添加外源酚酸條件下有機(jī)肥對(duì)辣椒化感效應(yīng)的調(diào)控研究

張衛(wèi)東，劉 宇，吳云成，劉明慶，趙家印，王蒙蒙，陳 哲，田 偉*

（1.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042；2.河海大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，江蘇 南京 210098）

0 引言

伴隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，連作障礙已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的世界性難題。連作障礙是指在同一地塊連續(xù)多茬種植同種或同科作物后，植株長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?、病蟲(chóng)害加重、產(chǎn)量和品質(zhì)下降的現(xiàn)象［1］，化感物質(zhì)的逐年積累以及由此引起的土壤根際微生物群落結(jié)構(gòu)的失衡是連作障礙發(fā)生的重要誘因。研究表明，酚酸類化感物質(zhì)是影響植物幼苗生長(zhǎng)的重要因素［2］。酚酸類物質(zhì)是單一連作體系中重要的化感物質(zhì)，可通過(guò)直接的自毒作用或間接的抑制作用，使土壤向“利病型土壤”轉(zhuǎn)化［3］。因此，要防治與克服連作障礙，必須從土壤微生物區(qū)系著手，構(gòu)建一個(gè)健康的土壤微生物區(qū)系，并設(shè)法維持。大量研究結(jié)果表明，生物防治是治理土傳病害最有效、最安全的途徑［4-6］。

有機(jī)肥的生產(chǎn)過(guò)程是一個(gè)由不同種類的微生物參與的自發(fā)的生物學(xué)過(guò)程［7］，研究表明，腐熟的有機(jī)肥存在大量的細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物，施用有機(jī)肥不但具有培肥土壤、增加作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)等作用，同時(shí)能夠調(diào)控土壤微生物區(qū)系特征［8-9］。本試驗(yàn)以辣椒根系分泌物以及殘留物中的酚酸類物質(zhì)：香草酸（VA）、水楊酸（SA）與苯甲酸（BA）等為代表，重點(diǎn)關(guān)注了在此類化感物質(zhì)存在的情況下，有機(jī)肥對(duì)辣椒種子的發(fā)芽情況和幼苗生長(zhǎng)的影響以及對(duì)土壤微生物功能的調(diào)控作用，以期為研究連作障礙中根際調(diào)控技術(shù)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采自江蘇省儀征市江揚(yáng)農(nóng)業(yè)生態(tài)有限公司四莊基地，該土壤的pH值為 7.20，有機(jī)碳含量為19.21 g/kg，總氮含量為1.87 g/kg,有效磷含量為172.31 mg/kg，有效鉀含量為31.56 mg/kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將辣椒種子的表面用5%的過(guò)氧化氫（H2O2）消毒30 min，再用無(wú)菌水清洗3次，然后放在含有濕式過(guò)濾紙的培養(yǎng)皿中，保持30 ℃發(fā)芽48 h，最后將種子移入盆中。實(shí)驗(yàn)包括7個(gè)處理：（1）CK（未添加酚酸的土壤）；（2）BA（添加苯甲酸）；（3）BA+OF（添加苯甲酸和有機(jī)肥）；（4）SA（添加水楊酸）；（5）SA+OF（添加水楊酸和有機(jī)肥）；（6）VA（添加香草酸）；（7）VA+OF（添加香草酸和有機(jī)肥）。每個(gè)處理重復(fù)3次。在播種7 d后采集土壤，并將其保存在4 ℃下冷藏待后期分析。各酚酸處理過(guò)程為：將每種酚酸在乙醇中溶解后分別加入到土壤中，使其濃度最終達(dá)到5 mg/g。各有機(jī)肥處理過(guò)程為：在添加有機(jī)肥的處理中按1.0%的比例添加牛糞有機(jī)肥，有機(jī)肥的基本理化性質(zhì)為：全氮1.34%、全磷1.58%、全鉀0.92%。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

