具核梭桿菌激活Wnt/β-catenin信號通路促進結(jié)直腸癌細胞化療耐藥

魏攀鳳，鄒智勇，莊伊凡 (.泉州醫(yī)學高等?？茖W?；A(chǔ)醫(yī)學部，福建 泉州 36000；.廈門市思明區(qū)梧村街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心全科醫(yī)學，福建 廈門 36000；3.廈門大學附屬中山醫(yī)院胃腸外科/廈門大學醫(yī)學院胃腸腫瘤研究所，福建 廈門 36000)

根據(jù)2020年全球癌癥報告，結(jié)直腸癌的新發(fā)病例和病死率均排在前5位[1]，晚期結(jié)直腸癌患者的5年生存率低于10%[2]。目前化療仍然是晚期結(jié)直腸癌最重要的輔助治療方法，然而固有或獲得性耐藥嚴重影響其治療效果[2-3]。隨著慢性病腸道起源學說[4]研究的深入，證實多種化療[2,5]和免疫治療[6]方案的有效性均與體內(nèi)微生物組相關(guān)。

具核梭桿菌(fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)主要定植于口腔，是一種普遍存在的促炎自源性細菌，與食管癌、結(jié)直腸癌等的發(fā)生密切相關(guān)[7]。Zhang等[8]的研究顯示，唾液腺Fn基因可作為結(jié)直腸癌的潛在生物標志物，且Fn基因表達水平與結(jié)直腸癌患者的總生存期和無病生存期存在相關(guān)性。還有研究報道了Fn感染與結(jié)直腸癌[9]和食管鱗狀細胞癌[10]化療耐藥性的潛在關(guān)系，但Fn的具體誘導效應(yīng)和相關(guān)的分子機制尚不明確。因此，本研究擬建立Fn與結(jié)直腸癌細胞共培養(yǎng)模型，探討其在結(jié)直腸癌化療中誘導耐藥的作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Fn標準株ATCC 25586(美國菌種保藏中心)；人結(jié)直腸癌細胞株HCT-116(中國科學院上海細胞庫)；腦心浸出液肉湯(BHI)細菌培養(yǎng)基(北京華越洋生物)、RPMI 1640細胞培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU；美國Selleck Chemicals公司)；噻唑藍(MTT)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Annexin V/PI染色試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司)；Pierce BCA Protein試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗人多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein,MRP1)、P糖蛋白(P-glycolprotein,P-gp)、Wnt2、β-catenin、β-actin多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗干預與分組

將HCT-116細胞水浴復蘇，在37 ℃、5% CO2、含10%胎牛血清的MyCoy’s 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞生長至80%～90%融合時，胰酶消化，傳代培養(yǎng)。將細胞配成5×106/mL的細胞懸液備用。將Fn凍干粉接種在BHI-s血瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，重復洗滌，棄上清，用比濁法計算細菌濃度，調(diào)節(jié)細菌濃度至1×108/mL備用。參照Ma等[11]的方法，將Fn和HCT-116細胞按照病毒感染復數(shù)為100∶1的比例混合，于37 ℃、5% CO2中孵育12 h，制備細菌—細胞共培養(yǎng)(bacteria-cell co-culture,BCC)模型。

本研究設(shè)置4個組，將常規(guī)培養(yǎng)的HCT-116細胞設(shè)為對照組；Fn與HCT-116細胞共培養(yǎng)設(shè)為BCC組；采用5-FU(1.5 μmol·L-1)分別干預生長良好的對照組及BBC組細胞，并設(shè)為5-FU組和BCC+5-FU組。每組設(shè)5個復孔，實驗重復3次。

1.3 MTT試驗檢測細胞活力

收集各組細胞，按每孔200 μL的密度接種于96孔板，加入不同濃度5-FU(低濃度20 μmol·L-1、中濃度40 μmol·L-1、高濃度80 μmol·L-1)進行干預，37 ℃、5%CO2孵育24 h。棄去原培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO水平振蕩溶解晶體，置于酶標儀檢測各孔的吸光度OD值(490 nm)，評估細胞活力。

1.4 細胞集落形成實驗檢測細胞增殖能力

取對數(shù)生長期的各組細胞，按照2×103個/孔的密度接種于6孔板孵育24 h。待細胞貼壁且生長良好后，加入60 μmol·L-15-FU繼續(xù)培養(yǎng)2周，每2天更換1次新鮮加藥培養(yǎng)基。終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，PBS浸洗，細胞固定液室溫固定，Giemsa染液染色15 min，PBS清洗去浮色，空氣干燥，相差顯微鏡下觀察計數(shù)細胞集落形成情況。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將各組細胞按照1×105個/孔的密度接種于6孔板，待細胞貼壁且生長良好時加入60 μmol·L-15-FU，繼續(xù)培養(yǎng)2周。終止培養(yǎng)，胰酶消化，以2 000 r/min離心5 min，取上清，0.2 mL預冷的buffer重懸細胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC混勻，再加入5 μL PI染液混勻，室溫避光孵育10～15 min，于1 h內(nèi)上機，流式細胞儀(Ex=488 nm；Em=530 nm)檢測細胞凋亡情況。

