基于EST-SSR標(biāo)記的花楸樹和少葉花楸雜交F1代群體的雜種鑒定及遺傳關(guān)系分析

谷艷鵬，張澤人，孫 濤，韓慶軍，栗寧寧，魯儀增，竇德泉,①，鄭 健,①

(1.北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院，北京 102206；2.山東省林草種質(zhì)資源中心，山東 濟(jì)南 250102)

種間雜交可以將不同親本的優(yōu)良性狀集中到雜交子代[1]，是獲得具有豐富表型變異及高抗性優(yōu)良雜種的有效途徑[2,3]。大部分植物從人工授粉、雜交子代繁育、良種選育到產(chǎn)業(yè)化研究和應(yīng)用，均需經(jīng)過漫長的時間，制約了植物雜交育種和新品種選育的效率和進(jìn)程。雜交子代早期鑒定能夠縮短育種年限，加快育種進(jìn)程[4]，因而雜種鑒定是雜交育種進(jìn)程中十分重要的步驟[5,6]。傳統(tǒng)的雜種鑒定主要依賴于植株的外部形態(tài)特征，例如株高、葉片形狀和大小、花形和花色、果形和果色、生長習(xí)性等，但是植株的發(fā)育狀況及外部環(huán)境因子均可能會影響雜種鑒定的準(zhǔn)確性[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物的雜種鑒定。SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記技術(shù)是雜種鑒定中最常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一，已應(yīng)用于梅樹(PrunusmumeSieb.et Zucc.)[8]、紫薇(LagerstroemiaindicaLinn.)[9]和青榨槭(AcerdavidiiFranch.)[10]等園林植物以及大豆〔Glycinemax(Linn.)Merr.〕[11]、落花生(ArachishypogaeaLinn.)[12]、糯玉米(Zeamaysvar.ceratinaKulesh)[13]和甘薯〔Ipomoeabatatas(Linn.)Lam.〕[14]等農(nóng)作物的雜種鑒定和遺傳多樣性分析工作。

花楸樹〔Sorbuspohuashanensis(Hance)Hedl.〕和少葉花楸〔S.hupehensisvar.paucijuga(D.K.Zang et P.C.Huang)L.T.Lu〕均為薔薇科(Rosaceae)花楸屬(SorbusLinn.)落葉喬木?；ㄩ睒涞娜~、花和果觀賞價值均較高，其體內(nèi)富含蛋白質(zhì)、可溶性糖、黃酮類和酚類等多種成分[15-17]，應(yīng)用前景廣闊。然而，由于野生花楸樹原分布于中國北方海拔900～2 500 m的區(qū)域，在低海拔區(qū)域栽培時易受到夏季高溫脅迫[18]，導(dǎo)致植株在越夏時葉片出現(xiàn)“日灼”現(xiàn)象，目前已從分子層面對花楸樹響應(yīng)高溫脅迫及葉片“日灼”機(jī)制開展了系列研究[19-21]。少葉花楸為山東特有的瀕危樹種[22]，生于海拔300～1 000 m的山坡溝邊及林緣，在低海拔區(qū)域生長良好，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性，目前針對少葉花楸的研究主要集中在地理分布[23]、形態(tài)特征[24]、光合特性[25]、染色體核型[26]等方面。通過雜交育種的方法，將少葉花楸的耐熱特性引入花楸樹，可提高花楸樹的耐熱性能，這對選育耐熱或適應(yīng)低海拔地區(qū)種植的花楸樹新品種有重要意義。

為此，作者采用實生苗雜交育種方法，對花楸樹和少葉花楸進(jìn)行種間雜交，并利用EST-SSR標(biāo)記技術(shù)對雜交F1代群體進(jìn)行雜種鑒定及遺傳多樣性和遺傳關(guān)系分析，以期篩選出適宜于花楸樹和少葉花楸雜交后代早期雜種鑒定的分子標(biāo)記，進(jìn)而為花楸屬植物遺傳圖譜構(gòu)建以及耐熱品種中耐熱基因的QTL定位提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料和方法

