基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索脾胃培源方治療胃癌的作用機(jī)制*

裴蓓，溫子昂，鄭艷敏，李學(xué)軍

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 安徽合肥 230012 2 安徽醫(yī)科大學(xué)研究生院 安徽合肥 230031 3 中國(guó)科學(xué)院合肥物理研究所 安徽合肥 230031 4 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 安徽合肥 230000

胃癌（Gastric Cancer，GC）是一種起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。幾乎95%的胃癌是腺癌。在中國(guó)，胃癌是繼肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌之后發(fā)病率和死亡率最高的一種惡性腫瘤，其5年生存率僅為29%。雖然近年來(lái)中國(guó)胃癌的發(fā)病率有所下降，但死亡率卻沒(méi)有明顯下降[1-2]。目前，手術(shù)是胃癌的主要治療手段。然而，由于術(shù)后的高復(fù)發(fā)率和嚴(yán)重并發(fā)癥，患者的最終預(yù)后往往都很差[3]。

脾胃培源方是李學(xué)軍教授在李東恒脾胃病理論基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)馬駿教授臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出來(lái)的經(jīng)驗(yàn)方。本方主要由白術(shù)、黃芪、香附、桂枝、白芍、劉寄奴等六味藥組成。后世有云：“脾胃為后天之本、氣血生化之源”。李學(xué)軍教授結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)提出胃癌病機(jī)多為“脾胃虛弱，氣滯血瘀”。脾胃虛弱，運(yùn)化失司，氣血乏源，失于濡養(yǎng)，久則氣滯血瘀積成癌癥?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》云：“正氣存內(nèi)，邪不可干；邪之所湊，其氣必虛”。正氣不足是疾病發(fā)生的根本原因。故以“調(diào)平歸源”為治療大發(fā)，益氣和中，培補(bǔ)脾胃，提高機(jī)體的抗病能力[4]?；诂F(xiàn)有的臨床證據(jù)，脾胃培源方在治療胃癌上具有良好的療效，能夠有效緩解患者的癥狀，但尚缺乏對(duì)脾胃培源方治療胃癌作用機(jī)制的研究。

與其他中藥方劑類似，脾胃培源方也是一種多成分、多靶點(diǎn)的藥物，通過(guò)活性成分調(diào)節(jié)分子網(wǎng)絡(luò)來(lái)達(dá)到療效。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是新興的生物信息學(xué)技術(shù)，它綜合了基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和藥理學(xué)的相關(guān)信息，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“疾病-基因”生物網(wǎng)絡(luò)圖和“藥物-靶點(diǎn)”生物網(wǎng)絡(luò)圖，可以系統(tǒng)、全面地了解某種藥物治療疾病的具體作用機(jī)制[5-6]。為進(jìn)一步探索脾胃培源方治療GC 的作用機(jī)制，本研究采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測(cè)脾胃培源方的潛在分子機(jī)制。

方 法

1 預(yù)測(cè)脾胃培源方的作用靶點(diǎn)

使 用TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲取脾胃培源方的作用靶點(diǎn)。TCMSP 包含了在《中國(guó)藥典》中注冊(cè)的499 種中藥材，包括29384 種成分、3311 種靶點(diǎn)和837 種相關(guān)疾病的信息[7]。中藥多為口服藥，根據(jù)口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和藥物相似點(diǎn)（Drug Likeness，DL），可以選擇有效成分和相關(guān)目標(biāo)[8-9]。我們以O(shè)B ≥30% 和DL ≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選脾胃培源方的有效成分和相關(guān)作用靶點(diǎn)。

2 收集與胃癌發(fā)病相關(guān)的基因數(shù)據(jù)

使 用Genecards 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.genecards.org）和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.omim.org）兩大通用數(shù)據(jù)庫(kù)獲取胃癌發(fā)病的相關(guān)基因數(shù)據(jù)。GeneCards是一個(gè)全面、權(quán)威的人類基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)，已經(jīng)被廣泛使用了近26年[10]。數(shù)據(jù)庫(kù)中包含了73000 多個(gè)人類基因。我們以“胃癌”為關(guān)鍵詞，選擇了關(guān)聯(lián)度大于中位數(shù)（1.55）的相關(guān)基因，同時(shí)刪除重復(fù)的基因。

