喜樹堿在肝動脈化療栓塞術(shù)中的作用及其機制

王鑫磊，馮博

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院介入治療科，沈陽 110001）

肝動脈化療栓塞術(shù)是無法手術(shù)切除的Ⅰb～Ⅲa期肝癌患者的首選治療方案。但術(shù)中注入的化療藥物耐藥問題一直未能解決，導(dǎo)致患者多次行肝動脈化療栓塞術(shù)后療效不佳。因此，尋找化療藥物增敏劑成為目前研究的熱點。以往研究［1］已經(jīng)證明喜樹堿可以作為有效的化療增敏劑來增強肝癌對化療的敏感性。喜樹堿在肝動脈化療栓塞術(shù)中的應(yīng)用情況鮮有報道。NRF2是評價腫瘤細胞化療敏感性指標，與腫瘤細胞對化療的敏感性呈負相關(guān)；Ki-67是評價腫瘤細胞增殖活躍程度指標，與腫瘤細胞增殖活性正相關(guān)［1］。本研究在建立兔VX2肝癌模型并進行肝動脈化療栓塞術(shù)的基礎(chǔ)上，檢測其肝功能及NRF2、Ki-67的表達情況，探討喜樹堿在肝動脈化療栓塞術(shù)中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

家兔，雌雄不限，體質(zhì)量約2.5 kg，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。兔VX2瘤株購自通派（上海）生物科技有限公司，喜樹堿（20 mg/支）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，阿霉素購自輝瑞制藥有限公司，NRF2、ki-67免疫組化試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司。

1.2 兔VX2肝癌模型建立及分組

將儲存于-80 ℃冰箱中的兔VX2瘤株水浴箱中解凍，然后使用眼科剪、刀片等器械將瘤株切成約1 mm3體積，使用注射器將切好的瘤株與少量生理鹽水混合后，注射于家兔后腿肌群中，10 d后腫瘤生長至1 cm3左右時處死家兔，將腫瘤整體取出并去除多余筋膜等組織。使用眼科剪、刀片等手術(shù)器械切取腫瘤活性部分，并將活性腫瘤切成直徑約2～3 mm瘤塊。家兔使用速眠新及戊巴比妥鈉全身麻醉后腹白線開腹，直視條件下將處理好的瘤塊種植于肝臟內(nèi)約1 cm深處，使用組織膠封堵肝臟創(chuàng)口，縫合開腹部位。3 d后MRI（1.5T，日本西門子公司）掃描確認腫瘤種植成功即模型建立成功。將腫瘤種植成功的家兔隨機分為4組：單純栓塞組（A組）、栓塞聯(lián)合喜樹堿組（B組）、栓塞聯(lián)合阿霉素組（C組）、栓塞聯(lián)合喜樹堿與阿霉素組（D組），每組6只。

1.3 肝動脈栓塞術(shù)

家兔靜脈注射苯巴比妥（30 mg/kg）進行全身麻醉。5%硫化鈉涂抹于右腹股溝區(qū)脫毛后將兔四肢外展固定于手術(shù)臺上，在右側(cè)腹股溝區(qū)股動脈搏動最強處使用柳葉刀片縱行切開（約2～3 mm），鈍性分離出股動脈。直視下使用20G動脈穿刺針及穿刺鞘沿股動脈走形方向逆行穿刺進股動脈。見針尾有鮮紅動脈血噴出后推進穿刺鞘拔出穿刺針。從穿刺鞘內(nèi)送入0.018微導(dǎo)管及微導(dǎo)絲，于動物專用數(shù)字減影血管造影系統(tǒng)（日本西門子公司）下經(jīng)股動脈、髂動脈進入腹主動脈胸腰椎交界處水平，見“嵌入”現(xiàn)象即為兔腹腔動脈開口處。在數(shù)字減影血管造影系統(tǒng)透視下沿微導(dǎo)管注入造影劑進行造影，可清晰顯示肝內(nèi)血管走形及微弱腫瘤染色。盡可能將微導(dǎo)管超選擇進入腫瘤供血血管，對各組家兔進行腫瘤供血動脈碘油栓塞（栓塞終點為再次造影提示靶血管血流中斷且腫瘤染色消失）及藥物灌注。A組僅進行腫瘤供血動脈栓塞；B組在腫瘤供血動脈栓塞時進行喜樹堿（2 mg/kg）灌注；C組在腫瘤供血動脈栓塞時進行阿霉素（1 mg/kg）灌注，D組在腫瘤供血動脈栓塞時進行喜樹堿（2 mg/kg）、阿霉素（1 mg/kg）灌注。手術(shù)完成后拔管并用明膠海綿條填塞穿刺點周圍，壓迫止血5～10 min，無明顯大出血后縫合切口。家兔均肌肉注射青霉素（80萬U）預(yù)防感染并加強清潔護理。

