3 次。

表2 用于Western Blot 的一抗

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng) 計 分 析 使 用SPSS 22.0（IBM，Armonk，NY，USA）軟件，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析。P<0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 AKR1C1 的敲減減緩了前列腺細(xì)胞的增殖水平為了建立AKR1C1 缺失的細(xì)胞模型，我們將3種不同的 AKR1C1 靶向特異性 siRNAs（si?AKR1C1s）轉(zhuǎn)染到WPMY?1 和BPH?1 細(xì) 胞中，48 h 后RT?PCR（圖1A、1B）結(jié)果分析提示，可以觀察到si?AKR1C1?2 在兩種細(xì)胞系中有著近乎80%的敲減效率，于是si?AKR1C1?2 被選擇使用進(jìn)行后續(xù)實驗，相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平相一致（圖1C、1D）。MTT 結(jié)果顯示AKR1C1 的敲減在BPH?1 和WP?MY?1 細(xì)胞系中表現(xiàn)出時間依賴性的增殖活性下降（圖1E、1F）。

圖1 前列腺細(xì)胞系中敲減AKR1C1 的效率驗證及對細(xì)胞增殖活性影響

2.2 AKR1C1 的敲減促進(jìn)了前列腺細(xì)胞的凋亡水平，而對細(xì)胞周期無明顯影響在細(xì)胞凋亡及周期的檢測中我們觀察到，AKR1C1 的敲減對BPH?1 和WPMY?1 細(xì)胞系的周期無明顯影響（圖2A、2B、2C），但可使BPH?1 和WPMY?1 細(xì)胞的凋亡率上升（圖2D、2E、2F）。相應(yīng)的周期蛋白CDK2 及CDK4在AKR1C1 敲減后無明顯表達(dá)差異，反映凋亡水平的表達(dá)蛋白BAX 在AKR1C1 敲減后表達(dá)上調(diào)，而凋亡負(fù)相關(guān)蛋白Bcl?2 在AKR1C1 敲減后表達(dá)下調(diào)（圖2G、2H）。

圖2 前列腺細(xì)胞系中敲減AKR1C1 對細(xì)胞周期及凋亡的影響

2.3 AKR1C1 的過表達(dá)上調(diào)了前列腺細(xì)胞的增殖水平將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BPH?1 和WPMY?1 細(xì)胞中過表 達(dá)AKR1C1，連 續(xù) 培 養(yǎng)48 h 后，AKR1C1 在mRNA 和蛋白質(zhì)水平上均達(dá)到上調(diào)效果（圖3A、3B、3C），以進(jìn)行后續(xù)實驗。 MTT 結(jié)果顯示AKR1C1 的過表達(dá)在BPH?1 和WPMY?1 細(xì)胞系中表現(xiàn)出時間依賴性的增殖活性上調(diào)（圖3D、3E）。

圖3 前列腺細(xì)胞系中過表達(dá)AKR1C1 的效率驗證及對細(xì)胞增殖活性影響

2.4 AKR1C1 的過表達(dá)抑制了前列腺細(xì)胞的凋亡水平，而對細(xì)胞周期無明顯影響在細(xì)胞凋亡及周期的檢測中觀察到，AKR1C1 的過表達(dá)對BPH?1 和WPMY?1 細(xì)胞系的周期無明顯影響（圖4A、4B、4C），但可抑制BPH?1 和WPMY?1 細(xì)胞的凋亡（圖4D、4E、4F）。相應(yīng)的周期蛋白CDK2 及CDK4 在AKR1C1 過表達(dá)后無明顯表達(dá)差異，反映凋亡水平的表達(dá)蛋白BAX 在AKR1C1 過表達(dá)后表達(dá)下降，而凋亡負(fù)相關(guān)蛋白Bcl?2 在AKR1C1 過表達(dá)后表達(dá)上調(diào)（圖4G、4H）。

圖4 前列腺細(xì)胞系中敲減AKR1C1 對細(xì)胞周期及凋亡的影響

3 討論

人類前列腺對正常男性生殖是必不可少的，成熟腺體的生長和維持依賴于強效雄激素5α?二氫睪酮（DHT）［9］。雄激素作用是BPH 發(fā)生發(fā)展的必要條件。雄激素與前列腺細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，通過抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖作用引起前列腺細(xì)胞的增殖凋亡失調(diào)，繼而導(dǎo)致BPH［10］。DHT 作為雄激素的一種，其濃度在BPH 組織中比正常組織中明顯增高，其與前列腺腺體內(nèi)受體的親和力更強。DHT 雖然對前列腺的正常生長發(fā)育起促進(jìn)作用，但同時也會導(dǎo)致前列腺增生等病理性改變［11］。DHT 通過刺激間質(zhì)組織并引發(fā)其細(xì)胞增殖，同時誘發(fā)上皮細(xì)胞發(fā)生分裂，促進(jìn)BPH 的發(fā)生發(fā)展。雄激素的作用在前列腺中由負(fù)責(zé)DHT 的形成和消除的酶在預(yù)受體水平上調(diào)控，例如2，5α?還原酶和羥類固醇脫氫酶［9］，這些酶或核受體的失調(diào)可能導(dǎo)致雄激素依賴性疾病的發(fā)生。

本 研 究 對BPH?1 和WPMY?1 細(xì) 胞 系 中 的AKR1C1 基因進(jìn)行敲減和過表達(dá)，以進(jìn)一步驗證AKR1C1 水平的變化對前列腺細(xì)胞的功能影響。結(jié)果表明，AKR1C1 的敲減減弱了前列腺細(xì)胞的增殖能力，加快了細(xì)胞的凋亡水平，而其過表達(dá)則對前列腺細(xì)胞的增殖水平發(fā)揮促進(jìn)作用，同時在一定程度上抑制了細(xì)胞的凋亡發(fā)生，以上均表明AKR1C1 在前列腺細(xì)胞中是一個促進(jìn)增殖、抑制凋亡的蛋白。但在細(xì)胞周期的檢測中我們觀察到，AKR1C1 水平的變化并未對前列腺細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生明顯影響，這可能表明AKR1C1 在前列腺細(xì)胞中并不是一個周期相關(guān)的蛋白。

綜上所述，良性前列腺增生中AKR1C1 的高水平表達(dá)，可促進(jìn)前列腺細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，從而在良性前列腺增生疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。因此，針對AKR1C1 靶點，有可能成為良性前列腺增生的治療新策略。