1.1 材料

以花楸樹為母本(SP)、少葉花楸(SH)為父本，于2020年4月采用常規(guī)人工控制授粉方法進(jìn)行雜交；同年10月采集果實，經(jīng)種實調(diào)制后獲得純凈、飽滿的雜交種子；同年11月將獲得的雜交種子經(jīng)低溫春化處理后，于2021年1月在溫室播種于裝有育苗基質(zhì)〔V(草炭)∶V(蛭石)=3∶1〕的營養(yǎng)缽(直徑12 cm、高12 cm)中；2021年4月將幼苗移栽至花盆(直徑27.5 cm、高31 cm)中，統(tǒng)一水肥管理。有22株子代在育苗過程中死亡，最終獲得184株成活的雜交F1代植株(編號為PH1至PH184)，栽植于北京農(nóng)學(xué)院花楸種質(zhì)資源圃中。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 于2021年4月采集雜交親本及子代幼嫩葉片(每株約100 mg)，利用新型快速植物基因組DNA提取(離心柱型)試劑盒(型號DP3112，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取每個單株葉片基因組DNA；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

1.2.2 引物篩選 使用本課題組開發(fā)的55對EST-SSR引物[27]，委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司，在正向引物的5′端分別添加HEX、FAM、TAMRA和ROX熒光染料接頭，合成熒光引物。以2個親本及隨機(jī)選取的4株F1代單株的基因組DNA為模板進(jìn)行引物篩選。

使用S1000 PCR儀(美國Bio-Rad公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積25.0 μL，包含2×TaqPCR MasterMix(北京愛博森生物科技有限公司)12.5 μL、100.0 ng·μL-1基因組DNA 0.5 μL以及10.0 μmol·L-1正向和反向引物各1.0 μL，并用無菌雙蒸水補(bǔ)足體積。擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、相應(yīng)溫度退火30 s、72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；最后于72 ℃延伸7 min。

用ABI 3730xl DNA分析儀(美國Applied Biosystems公司)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳。取1.0 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，加入8.5 μL去離子甲酰胺和0.5 μL Liz-500分子量內(nèi)標(biāo)，依次于95 ℃變性5 min、4 ℃保溫10 min后，于4 ℃條件下3 000 r·min-1離心1 min后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析；毛細(xì)管電泳條件為13 kV預(yù)電泳3 min；1.5 kV進(jìn)樣10 s；10 kV電泳40 min。根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果篩選出9對在親本中具有多態(tài)性的特異性EST-SSR引物用于雜種鑒定。各引物的基本信息見表1。

表1 用于花楸樹和少葉花楸雜交F1代群體EST-SSR標(biāo)記分析的9對多態(tài)性引物信息

1.2.3 雜種鑒定 以184株雜交F1代單株的基因組DNA為模板，按照前述擴(kuò)增體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳。對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，具有雙親特異位點(diǎn)的雜交后代為真雜種，而雙親位點(diǎn)缺失的雜交后代則需進(jìn)行重復(fù)驗證。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用GeneMarker 2.2.0軟件對毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，將每個峰值的位置與泳道中的GeneScan500LIZ分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)進(jìn)行比較，讀取擴(kuò)增片段長度，記錄等位基因。

使用POPGENE 32軟件計算雜交F1代群體的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、期望雜合度、觀測雜合度和遺傳距離；使用CERVUS 3.0軟件統(tǒng)計每個EST-SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量；基于遺傳距離，使用MEGA 7.0軟件對雙親和雜交F1代群體進(jìn)行UPGMA聚類分析。

用a、b、c、d對不同等位基因進(jìn)行標(biāo)記，利用SPSS 26.0軟件中的卡方(χ2)擬合優(yōu)度檢驗對雜交F1代群體的基因型分離情況進(jìn)行分析[28]，以確定基因型分離情況與孟德爾分離定律的符合程度。

2 結(jié)果和分析

2.1 雜交F1代單株的雜種鑒定結(jié)果

根據(jù)9對EST-SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果獲得花楸樹和少葉花楸及其雜交F1代的基因型。在184株F1代單株中，有9株F1代單株分別在3～7個位點(diǎn)上出現(xiàn)異?；蛐停糉1代單株總數(shù)的4.9%；有175株單株在9個EST-SSR位點(diǎn)上均擴(kuò)增出雙親條帶，這些單株均可認(rèn)為是真雜種后代，雜種率達(dá)95.1%。

