基于公共數據庫分析TNFAIP2在腎透明細胞癌中的表達及臨床意義

薛東煒，李明山，劉嘉，祝興旺

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110032）

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿生殖系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的80%～90%，占全身惡性腫瘤的2%～3%。自1975年以來，RCC的發(fā)病率以每年2%～4%的速度增長［1］。RCC的組織學亞型包括透明細胞RCC（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）、乳頭狀RCC和嫌色RCC，其中ccRCC是腎癌的最常見亞型［2］，其進展和預后受多種復雜基因的控制［3］。外科手術切除腫瘤是治療ccRCC的有效方法，盡管如此，仍有20%～38%的ccRCC患者術后發(fā)生進展和轉移［4］。因此，對ccRCC發(fā)生發(fā)展過程中基因表達變化的研究至關重要，有助于識別腎癌新的診斷和預后生物標志物，提供新的治療靶點［5］。近年來研究發(fā)現，腫瘤壞死因子α誘導蛋白（tumor necrosis factor-α-induced protein，TNFAIPs）家族參與了細胞凋亡和分化、信號傳導等多種生物學過程［6］，而TNFAIP2作為該家族中的重要一員，可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［7］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：正常腎小管上皮細胞系HK-2和人RCC細胞系786-O、ACHN（上海素爾生物科技有限公司）用含10%胎牛血清（美國Invitrogen公司）、10 U/mL青霉素和100 U/mL 鏈霉素（美國Invitrogen公司）的DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。

1.1.2 組織：正常腎臟組織和ccRCC組織（24對）來自中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院泌尿外科手術切除的標本。

1.2 方法

1.2.1 數據庫分析：應用TIMER2.0數據庫（http：//timer.comp-genomics.org/）分析TNFAIP2在泛癌中的表達情況及其與免疫細胞表達的相關性［8］；應用UALCAN數據集（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）下載癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中ccRCC組織的TNFAIP2mRNA表達數據庫，對TNFAIP2mRNA的表達與臨床病理參數之間的相關性進行分析，應用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）進行ccRCC差異基因的富集分析。應用Kaplan-Meier曲線（Kaplan-Meier Plotter，http：//www.kmplot.com）數據庫網站分析TNFAIP2表達與ccRCC數據庫中患者預后的關系。

1.2.2 Western blotting：用裂解緩沖液裂解細胞，裂解物上樣（40 μg/泳道）行SDS-PAGE電泳，蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入1：2 000稀釋抗TNFAIP2抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司）、抗 GAPDH 抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司）4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次，加入二抗孵育90 min，TBST洗膜3次。用增強化學發(fā)光可視化系統(tǒng)（BeyoECL Plus，中國上海Beyotime 生物技術研究所）進行檢測。

1.2.3 實時PCR檢測：用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）從組織中分離總RNA。按照The master mix reagent（美國Applied Biosystems公司）說明書行實時 PCR，反應體系15 μL，包括TB Green 7.5 μL，ROX 0.3 μL，引物各0.3 μL，ddH2O 5.6 μL，cDNA 1 μL。反應條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，40個周期。TNFAIP2正向引物序列為5’-CCCCAATGACATCATCAACA-3’，反向引物序列為5’-GCCTCACTGGACAGGAATG T-3’［9］；GAPDH作內參照，正向引物序列為5’-GAAG GTGAAGGTCGGAGTC-3’，反向引物序列為5’-GAAG ATGGTGATGGGATTTC-3’。用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0和Graphpad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析。用 Pearson χ2檢驗分析TNFAIP2表達水平與ccRCC 的臨床病理參數之間的相關性。用Kaplan-Meier曲線分析TNFAIP2表達水平與ccRCC患者預后之間的相關性。用TNFAIP2表達的受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估TNFAIP2對ccRCC的診斷效能，并計算曲線下面積（area under curve，AUC）。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TNFAIP2在ccRCC中的表達

TIMER2.0數據庫分析結果顯示，TNFAIP2在ccRCC組織中異常高表達（P＜ 0.001），見圖1。ONCOMINE數據庫分析結果顯示，ccRCCTNFAIP2表達轉錄水平與正常組織比較有統(tǒng)計學差異［10-11］。TCGA、UALCAN、TIMER2.0數據庫分析結果顯示，TNFAIP2在ccRCC中高表達，并與腫瘤的分期、分級、淋巴結轉移、免疫細胞Th1和Treg豐度密切相關，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001），見圖2～3。KEGG通路的富集分析結果顯示，ccRCC參與包括TNF信號通路在內的TOP20通路，見圖4。