1.4 肝功能及腫瘤生長檢測

分別于肝動脈栓塞術(shù)術(shù)前1 d、術(shù)后3、7 d獲取家兔血清，利用日立7600系列全自動生化分析儀檢測肝功能指標［谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）］。分別于術(shù)前1 d、術(shù)后7 d使用1.5T MRI檢查肝腫瘤體積，測量腫瘤最大截面的長徑（L）和短徑（W），計算腫瘤體積（V）：V=π/6×L×W2。腫瘤生長率=術(shù)后腫瘤體積/術(shù)前腫瘤體積×100%。

1.5 HE染色

于術(shù)后7 d處死家兔，取出肝臟組織，切成1 cm3左右的組織塊，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片（4 μm）。將石蠟切片進行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤的細胞形態(tài)。

1.6 免疫組化檢測Ki-67、NRF2表達

將固定好的腫瘤石蠟標本切片脫蠟、水化后，PBS 沖洗 3 次，每次 3 min，根據(jù)抗體要求修復(fù)組織抗原，固定切片，切片滴加過氧化酶，室溫下孵育 10 min。PBS沖洗后加入免疫染色封閉液封閉60 min。吸盡封閉液后立即加入一抗（1 ∶200），室溫孵育1 h。加入免疫染色洗滌液洗滌3次。加入二抗（1 ∶500）室溫孵育1 h。然后加入免疫染色洗滌液洗滌3次。復(fù)染后顯微鏡觀察。利用IHC Profiler插件對染色情況進行自動化評分；Trainable Weka Segmentation插件分別計數(shù)陽性細胞和陰性細胞。利用ImageJ采集圖像并分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗或方差分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝動脈栓塞術(shù)術(shù)前及術(shù)后肝功能指標比較

結(jié)果顯示，4組術(shù)前ALT及AST均約為50 U/L（正常參考值上限）。A組術(shù)后3 d、7 d時ALT及AST水平與術(shù)前比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05）。B組術(shù)后3 d、7 d時ALT及AST水平高于術(shù)前（P＜ 0.05）。C組、D組術(shù)后3 d時ALT及AST水平均升高（約參考值上限的2～3倍），術(shù)后7 d下降（約參考值上限2倍以下），與術(shù)前比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜ 0.05）。見圖1。

圖1 各組肝動脈栓塞術(shù)術(shù)前及術(shù)后ALT、AST水平比較Fig.1 Comparison of ALT and AST levels before and after hepatic artery embolization

2.2 各組腫瘤生長率

結(jié)果顯示，A、B、C、D組腫瘤生長率分別為（599.29 ±196.85）%、（421.66±267.38）%、（208.54±131.42）%、（93.04±60.40）%。與A組比較，C、D組 腫瘤生長率均降低（P＜ 0.01），而D組降低更顯著（P＜0.001）。

2.3 各組HE染色結(jié)果

結(jié)果顯示，A組腫瘤細胞核質(zhì)比高，核分裂易見，細胞增殖旺盛；B組腫瘤細胞核質(zhì)比高，核分裂易見，伴有彌散的淋巴細胞浸潤；C組腫瘤細胞全部壞死，周圍可見大面積增生的結(jié)締組織，伴有較少的淋巴細胞浸潤，并可見局部有膽管增生；D組腫瘤細胞核質(zhì)比高，局部可見大量腫瘤細胞壞死，組織中可見大面積結(jié)締組織增生，伴有彌散的淋巴細胞浸潤，見圖2。

圖2 各組HE染色結(jié)果×200Fig.2 The results of HE staining in each group ×200

2.4 各組Ki-67、NRF2蛋白表達比較

結(jié)果顯示，與A組比較，B、C、D組Ki-67表達均降低（P＜ 0.01）；與B、C組比較，D組Ki-67表達明顯降低（P＜ 0.001）。與A組、C組比較，B組、D組NRF2表達顯著降低（P＜ 0.001），而其他組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞ 0.05）。見表1、圖3、圖4。