土壤常規(guī)理化指標(biāo)分析［10］：土壤pH值采用土∶水=1∶10浸提，用pH計(jì)測(cè)定；銨態(tài)氮含量采用氯化鉀浸提─靛酚藍(lán)比色法測(cè)定；硝態(tài)氮含量采用紫外分光光度法測(cè)定；速效鉀含量采用乙酸銨浸提─火焰光度法測(cè)定；有效磷含量采用碳酸氫鈉浸提─鉬銻抗比色法測(cè)定；土壤酚酸類化合物采用液相色譜法（HPLC）測(cè)定［11］。

土壤微生物數(shù)量：以鮮土樣為測(cè)定對(duì)象，采用試管梯度稀釋涂平板法測(cè)定土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量，采用的培養(yǎng)基分別是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基和高氏培養(yǎng)基［12］。微生物功能多樣性采用Biolog-Eco微平板測(cè)定，微平板含96孔、共31種碳源，放置于25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 d，每12 h用酶標(biāo)儀讀取各孔在590 nm波長(zhǎng)下的數(shù)值［13］。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用孔平均顏色變化率法測(cè)定微生物利用單一碳源的能力。

平均顏色變化率（AWCD）=∑(Ci-R+)/31

其中，Ci為各反應(yīng)孔在590 nm 的光密度值；R為ECO 板對(duì)照孔A1 的光密度值；Ci-R小于零的孔在計(jì)算中記為零。采用PCA（Canoco 4.5）軟件對(duì)接種84 h 后的31 種碳源的OD 值進(jìn)行主成分分析［14-15］，測(cè)定數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2010軟件整理后，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源酚酸和有機(jī)肥對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

由表1可知，與CK相比，酚酸處理（BA、SA、VA）以及酚酸-有機(jī)肥處理（BA+OF、SA+OF、VA+OF）均明顯改變了土壤的基礎(chǔ)理化性狀，土壤的pH值、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量都有提升，其中銨態(tài)氮的含量顯著增加；酚酸-有機(jī)肥處理（BA+OF、SA+OF、VA+OF）中的有效磷、速效鉀含量顯著增加。與對(duì)應(yīng)的酚酸處理（BA、SA、VA）相比，酚酸-有機(jī)肥處理（BA+OF、SA+OF、VA+OF）顯著增加了土壤速效鉀的含量，降低了土壤的pH值。對(duì)于土壤pH值的變化，各處理之間并未表現(xiàn)出一致的規(guī)律性。

表1 外源酚酸和有機(jī)肥對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

2.2 外源酚酸和有機(jī)肥對(duì)辣椒種子的發(fā)芽率以及土壤中酚酸濃度的影響

與CK相比，酚酸處理均顯著抑制了辣椒種子的發(fā)芽（圖1a），BA、SA與VA處理的種子發(fā)芽率明顯降低，分別降低至47.6%、14.8%、38.2%。而酚酸-有機(jī)肥處理則對(duì)酚酸抑制辣椒種子發(fā)芽具有緩解效應(yīng)，BA+OF、SA+OF和VA+OF處理的辣椒種子發(fā)芽率分別達(dá)到了63.2%、51.5%和71.8%。

不同處理間土壤中總酚酸含量表現(xiàn)不同（圖1b）。SA+OF 處理的總酚酸含量最高，達(dá)613.7 mg/kg；CK 的總酚酸含量最低，為91.9 mg/kg。BA 處理的總酚酸含量（330.5 mg/kg）高于BA+OF 處理的總酚酸含量（236.2 mg/kg）。VA 處理的總酚酸含量（239.7 mg/kg）高于VA+OF 處理的總酚酸含量（239.7 mg/kg），而SA 處理的總酚酸含量（173.8 mg/kg）顯著低于SA+OF 處理的總酚酸含量（613.3 mg/kg）。