3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）是大多數(shù)細(xì)胞中生物過(guò)程的基礎(chǔ)，對(duì)于了解正常和疾病狀態(tài)下的細(xì)胞生理學(xué)至關(guān)重要。我們利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org）對(duì)獲得的具有生物活性的化學(xué)成分和胃癌靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)映射，物種限定為 "智人"。用Cytoscape（3.7.2 版）[11-12]構(gòu)建靶點(diǎn)-信號(hào)通路相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以用來(lái)分析DNA、蛋白質(zhì)和相關(guān)信號(hào)通路相互關(guān)系。

4 GO 和KEGG 分析

基因本體論（GO）為基因組學(xué)提供了相關(guān)生物學(xué)信息，同時(shí)定義了與基因功能有關(guān)的概念[13]。京都基因和基因組百科全書（KEGG）是一個(gè)以其路徑信息而聞名的數(shù)據(jù)庫(kù)[14]。它是一個(gè)可以將基因組信息與生物功能信息聯(lián)系起來(lái)系統(tǒng)分析基因功能的強(qiáng)大數(shù)據(jù)庫(kù)。為了研究脾胃培源方的生物學(xué)效應(yīng)，我們對(duì)其進(jìn)行了GO 分析和KEGG 通路富集分析，并通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org）進(jìn)行計(jì)算，以校正后的P值＜0.01 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。

5 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

根據(jù)脾胃培源方的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖和胃癌的信息，我們對(duì)脾胃培源方的主要成分和目標(biāo)進(jìn)行了分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)。首先通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)下載了脾胃培源方中主要有效成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的三維（3D）結(jié)構(gòu)圖，將其導(dǎo)入AutodockTools 1.5.6 軟件進(jìn)行氫化和能量?jī)?yōu)化，然后將其保存為mol2 格式文件。我們?cè)賹?duì)這些化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，加入電荷，顯示可旋轉(zhuǎn)鍵，將所得結(jié)構(gòu)的文件保存為pdbqt 格式。我們?cè)購(gòu)腜DB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載目標(biāo)基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，將結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入PyMOL 軟件中，去除水分子和異質(zhì)分子，導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6 軟件中添加氫原子，將所得結(jié)構(gòu)文件保存為pdbqt 格式。最后，以化合物為配體，以目標(biāo)基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)為受體進(jìn)行分子對(duì)接。根據(jù)Autodock vina 1.1.2 軟件的經(jīng)驗(yàn)評(píng)分功能確定結(jié)合點(diǎn)，對(duì)接過(guò)程由Autodock vina 1.1.2 軟件完成。

結(jié)果

1 成分和目標(biāo)分析

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，我們得到了白術(shù)的55 種成分，黃芪的87 種成分，香附的104 種成分，桂枝的220種成分，白芍的85 種成分和劉寄奴的46 種成分。刪除沒(méi)有匹配靶點(diǎn)的有效成分，并根據(jù)口服生物利用度（OB）和藥物相似度（DL）值篩選出了6 種藥物的有效成分。最終，67 種有效成分被發(fā)現(xiàn)，如槲皮素、異鼠李素、木犀草素和山柰酚等（見(jiàn)表1）。

表1 脾胃培源方的活性成分一覽表

香附 MOL004027 1，4-Epoxy-16-hydroxyheneicos-1，3，12，14，18-Pentaene 45.10 0.24香附 MOL004053 Isodalbergin 35.45 0.20香附 MOL004058 Khell 33.19 0.19香附 MOL004059 Khellol glucoside 74.96 0.72香附 MOL010489 Resivit 30.84 0.27香附 MOL004068 Rosenonolactone 79.84 0.37香附 MOL004071 Hyndarin 73.94 0.64香附 MOL004074 Stigmasterol glucoside_qt 43.83 0.76香附 MOL004077 Sugeonyl acetate 45.08 0.20香附 MOL000422 Kaempferol 41.88 0.24香附 MOL000449 Stigmasterol 43.83 0.76香附 MOL000006 Luteolin 36.16 0.25香附 MOL000098 Quercetin 46.43 0.28桂枝 MOL000073 ent-Epicatechin 48.96 0.24桂枝 MOL000492 （+）-Catechin 54.83 0.24桂枝 MOL001736 （-）-Taxifolin 60.51 0.27桂枝 MOL004576 Taxifolin 57.84 0.27桂枝 MOL000359 Sitosterol 36.91 0.75桂枝 MOL011169 Peroxyergosterol 44.39 0.82劉寄奴 MOL001733 EUPATORIN 30.23 0.37劉寄奴 MOL000358 Beta-sitosterol 36.91 0.75劉寄奴 MOL000006 Luteolin 36.16 0.25劉寄奴 MOL008127 Ermanin 58.95 0.30劉寄奴 MOL008135 3，4-di-O-caffeoylquinic acid 49.62 0.69