圖3 各組Ki-67 蛋白表達水平比較 ×200Fig.3 Comparison of Ki-67 protein expression in each group ×200

圖4 各組NRF2 蛋白表達比較 ×200Fig.4 Comparison of NRF2 protein expression in each group ×200

表1 各組Ki-67、NRF2表達水平比較Tab.1 Expression of Ki-67 and NRF2 in each group

3 討論

化療藥物的耐藥問題一直是腫瘤治療的主要障礙。目前已經(jīng)確定了多種機制，包括藥物代謝、DNA修復(fù)增強和癌細胞凋亡減少等［2-5］，研究［6］顯示大部分機制中均有NRF2參與。根據(jù)全外顯子組測序研究［7-9］顯示，NFE2L2（NRF2，6.4%）或KEAP1（8%）基因在人類肝癌中發(fā)生突變；這些突變改變KEAP1和NRF2之間的相互作用，并導(dǎo)致NRF2處于持續(xù)激活狀態(tài)［10-11］。此外，這些突變往往發(fā)生在晚期肝癌中，表明NRF2過度激活可能會導(dǎo)致肝細胞性肝癌進展［9，12］。除了KEAP1和NFE2L2突變，p62增加與肝癌中NRF2激活增強呈正相關(guān)［13-14］。已有研究［15］證實，p62引起的NRF2持續(xù)激活參與了人類肝癌對索拉非尼和順鉑的耐藥。因此，NRF2是解決癌癥治療中化療藥物耐藥的重要標靶。

喜樹堿是從中藥植物喜樹堿中分離出來的天然生物堿，是新型的NRF2-ARE激活抑制劑，與其他已知的NRF2-ARE抑制劑（異煙肼、乙酰胺）比較，喜樹堿具有在較低濃度下即有效的優(yōu)勢。因此被認為是一種有效的抗腫瘤藥物，已應(yīng)用于治療多種腫瘤（結(jié)腸癌、胃癌等）［16］。臨床應(yīng)用中喜樹堿一直受到溶解性差（水中為3.122 mmol/L）、腹瀉、出血性膀胱炎和骨髓抑制等不良反應(yīng)的限制［17］。目前研究［1］表明，喜樹堿是有效的NRF2抑制劑，在肝動脈化療栓塞術(shù)中使用時的濃度遠低于作為直接抗腫瘤藥物的濃度。藥物劑量更小且直接作用于腫瘤瘤體內(nèi)，不但能顯著降低不良反應(yīng)，而且增加腫瘤對化療藥物的敏感性。與傳統(tǒng)肝動脈化療栓塞術(shù)比較，加入喜樹堿時治療效果更佳。

本研究結(jié)果顯示，A組術(shù)后ALT、AST未出現(xiàn)明顯升高，B組、C組、D組術(shù)后ALT、AST升高之后隨后下降，4組均未出現(xiàn)嚴重不可逆的肝功能異常。HE染色結(jié)果顯示，D組腫瘤細胞不僅大量壞死，且伴有彌漫淋巴細胞浸潤，B組腫瘤細胞也伴有大量淋巴細胞浸潤，B組與D組在術(shù)中均使用喜樹堿，2組均出現(xiàn)大量的淋巴細胞浸潤，可能與喜樹堿增加了細胞毒性T淋巴細胞反應(yīng)，從而增強機體對腫瘤的免疫反應(yīng)相關(guān)［18］。本研究結(jié)果顯示D組腫瘤生長率最低；而且Ki-67表達也最低，這說明在傳統(tǒng)的栓塞聯(lián)合阿霉素的治療中加入喜樹堿可以更好抑制腫瘤生長。另外發(fā)現(xiàn)使用喜樹堿的B組、D組NRF2表達與A組比較明顯降低（P＜ 0.001），說明喜樹堿對腫瘤的抑制與NRF2表達相關(guān)。

綜上所述，喜樹堿可明顯提高兔VX2肝癌模型肝動脈化療栓塞術(shù)的治療效果，其作用可能是通過抑制NRF2表達來實現(xiàn)的。本研究僅為動物實驗，將喜樹堿作為解決肝癌化療藥物耐藥的新的治療方法仍需要進一步研究。