2.3 外源酚酸和有機(jī)肥對(duì)土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響

與CK相比，酚酸與酚酸-有機(jī)肥處理均明顯抑制了土壤細(xì)菌的數(shù)量（圖2a），分別降低至1.7×107～1.6×108、6.1×107～2.6×108cfu/g。但相較于對(duì)應(yīng)的酚酸處理，酚酸-有機(jī)肥處理中的BA+OF和SA+OF中土壤細(xì)菌的數(shù)量分別為1.4×108和2.6×108cfu/g，顯著高于BA和SA的單獨(dú)酚酸處理的1.7×107、1.7×108cfu/g。相較于SA處理，SA+OF處理土壤真菌的數(shù)量顯著降低（圖2b）。BA+OF和VA+OF處理中的放線菌的數(shù)量顯著高于對(duì)應(yīng)的BA和VA處理（圖2c）。

2.4 外源酚酸和有機(jī)肥對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響

土壤微生物群落對(duì)碳源的利用能力可以通過(guò)平均顏色變化率（AWCD）來(lái)反映，其能夠直觀反映微生物的生長(zhǎng)情況。由圖3可知，較未添加酚酸的CK處理，酚酸的添加，尤其是苯甲酸的添加，顯著抑制了土壤微生物對(duì)碳源的利用。與單獨(dú)添加酚酸的處理相比，添加有機(jī)肥在一定程度上增加了平均顏色變化率，BA+OF處理和VA+OF處理的平均顏色變化率分別為1.3和1.4，顯著高于BA處理和VA處理的0.9和1.1。

由圖4可看出，與BA處理相比，BA+OF處理消耗較多的碳水化合物類、羥酸類、氨基酸類、胺類、酚類化合物，并消耗較少的聚合物。與SA處理相比，SA+OF處理消耗較多的碳水化合物類、氨基酸類與胺類，并消耗較少的聚合物。與VA處理相比，VA+OF處理消耗較多的聚合物、碳水化合物類、羥酸類、氨基酸類、胺類、酚類化合物以及聚合物。

圖4 不同處理中各碳源的平均顏色變化率

2.5 外源酚酸和有機(jī)肥對(duì)微生物碳源利用特征的影響

為確定不同處理的土壤微生物對(duì)碳源利用能力的差異化程度，對(duì)所有處理的平均顏色變化率進(jìn)行了PCA分析。由圖5可以看出，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分別解釋了所對(duì)應(yīng)變量方差的70.8%和 21.0%，2個(gè)主成分累計(jì)達(dá)到了91.8%，作為變異的主要來(lái)源，可以用來(lái)表征不同處理間微生物碳源利用的差異。酚酸+有機(jī)肥處理與酚酸處理分布于不同的象限，表明各處理利用碳源的差異比較明顯。

圖5 不同處理的碳源利用能力的主成分分析

3 討論

在雙碳戰(zhàn)略背景下，可持續(xù)農(nóng)業(yè)是世界農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然，通過(guò)發(fā)掘土壤本身的生產(chǎn)潛力，降低化肥、農(nóng)藥等化石能源的投入，構(gòu)建循環(huán)農(nóng)業(yè)體系，減少土傳病害的發(fā)生［16］。我國(guó)是農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)大國(guó)，堆肥是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的農(nóng)業(yè)固體廢棄物資源化的利用方式［17］。本文重點(diǎn)關(guān)注了在化感物質(zhì)存在的情況下，有機(jī)肥對(duì)辣椒種子的發(fā)芽情況和幼苗生長(zhǎng)的影響以及其對(duì)土壤微生物功能的調(diào)控作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源酚酸的添加具有一定的活化土壤營(yíng)養(yǎng)成分的作用，土壤中氨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀的含量較對(duì)照來(lái)說(shuō)總體得到了提升，這可能是由于外源酚酸的添加，選擇性地促進(jìn)了某一類或者某幾類以此酚酸為碳源和能源的土壤微生物的生長(zhǎng)，提高了土壤中難利用養(yǎng)分的礦化效率。相反，改變土壤有效態(tài)養(yǎng)分（硝態(tài)氮、有效磷、速效鉀）的含量也可能會(huì)改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)［18］。有機(jī)肥能夠增加土壤有機(jī)質(zhì)含量并且為作物生長(zhǎng)提供養(yǎng)分，本實(shí)驗(yàn)有機(jī)肥添加處理顯著增加了土壤中有效磷和速效鉀的含量，這與前期的研究結(jié)論一致［19］。