1.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達

收集各組細胞株，接種于細胞培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)，加入60 μmol·L-15-FU，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入適量的PBS并用細胞刮刮下細胞，細胞懸液以10 000 r/min 4 ℃離心5 min后，加入適量RIPA細胞裂解液，充分裂解細胞獲得總蛋白，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取各組樣本50 μg上樣，恒壓(90 V、20 min，110 V 70 min)電泳，恒流(200 mA、60 min)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(1∶800)于4 ℃搖床孵育過夜，室溫下水平搖床孵育二抗(1∶1 000)1 h，TBST漂液，ECL顯影。以β-actin為內(nèi)參，檢測MDR1、P-gp、Wnt2及β-catenin蛋白表達。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 Fn上調(diào)結(jié)直腸癌細胞活力

相較于對照組，BCC組結(jié)直腸癌細胞活力明顯增加(P<0.05)。給予不同濃度5-FU干預后，各組結(jié)直腸癌細胞活力均降低，且呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相同劑量的5-FU干預后，BCC組細胞活力均較對照組高(P<0.05)，見圖1。

*：與相同濃度對照組相比，P<0.05；#：與0 μmol·L-1 5-FU相比，P<0.05；△：與20 μmol·L-1 5-FU相比，P<0.05；▲：與40 μmol·L-1 5-FU相比，P<0.05圖1 Fn與結(jié)直腸癌細胞HCT-116共培養(yǎng)上調(diào)結(jié)直腸癌細胞活力

2.2 Fn影響5-FU抑制結(jié)直腸癌細胞集落形成能力

相較于對照組，BCC組結(jié)直腸癌細胞增殖能力更強(P<0.05)。給予60 μmol·L-15-FU干預后，5-FU組和BCC+5-FU組結(jié)直腸癌細胞集落形成數(shù)量均明顯減少，但BCC+5-FU組結(jié)直腸癌細胞集落形成數(shù)量較5-FU組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

a：各組細胞集落形成情況；b：各組細胞集落計數(shù)定量圖*：與對照組相比，P<0.05；#：與BCC組相比，P<0.05；△：與5-FU組相比，P<0.05圖2 Fn與結(jié)直腸癌細胞HCT-116共培養(yǎng)拮抗5-FU促進結(jié)直腸癌細胞集落形成

2.3 Fn影響5-FU誘導結(jié)直腸癌細胞凋亡

BCC組結(jié)直腸癌細胞凋亡數(shù)量較對照組明顯減少(P<0.05)。給予60 μmol·L-15-FU干預后，5-FU組和BCC+5-FU組結(jié)直腸癌細胞凋亡數(shù)量明顯增加，且BCC+5-FU組結(jié)直腸癌細胞凋亡數(shù)量較5-FU組減少(P<0.05)，見圖3。

a：各組細胞凋亡情況；b：各組細胞凋亡計數(shù)定量圖*：與對照組相比，P<0.05；#：與BCC組相比，P<0.05；△：與5-FU組相比，P<0.05圖3 Fn與結(jié)直腸癌細胞HCT-116共培養(yǎng)拮抗5-FU抑制結(jié)直腸癌細胞凋亡

2.4 Wnt/β-catenin信號通路及化療耐藥相關(guān)蛋白表達

與對照組相比，BCC組結(jié)直腸癌細胞中MDR1、P-gp、Wnt2、β-catenin蛋白表達均明顯增高(P<0.05)。給予60 μmol·L-15-FU干預后，5-FU組上述蛋白表達較對照組均顯著降低(P<0.05)。與BCC組相比，BCC+5-FU組和5-FU組上述蛋白表達不同程度降低，但BCC+5-FU組MDR1、P-gp、Wnt2、β-catenin蛋白表達明顯高于5-FU組(P<0.05)，見圖4。

a：相關(guān)蛋白表達條帶圖；b：相關(guān)蛋白表達定量圖*：與對照組相比，P<0.05；#：與BCC組相比，P<0.05；△：與5-FU組相比，P<0.05圖4 FN與結(jié)直腸癌細胞HCT-116共培養(yǎng)拮抗5-FU激活化療耐藥蛋白表達

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，全球約20%的癌癥與傳染性病原體有關(guān)[12]，如人乳頭瘤病毒與宮頸癌有關(guān)，幽門螺桿菌與胃癌有關(guān)。近年來，越來越多的研究表明Fn在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的各個階段中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13-14]。Ma等[11]使用Fn感染結(jié)直腸癌細胞NCM460發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n感染可以增強結(jié)直腸癌細胞惡性表型，增強細胞的增殖和侵襲能力。Wu等[15]建立ApcMin/+mice小鼠實驗?zāi)Ｐ?，在患者近端結(jié)直腸癌組織中提取Fn進行為期8周的細菌飼喂實驗，結(jié)果顯示Fn能促進結(jié)直腸癌的發(fā)生。本研究建立Fn與結(jié)直腸癌細胞共培養(yǎng)模型，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，與Fn共培養(yǎng)可以增強結(jié)直腸癌細胞活力，促進細胞集落形成，減少細胞凋亡，還能夠拮抗5-FU，增強結(jié)直腸癌細胞的化療耐藥性和增殖能力，Wnt/β-catenin信號通路過度激活調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運蛋白(MRP1及P-gp)高表達可能是其潛在的分子機制。