2 胃癌與脾胃脾胃培源方的靶點(diǎn)

我們通過(guò)Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了9877 個(gè)胃癌的靶點(diǎn)，以得分大于中位數(shù)1.55 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選靶點(diǎn)。在整合數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)信息后，最終篩選出了4938 個(gè)靶點(diǎn)。

3 靶點(diǎn)-信號(hào)通路交互網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

根據(jù)從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的脾胃培源方活性成分的作用靶點(diǎn)，以及篩選出的胃癌靶點(diǎn)，我們對(duì)其進(jìn)行交互，通過(guò)Venn 2.1 建立維恩圖，獲得181 個(gè)共同靶點(diǎn)作為脾胃培源方治療胃癌的主要作用靶點(diǎn)（圖1）；使用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所得的主要靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2）；使用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建靶點(diǎn)-信號(hào)通路交互網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。在獲得的靶點(diǎn)中，許多靶點(diǎn)都參與了抗炎、促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成和抗腫瘤的過(guò)程，如MAPK1、TP53、IL-1、Fox 和Bax 等[15-18]。

圖1 脾胃培源方治療胃癌主要作用靶點(diǎn)的韋恩圖

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 靶點(diǎn)-信號(hào)通路相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

4 GO 和KEGG 通路富集分析

為了從系統(tǒng)水平闡明潛在CAG 靶點(diǎn)的多種生物學(xué)功能，進(jìn)行了GO 富集和KEGG 通路富集分析。GO富集分析包括生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分在內(nèi)的三個(gè)部分。我們將181 個(gè)目標(biāo)信息輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 分析。根據(jù)P 值選擇前24 個(gè)結(jié)果（圖4）。

圖4 靶點(diǎn)基因GO 分析

此外，根據(jù) KEGG 通路富集分析的結(jié)果，我們選擇了前20 的信號(hào)通路，繪制了如下所示的氣泡圖（圖5）。最后，我們發(fā)現(xiàn)了6 條信號(hào)通路與胃癌的發(fā)病密切相關(guān)，“Pathway in cancer”是包含作用靶點(diǎn)最多的信號(hào)通路（72 個(gè)靶點(diǎn)），其網(wǎng)絡(luò)如下所示（圖6）。這些信號(hào)通路與細(xì)胞分化、增殖、凋亡和血管生成密切相關(guān)，其中大部分在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。所發(fā)現(xiàn)的相關(guān)分子功能和生物過(guò)程也同樣與胃癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，上述結(jié)果都表明脾胃培源方可以通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)和途徑治療胃癌。

圖5 靶點(diǎn)基因的KEGG 分析結(jié)果一覽圖

圖6 Pathway in Cancer 信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)圖

5 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)通常被用來(lái)驗(yàn)證藥物成分和其目標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)物之間的相互作用情況。本研究中，相關(guān)藥物有效成分與靶點(diǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的分子對(duì)接得分結(jié)果如表2 所示，分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果的示意圖如圖7 所示。

圖7 活性成分與目標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合示意圖

表2 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果得分表

從結(jié)果來(lái)看，Caspase-3 與山奈酚的最低結(jié)合自由能為-6.1 kcal/mol，Caspase-3 中的氨基酸片段THR62 和山奈酚之間存在一個(gè)氫鍵相互作用。Caspase-3 和luteolin 的最低結(jié)合自由能是-6.1 kcal/mol。其中氨基酸片段THR62、SER251 和木犀草素之間存在疏水相互作用。MAPK1 和木犀草素的最低結(jié)合自由能為-7.9 kcal/mol，其氨基酸片段LYS54、

GLN105、MET108、ASP167 和木犀草素之間存在疏水相互作用。Caspase-3 和槲皮素的最低結(jié)合自由能是-6.0 kcal/mol，其氨基酸片段THR62 和槲皮素之間有兩個(gè)疏水鍵相互作用。MAPK1 和槲皮素的最低結(jié)合自由能是-8.1 kcal/mol，其氨基酸片段ASP106、MET108 和槲皮素之間有兩個(gè)疏水鍵相互作用。所有的化合物都能與蛋白質(zhì)的“活性口袋”緊密結(jié)合，這些相互作用使相關(guān)靶基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠與藥物的主要成分形成穩(wěn)定的復(fù)合體。在這項(xiàng)研究中，分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)解釋了蛋白質(zhì)與化合物的相互作用方式，為進(jìn)一步研究脾胃培源方治療胃癌奠定了理論基礎(chǔ)。