外源酚酸的添加對(duì)辣椒幼苗的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，Asao等［20］報(bào)道，在芋頭根系分泌物中含有大量的酚酸類物質(zhì)，包括苯甲酸、香草酸和琥珀酸等，其中苯甲酸對(duì)芋頭幼苗具有明顯的抑制作用。研究表明，在未滅菌的土壤中，即使土壤中酚酸的濃度很高，也能被土壤中的微生物快速降解［21］。因此，土壤中微生物的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和活性決定了酚酸在土壤中的停留時(shí)間，同時(shí)決定了種子的發(fā)芽率，但是要注意的是，施用有機(jī)物料來(lái)控制土傳病原菌與具體的有機(jī)物料和土傳病原菌的種類有關(guān)［22］。例如，SA+OF處理中水楊酸的含量高于SA處理，初步認(rèn)為在有機(jī)物料的微生物降解過(guò)程中，有一定數(shù)量的水楊酸釋放到了土壤中［23］。

有機(jī)肥施用是一種有效的土傳病害的防控措施，在有機(jī)質(zhì)的降解過(guò)程中，土壤中 k 型和 r 型微生物的比值隨著微生物區(qū)系的演替而改變［3］，而這種比值往往與土壤的抑病能力有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，外源酚酸的添加一定程度上抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)，而有機(jī)肥能夠緩解這種抑制效應(yīng)，促進(jìn)可培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)繁殖，尤其是苯甲酸+有機(jī)肥處理，這種促進(jìn)效應(yīng)更加明顯。研究表明，土壤細(xì)菌數(shù)量/真菌數(shù)量的比值越高，越有利于降低土壤病害的發(fā)生概率［24］，這可能是細(xì)菌和放線菌的快速繁殖在一定程度上抑制了有害真菌的生存。另外，土壤中的放線菌一般能夠產(chǎn)生抗生素等一些次生代謝產(chǎn)物，從而抑制了病原微生物的生長(zhǎng)。但是，由于酚酸種類的差異及其對(duì)微生物的選擇性，因此，并不是所有的酚酸+有機(jī)肥處理的微生物數(shù)量會(huì)表現(xiàn)出一致的規(guī)律性。

平均顏色變化率值反映了土壤微生物利用碳源的能力和代謝活性的大小，其值越高，土壤中微生物群落代謝活性也就越高［25］。本文通過(guò)研究外源酚酸及酚酸+有機(jī)肥條件下土壤微生物碳源利用能力，分析了有機(jī)肥的添加對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響。研究結(jié)果表明，與單獨(dú)添加酚酸處理相比，添加有機(jī)肥可顯著改變土壤細(xì)菌群落的碳代謝能力，有機(jī)肥處理的細(xì)菌種群增加了對(duì)碳水化合物、羥酸、氨基酸、胺類以及酚類化合物的利用。寧趙等［26］研究發(fā)現(xiàn)，施用有機(jī)肥可顯著增加土壤微生物的碳源利用能力，提高微生物對(duì)碳水化合物的代謝速率。張玥琦等［27］研究了不同施肥措施對(duì)番茄連作土壤微生物功能多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)雞糞和稻草等有機(jī)物料的投入均能在一定程度上提高土壤微生物碳源利用能力。Poulsen等［28］從生態(tài)學(xué)的角度研究了植物根際微生物多樣性與土傳病害發(fā)生的關(guān)系，表明根際細(xì)菌種群及功能多樣性越豐富，其抑制病原菌生長(zhǎng)的能力就越強(qiáng)。總體來(lái)說(shuō)，在添加外源酚酸條件下，有機(jī)肥對(duì)辣椒化感效應(yīng)具有正向調(diào)控作用。

4 結(jié)論

有機(jī)肥施用提高了土壤中可利用養(yǎng)分的含量和辣椒種子的發(fā)芽率，降低了酚酸的含量，提高了土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量和微生物群落對(duì)碳源的利用能力，是一種有效預(yù)防和控制土壤連作障礙的措施。