由于結(jié)直腸癌起病隱匿，大多數(shù)患者確診時已處于中晚期或伴有淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)的最佳時機，因此，聯(lián)合化療具有極其重要的輔助治療價值[2-3]。FOLFOX(亞葉酸鈣、5-FU、奧沙利鉑)化療方案是目前晚期結(jié)直腸癌患者重要的一線化療方案之一[3]。在根治術(shù)后接受標準5-FU輔助化療的晚期結(jié)直腸癌患者中，高Fn豐度與患者的臨床病理特征及腫瘤復發(fā)狀態(tài)密切相關(guān)[16]。本研究在對照組和BCC組基礎(chǔ)上給予5-FU干預后，細胞集落形成均明顯下調(diào)，且細胞凋亡水平明顯升高；此外，BCC+5-FU組中細胞活力、集落形成的抑制作用和凋亡促進作用均較5-FU組明顯減輕。提示腫瘤細胞與Fn共培養(yǎng)對化療藥物具有拮抗作用，可以削弱化療藥物對腫瘤細胞增殖的抑制作用，減少腫瘤細胞凋亡。Yu等[2]利用生物信息和功能學研究比較了共培養(yǎng)和不培養(yǎng)Fn的結(jié)直腸癌細胞HT29的基因表達譜，結(jié)果證實Fn促進了結(jié)直腸癌細胞對化療的耐藥性。

MDR1及P-gp是ATP結(jié)合盒式外排轉(zhuǎn)運蛋白家族重要成員，其過表達被證明是產(chǎn)生化療耐藥最常見的機制之一，能使得大量結(jié)構(gòu)、功能不同的抗癌藥物(如5-FU、奧沙利鉑等)被排出腫瘤細胞，是發(fā)揮化療耐藥作用的關(guān)鍵外排蛋白[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與Fn共培養(yǎng)可以促進結(jié)直腸癌細胞MDR1及P-gp蛋白表達，具有拮抗5-FU、誘導化療耐藥的作用。Wnt/β-catenin信號通路是ABCB1、MDR1及P-gp等耐藥蛋白的上游調(diào)節(jié)通路，是結(jié)直腸癌等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥的重要分子機制[17]。An等[18]在腸道益生菌的化療增敏研究中發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和5-FU聯(lián)合處理結(jié)直腸癌細胞可以激活caspase誘導細胞凋亡，并通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮潛在的抗癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與Fn共培養(yǎng)能上調(diào)結(jié)直腸癌細胞Wnt2、β-catenin蛋白表達，且具有拮抗5-FU、誘導化療耐藥的作用。Rubinstein等[19]研究證實，F(xiàn)n通過FadA黏附蛋白與膜聯(lián)蛋白A正反饋誘導結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，還發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路的異常激活。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n能夠通過分泌FadA誘導結(jié)直腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而增強細胞的遷移、侵襲能力，且該過程中伴有Wnt/β-catenin信號通路的激活。為了探究Fn介導的生長刺激，有研究利用Fn同時感染表達E-cadherin的肺癌細胞PC-9、前列腺癌細胞22RV1和乳腺癌細胞MCF7及不表達E-cadherin的膀胱癌細胞UMUC3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n的生長刺激作用主要是通過介導FadA黏附蛋白與E-cadherin結(jié)合，激活Wnt/β-catenin信號通路，導致β-catenin核易位和炎癥基因、Wnt基因、癌基因c-Myc以及Cyclin D1的過表達[19]。

值得注意的是，F(xiàn)n能夠分泌多種黏附蛋白(如黏附素Fap2)，特異性結(jié)合GalGalNAc糖殘基，而GalGalNAc糖殘基被證實能在結(jié)直腸癌組織中過表達。這種由Fn介導形成的生物膜，可聚集大量機會致病菌，改變腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[21]。但是體內(nèi)外環(huán)境的不同導致細胞學實驗很難精準評估聚集多種致病菌的生物膜在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。此外，人體與嚙齒類動物的腸道菌群具有極大的異質(zhì)性，因此建立嚙齒類動物模型用于人體消化道系統(tǒng)Fn定植研究存在一定的局限性[22]。

綜上所述，F(xiàn)n能夠通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進結(jié)直腸癌細胞對5-FU化療產(chǎn)生耐藥性，促進腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡。本研究是關(guān)于化療過程中腫瘤細胞耐藥問題的良好探索，為晚期結(jié)直腸癌患者化療效果預測及臨床個性化干預提供了一定的實驗室基礎(chǔ)。