圖1 TNFAIP2在泛癌中的表達情況Fig.1 TNFAIP2 expression in pan-cancer

圖2 TNFAIP2在ccRCC中的表達情況及其與分期、分級、淋巴轉移的關系Fig.2 The expression of TNFAIP2 in ccRCC and its relationship with staging，grade，and lymphatic metastasis

圖3 腎癌中TNFAIP2的表達與免疫Th1細胞、Treg細胞的相關性Fig.3 Correlation between the expression of TNFAIP2 and immune Th1 cells and Treg cells in renal cell carcinoma

圖4 ccRCC差異免疫基因KEGG富集途徑分析Fig.4 KEGG enrichment pathway analysis of differential immune genes in ccRCC

2.2 TNFAIP2與ccRCC患者預后的關系

Kaplan-Meier曲線分析表明TNFAIP2表達水平與患者的預后顯著相關，TNFAIP2mRNA高表達提示ccCRCC患者病情惡化及總生存期縮短（P＜ 0.001）；通過ROC曲線評估TNFAIP2mRNA表達對ccRCC的診斷效能，結果顯示，AUC=0.814，95%CI：0.796～0.887（P＜ 0.001），見圖5。

圖5 TNFAIP2與ccRCC患者預后的關系Fig.5 Relationship between TNFAIP2 and prognosis of ccRCC patients

2.3 TNFAIP2在腎癌細胞系和腎癌組織中的表達水平

Western blotting結果顯示，與人腎臟正常細胞系HK-2比較，腎癌786-O、ACHN細胞中TNFAIP2蛋白表達水平均明顯升高，見圖6。實時PCR檢測結果顯示，腎癌組織中TNFAIP2mRNA的表達量明顯高于對應的癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001），見圖7。

圖6 TNFAIP2在腎癌細胞系中的表達情況Fig.6 The expression of TNFAIP2 in renal cancer cell lines

圖7 TNFAIP2 mRNA在腎癌組織和正常腎組織中的表達Fig.7 The expression of TNFAIP2 mRNA in kidney cancer tissues and normal kidney tissues

3 討論

ccCRCC被認為是免疫浸潤性腫瘤，免疫治療具有革命性的前景［12］。但腫瘤微環(huán)境的異質性促進了治療抵抗，從而導致ccCRCC預后不良［13］。TNFAIPs包括TNFAIP1～TNFAIP8，均為促凋亡蛋白［14］，其中TNFAIP2 最初被認為是人類內皮細胞中的一種新的腫瘤壞死因子α誘導基因，可能通過誘導TNFAIP2mRNA 表達，在細胞凋亡中發(fā)揮作用［15］。王斌等［16］研究發(fā)現，下調TNFAIP2可通過激活 Wnt/β-catenin 信號通路，抑制食管鱗狀細胞癌的增殖和轉移。但是TNFAIP2在ccRCC中的作用卻鮮為人知，因此，本研究基于公共數據庫分析TNFAIP2在ccCRCC中的表達情況及其與臨床病理特征的相關性，并通過體外實驗進行驗證。

本研究中，利用公共數據庫TIMER2.0、TCGA、ONCOMINE和UALCAN進行生物信息分析，發(fā)現TNFAIP2在ccRCC組織中異常高表達，且與腫瘤的分期、分級、淋巴結轉移相關（P＜ 0.001），而TNFAIP2高表達亦能提示病情惡化及總生存期縮短，與其他研究［17］結果一致。

對人腎臟正常細胞系HK-2、腎癌細胞系786-O、ACHN中TNFAIP2表達水平的進一步研究發(fā)現，腎癌細胞中TNFAIP2蛋白表達水平顯著增高，TNFAIP2mRNA在ccCRCC組織中的表達量顯著高于癌旁正常腎臟組織。提示TNFAIP2可能參與了腎癌的發(fā)生發(fā)展過程。雖然化療、免疫治療及靶向治療是轉移性和進展性腎癌重要的治療手段，而ccRCC對化療卻具有高度耐藥性［18-19］。文獻［20］報道，TNFAIP2高表達可誘導上皮-間質轉化，并導致尿路上皮癌細胞對化療藥物產生耐藥。本研究發(fā)現TNFAIP2表達與免疫細胞Th1和Treg豐度呈正相關，這為今后腎癌的免疫治療和化療提供了新的思路，未來有待進一步研究探討。

綜上所述，TNFAIP2在ccCRCC中的高表達與患者的預后有關，因此，TNFAIP2有可能成為ccRCC早期診斷和預后評價的生物標志物之一，可能為腎癌的靶向治療提供新的方向和策略。