由9對EST-SSR引物在親本和9株異常F1代單株中的擴(kuò)增結(jié)果(表2)可見：在出現(xiàn)異?；蛐偷腇1代單株中，PH1有6個位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶的缺失，其中3個位點(diǎn)擴(kuò)增出新條帶；PH4有6個位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，其中3個位點(diǎn)擴(kuò)增出新條帶；PH6有5個位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，除sors51外，另4個位點(diǎn)均擴(kuò)增出新條帶；PH7有4個位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，其中2個位點(diǎn)擴(kuò)增出新條帶；PH8有3個位點(diǎn)出現(xiàn)母本條帶缺失，其中2個位點(diǎn)擴(kuò)增出新條帶；PH9有4個位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，其中2個位點(diǎn)擴(kuò)增出新條帶；PH10有7個位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，除sors51位點(diǎn)外，其他6個位點(diǎn)均擴(kuò)增出新條帶；PH19有6個位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，這6個位點(diǎn)均擴(kuò)增出新條帶；PH26有6個位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，除sors51位點(diǎn)外，其他5個位點(diǎn)均擴(kuò)增出新條帶。

表2 9對EST-SSR引物在親本及9株異常F1代中的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 雜交F1代中真雜種單株的基因分離規(guī)律

依據(jù)9對EST-SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果對花楸樹和少葉花楸雜交F1代175株真雜種的基因分離規(guī)律進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

由表3可見：引物sorsd29在親本中的擴(kuò)增結(jié)果為aa×bb型，即純合互補(bǔ)型；引物sorsd39、sors51和sors85在親本中的擴(kuò)增結(jié)果為aa×bc型，即父本型；引物sors33和sors89在親本中的擴(kuò)增結(jié)果為ab×cd型，即雙親互補(bǔ)型；引物sors60、sors71和sorsk10在親本中的擴(kuò)增結(jié)果為ab×ac型，即雜合互補(bǔ)型[28]。

表3 基于9對EST-SSR引物擴(kuò)增結(jié)果的花楸樹和少葉花楸雜交F1代中175株真雜種的基因分離規(guī)律

由表3還可見：由于引物sorsd29在親本中的擴(kuò)增結(jié)果為純合互補(bǔ)型，因而，其F1代175株真雜種均未出現(xiàn)基因分離現(xiàn)象，基因型均為ab型。另8對引物在這175株F1代真雜種中的擴(kuò)增結(jié)果均出現(xiàn)基因分離現(xiàn)象，其中，引物sorsd39、sors51和sors85在F1代中的擴(kuò)增結(jié)果呈現(xiàn)2種基因型，即ab和ac，分離比略有不同，但均接近1∶1，經(jīng)χ2檢驗，與期望分離比無顯著(P>0.05)差異；引物sors33和sors89在F1代中的擴(kuò)增結(jié)果呈現(xiàn)4種基因型，即ac、ad、bc和bd；引物sors60、sors71和sorsk10在F1代中的擴(kuò)增結(jié)果也呈現(xiàn)4種基因型，即aa、ac、ab和bc，這5對引物擴(kuò)增結(jié)果呈現(xiàn)的4種基因型在F1代群體中的分離比存在一定差異，但經(jīng)χ2檢驗，與期望分離比(1∶1∶1∶1)均無顯著差異，表明在花楸樹和少葉花楸的雜交F1代中，上述8對EST-SSR引物對應(yīng)位點(diǎn)的基因型均符合孟德爾分離定律。

2.3 雜交F1代中真雜種的遺傳多樣性

依據(jù)9對EST-SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果對花楸樹和少葉花楸雜交F1代中175株真雜種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。

由表4可見：9個EST-SSR位點(diǎn)共包含28個等位基因，均值為3.1；有效等位基因數(shù)為2.0～4.0，均值為2.9；多態(tài)性信息含量和Shannon’s信息指數(shù)分別為0.375～0.705和0.693～1.386，均值分別為0.566和1.076；觀測雜合度和期望雜合度分別為0.737～1.000和0.501～0.752，均值分別為0.920和0.640。總體上看，sors33和sors89 位點(diǎn)的各項遺傳多樣性指數(shù)均較大，sorsd29位點(diǎn)的各項遺傳多樣性指數(shù)均最小。