討論

多項(xiàng)研究表明，傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療等治療方法對(duì)胃癌的治療效果不佳，然而中醫(yī)治療有其獨(dú)特的自身優(yōu)勢(shì)，在提高身體免疫力和緩解胃癌引起的癥狀方面有很大潛力[19]。通過(guò)我們的研究發(fā)現(xiàn)，脾胃培源方具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的綜合調(diào)節(jié)作用?；?81 個(gè)潛在靶點(diǎn)，通過(guò)分析得到6 個(gè)相關(guān)通路以及許多相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，從理論上講，脾胃培源方對(duì)GC 的療效是確切的。

我們發(fā)現(xiàn)，槲皮素、異鼠李素、木犀草素和山奈酚等是脾胃培源方發(fā)揮藥理作用的主要成分，與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白在胃癌發(fā)病與進(jìn)展中起重要作用。槲皮素是一種具有抗炎、抗病毒和抗腫瘤作用的生物類黃酮，它已被證明可通過(guò)各種作用機(jī)制抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)[20-22]。槲皮素可以通過(guò)MAPK、ERK、PI3K、PKC 等信號(hào)通路調(diào)節(jié)caspases 家族和Bcl-2 家族蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23-26]。Shang HS 等人[27]發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以通過(guò)引起細(xì)胞形態(tài)的變化來(lái)誘導(dǎo)AGS 細(xì)胞的凋亡，從而降低腫瘤細(xì)胞的整體存活率。山奈酚是廣泛存在于蔬菜和水果中的一種重要的黃酮類化合物，它能誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[28-30]。它已被證明可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Yang L 等人[31]發(fā)現(xiàn)，山奈酚主要通過(guò)三個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)治療胃癌，即ESR1、EGFR 和SRC。EGFR 和SRC 的表達(dá)水平在胃癌組織中的表達(dá)有不同程度地升高，這些靶點(diǎn)的高表達(dá)直接影響了胃癌患者的預(yù)后生存率。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析，脾胃培源方主要通過(guò)參與調(diào)節(jié)與癌癥相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮治療胃癌的作用。PI3K-Akt 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)癌癥發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵通路[32]，激活的AKT 可以通過(guò)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，最終抑制細(xì)胞增殖[33]。已有研究表明，胃癌組織中P13K-AKT信號(hào)通路的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，P13K-AKT 信號(hào)通路在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。同時(shí)，P13K-AKT 信號(hào)通路在GC 中的高表達(dá)與腫瘤的分化程度有關(guān)，其表達(dá)水平與GC 的惡性程度呈正相關(guān)[34-36]。MAPK 信號(hào)通路幾乎在所有真核生物中都有表達(dá)。它參與細(xì)胞的各種活動(dòng)，如基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞活動(dòng)中起關(guān)鍵作用[37]。ERK 信號(hào)通路是MAPK 信號(hào)通路的一個(gè)重要組成部分，ERK 信號(hào)通路的基因突變或異常激活可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[38]。Ras 是ERK/MAPK 信號(hào)通路上游的一個(gè)結(jié)合激酶，其點(diǎn)突變可導(dǎo)致ERK/MAPK 信號(hào)通路失調(diào)和細(xì)胞活動(dòng)異常，進(jìn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞遷移和侵襲，最終誘發(fā)腫瘤的發(fā)生[39-40]。

綜上，中藥的活性成分、作用靶點(diǎn)是中藥現(xiàn)代化研究的一個(gè)重要方面。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以通過(guò)在基因、蛋白質(zhì)和化合物之間構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，在復(fù)雜系統(tǒng)中尋找有效物質(zhì)，為了解其作用機(jī)制提供有效信息。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法也有一些局限性。一是檢索數(shù)據(jù)庫(kù)不夠全面。二是部分成分和靶點(diǎn)仍缺乏研究支持。因此，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)使用。

通過(guò)本文研究我們發(fā)現(xiàn)，脾胃培源方可通過(guò)PI3K-Akt 信號(hào)通路來(lái)抑制GC 的發(fā)生發(fā)展。盡管這一假設(shè)已初步得到證實(shí)，但還需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究驗(yàn)證，以評(píng)估脾胃培源方與PI3K-Akt 信號(hào)通路在治療GC 中發(fā)揮的作用機(jī)制。