表4 基于9對EST-SSR引物擴(kuò)增結(jié)果的花楸樹和少葉花楸雜交F1代175株真雜種的遺傳多樣性

2.4 親本與雜交F1代真雜種的聚類分析

依據(jù)花楸樹和少葉花楸及其雜交F1代175株真雜種的Nei’s遺傳距離，采用UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖，結(jié)果見圖1。

SP: 花楸樹(母本)Sorbus pohuashanensis(Hance)Hedl.(female parent); SH: 少葉花楸(父本)S.hupehensis var.paucijuga(D.K.Zang et P.C.Huang)L.T.Lu(male parent); PH: 雜交F1代單株Hybrid individuals of F1 generation.

由圖1可見：在Nei’s遺傳距離0.28處，供試樣本分為2組，其中少葉花楸單獨(dú)為組Ⅰ，花楸樹和175株F1代單株聚為組Ⅱ。在Nei’s遺傳距離0.24處，組Ⅱ分為2個亞組，其中81株F1代單株聚為亞組Ⅱ1，占F1代真雜種總數(shù)的46.3%；另94株F1代單株與花楸樹聚為亞組Ⅱ2，占F1代真雜種總數(shù)的53.7%?？傮w上看，175株F1代單株與花楸樹有較近的遺傳關(guān)系。

3 討論和結(jié)論

在植物雜種鑒定方面，分子標(biāo)記可從基因組水平上揭示雜交種與親本之間的遺傳差異，且不受環(huán)境條件和生長發(fā)育狀況的影響，能夠在幼苗早期進(jìn)行鑒定[29]。本研究使用9對EST-SSR引物對花楸樹和少葉花楸的184株雜交F1代進(jìn)行了雜種鑒定，其中175株被鑒定為真雜種，雜種率達(dá)95.1%，其余9株單株的擴(kuò)增結(jié)果中存在缺失雙親條帶或出現(xiàn)新條帶的現(xiàn)象，在F1代單株中出現(xiàn)新條帶的原因可能有2個：一是在減數(shù)分裂過程中發(fā)生基因重組或突變[30]，二是在花粉采集和去雄或人工授粉過程中出現(xiàn)花粉污染的情況。

當(dāng)雜交群體受到選擇、突變、遺傳漂變等影響時，子代的基因型比例會偏離孟德爾遺傳定律，這種現(xiàn)象被稱為偏分離[31]；基因偏分離現(xiàn)象會影響標(biāo)記間的重組率，從而影響植物的遺傳作圖[32]。周寧寧等[33]對月季(RosachinensisJacq.)雜交F1代基因型的分離情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在20個SSR標(biāo)記中有9個標(biāo)記產(chǎn)生了偏分離；汪國云等[34]對楊梅(MyricarubraSieb.et Zucc.)雜交群體的研究結(jié)果表明，8個SSR標(biāo)記中有2個標(biāo)記產(chǎn)生了偏分離。本研究中，除9株F1代單株出現(xiàn)異?；蛐屯猓?75株雜交F1代真雜種中有8個位點(diǎn)的分離比符合孟德爾分離定律，未發(fā)生顯著的雜種偏分離現(xiàn)象，說明親本間的基因兼容性較高[35]，也進(jìn)一步支持了“在花楸屬種類中花楸樹與少葉花楸的遺傳距離相對較近”[36]的研究結(jié)果。然而，花楸樹與少葉花楸在分布區(qū)域、生長習(xí)性、表型性狀(特別是小葉數(shù)量)及抗熱性上有較大差異，通過種間雜交可以選育綜合雙親優(yōu)良性狀的雜種后代。此外，本研究中所有的標(biāo)記均未發(fā)生偏分離，進(jìn)一步表明所選的9對EST-SSR引物均可用于構(gòu)建花楸樹與少葉花楸雜交F1群體的遺傳圖譜。

SSR標(biāo)記具有數(shù)量大、多態(tài)性高、共顯性、可靠性高和多等位基因檢測等優(yōu)點(diǎn)[37]。本研究使用的9對EST-SSR引物在175株F1代真雜種中共擴(kuò)增出28個等位基因，平均每個位點(diǎn)3.1個等位基因，平均有效等位基因數(shù)為2.9。多態(tài)性信息含量是評價引物的多態(tài)性的重要指標(biāo)，多態(tài)性信息含量大于0.50，說明引物的多態(tài)性水平高；多態(tài)性信息含量小于0.25，則說明引物的多態(tài)性水平低[38]。本研究中，9對EST-SSR引物的平均多態(tài)性信息含量為0.566，除引物sorsd29的多態(tài)性信息含量小于0.5外，其他8對EST-SSR引物的多態(tài)性信息含量均大于0.5，表明本研究篩選出來的EST-SSR引物具有較高的多態(tài)性。

SSR標(biāo)記多用于植物天然群體遺傳多樣性分析[39,40]，但在人工雜交群體的遺傳多樣性研究中應(yīng)用尚不廣泛，目前已應(yīng)用于茶樹〔Camelliasinensis(Linn.)O.Ktze.〕[41]、牡丹(Paeonia×suffruticosaAndr.)[42]和紫薇[43]等栽培植物的雜交群體遺傳多樣性研究和遺傳變異分析。本研究采用EST-SSR標(biāo)記研究了花楸樹和少葉花楸雜交F1代群體的遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果顯示該雜交F1代群體的Shannon’s信息指數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度等遺傳多樣性參數(shù)均略高于茶樹、牡丹和紫薇等樹種的雜交F1代群體，表明花楸樹和少葉花楸的雜交F1代群體遺傳變異顯著、遺傳多樣性豐富，說明EST-SSR標(biāo)記可應(yīng)用于花楸屬種類雜交后代群體的遺傳多樣性研究和雜種鑒定。

花楸樹和少葉花楸雜交F1代真雜種群體具有豐富的遺傳變異，但聚類分析結(jié)果顯示F1代群體與母本聚為一組，而父本則獨(dú)立成組，說明花楸樹和少葉花楸雜交F1代真雜種群體與母本的遺傳關(guān)系較近，這一現(xiàn)象也存在于甘蔗(Saccharumspp.)和蔗茅(ErianthusfluvusNess)[44]、棗(ZiziphusjujubaMill.)和酸棗(Z.acidojujubaCheng et Liu)[45]以及菊花腦(ChrysanthemumnankingenseHand.-Mazt.)和甘菊〔C.lavandulifolium(Fisch.ex Trautv.)Makino〕[46]的雜交F1代群體與親本的遺傳關(guān)系中。這一現(xiàn)象一方面可能與親本的遺傳物質(zhì)傳遞直接相關(guān)，另一方面也與所用引物數(shù)量及引物特征間接相關(guān)[45]。雖然本研究使用的9個EST-SSR標(biāo)記能鑒定出花楸樹和少葉花楸雜交F1代的真雜種，并分析其遺傳多樣性，但是總體來看，使用的EST-SSR標(biāo)記數(shù)量相對較少，且并未發(fā)現(xiàn)這9個標(biāo)記與葉片“日灼”現(xiàn)象有關(guān)，故本研究中所有F1代單株與母本聚為一類，并不能確定這些F1代單株是否與母本同樣表現(xiàn)出在越夏時葉片出現(xiàn)“日灼”現(xiàn)象，因此，后續(xù)需對這些雜交F1代群體的表型性狀變異進(jìn)行深入研究，特別是葉片“日灼”等與抗熱性有關(guān)的性狀，或者開發(fā)與抗熱性狀相關(guān)聯(lián)的EST-SSR標(biāo)記。

總之，本研究以花楸樹為母本、少葉花楸為父本，成功進(jìn)行了種間雜交并獲得了175個雜種單株構(gòu)成的雜交F1代群體，且雜交群體具有豐富的遺傳多樣性。篩選出的9對EST-SSR引物多態(tài)性較高，且在雜交群體中未出現(xiàn)明顯偏分離，可用于后續(xù)遺傳圖譜的構(gòu)建及QTL定位。