復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)提升研究

漆欣筑，祝 晶，何劼毅，黃翰林

(貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽 550004)

0 引言

復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊為鹽酸二甲雙胍與格列吡嗪的復(fù)方制劑，臨床上用于改善II型糖尿病患者的血糖控制[1-4]。目前，復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊在國(guó)內(nèi)尚屬獨(dú)家品種，現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)為《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第七冊(cè)，檢驗(yàn)項(xiàng)目較為簡(jiǎn)單，其中含量測(cè)定部分為紫外分光光度法測(cè)定鹽酸二甲雙胍的含量[5]，該方法靈敏度低、專屬性較差，易導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確[6]，且原標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)格列吡嗪的含量進(jìn)行控制。

為了更好地控制藥品質(zhì)量，定量測(cè)定2個(gè)有效成分的準(zhǔn)確含量，本研究擬對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定部分進(jìn)行提升，將鹽酸二甲雙胍的含量測(cè)定方法由UV法修訂為高效液相色譜(HPLC)法，并增加了格列吡嗪的HPLC含量測(cè)定法，提升后的含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，對(duì)提高產(chǎn)品的質(zhì)量可控性有較好的幫助[7～9]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀(島津20A、Thermo Ultimate3000、Agilent1260)，電子天平(METTLER TOLEDO XS205、METTLER TOLEDO AE240S)，C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，SHISEDO、Agilent、Thermo)。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊(廠家送檢)，鹽酸二甲雙胍原料藥、格列吡嗪原料藥、肉桂提取物、淀粉(以上原料及原料藥由廠家提供)，格列吡嗪對(duì)照品(來源：中檢院，批號(hào)：100281-201203)，庚烷磺酸鈉，磷酸二氫鈉，甲醇，純化水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定色譜條件：色譜柱采用C18柱；以庚烷磺酸鈉與磷酸二氫鈉的混合溶液(取庚烷磺酸鈉1 g，加0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液1 000 mL使溶解)-甲醇(80∶20，V∶V)為流動(dòng)相；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為233 nm。理論板數(shù)按鹽酸二甲雙胍計(jì)算不低于3 000，鹽酸二甲雙胍與相鄰色譜峰的分離度應(yīng)符合要求。

格列吡嗪含量測(cè)定色譜條件：色譜柱采用C18柱；以庚烷磺酸鈉與磷酸二氫鈉的混合溶液(取庚烷磺酸鈉1 g，加0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液1 000 mL使溶解)-甲醇(45∶55，V∶V)為流動(dòng)相；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm。理論板數(shù)按格列吡嗪計(jì)算不低于3 000，格列吡嗪與相鄰色譜峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.2 測(cè)定方法

鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定方法：取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍125 mg)，置100 mL量瓶中，加水適量振搖使鹽酸二甲雙胍溶解，稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 mL中約含25 μg的溶液，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

格列吡嗪含量測(cè)定方法：取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于格列吡嗪2.5 mg)，置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL，振搖使格列吡嗪溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取格列吡嗪對(duì)照品約12.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇30 mL，振搖使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5.0 mL置50 mL量瓶中，用60%甲醇溶液稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液，同法測(cè)定。

3 鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 專屬性試驗(yàn)

溶液配制：精密稱取鹽酸二甲雙胍原料藥125 mg、格列吡嗪原料藥2.5 mg、肉桂提取物150 mg、淀粉約70 mg，分別置100 mL量瓶中，加水適量，振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0 mL置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得鹽酸二甲雙胍溶液、格列吡嗪溶液、肉桂提取物溶液及淀粉溶液。

鹽酸二甲雙胍陰性溶液：精密稱取格列吡嗪原料藥2.5 mg，置100 mL量瓶中，加水適量，振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0 mL置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

混合溶液：精密稱取鹽酸二甲雙胍原料藥125 mg、格列吡嗪原料藥2.5 mg、肉桂提取物150 mg、淀粉約70 mg，置100 mL量瓶中，加水適量，振搖使溶解，并加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0 mL置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

分別精密量取上述溶液和配制用水各20 μL，照鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定方法進(jìn)樣。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸二甲雙胍陰性溶液色譜圖中未見鹽酸二甲雙胍色譜峰，色譜圖顯示其他各組分及配置用水均不會(huì)對(duì)鹽酸二甲雙胍的含量測(cè)定產(chǎn)生干擾，混合溶液中鹽酸二甲雙胍色譜峰與鹽酸二甲雙胍原料藥色譜峰保留時(shí)間一致，分離度符合要求。該方法專屬性好，能有效分離待測(cè)組分與其他組分，如圖1所示。

圖1 混合對(duì)照品溶液(A)；不含鹽酸二甲雙胍陰性對(duì)照溶液(B)Fig.1 Mixture reference (A); Non metformin hydrochloride negative sample (B)

3.2 線性考察

儲(chǔ)備液制備：精密稱取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品25.0 mg，置100 mL量瓶中，加水振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

80%、90%、100%、110%、120%線性溶液：分別精密量取線性貯備液8.0 mL、9.0 mL、10.0 mL、11.0 mL、12.0 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

根據(jù)含量測(cè)定方法取上述5種不同濃度的線性溶液各20 μL進(jìn)樣。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸二甲雙胍在20.07～30.11 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖2)。

圖2 鹽酸二甲雙胍線性結(jié)果Fig.2 The standard curve line of metformin hydrochloride

3.3 精密度考察

照含量測(cè)定方法，精密量取專屬性試驗(yàn)中混合溶液20 μL進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，考察儀器精密度，以峰面積計(jì)算精密度，RSD為0.12%。

取鹽酸二甲雙胍格列吡嗪膠囊20粒，取混合均勻的內(nèi)容物，平行處理6份樣品，照含量測(cè)定方法進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察方法精密度，以峰面積計(jì)算精密度，RSD為0.05%。試驗(yàn)表明，儀器精密度與方法精密度均良好。

3.4 穩(wěn)定性考察

取樣品1粒，照含量測(cè)定方法中供試品溶液配制方法處理，作為供試品溶液，放置在室溫條件下，經(jīng)0 h、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h分別精密量取供試品溶液20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積計(jì)算穩(wěn)定性，RSD為0.61%，試驗(yàn)結(jié)果表明：供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 回收率考察

精密稱取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品1.25 g，置200 mL量瓶中，加水適量，振搖使溶解并稀釋至刻度，作為回收率貯備液。精密稱取樣品適量，加回收率貯備液后制成高濃度樣品溶液(120%)、中濃度樣品溶液(100%)、低濃度樣品溶液(80%)3份，照含量測(cè)定方法進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算回收率分別為99.09%、100.00%、99.73%、99.34%、99.11%、100.62%、101.19%、101.03%、101.03%，平均回收率為99.8%，RSD為0.95%，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法回收率良好。

3.6 耐用性考察

分別使用正常色譜條件，不同柱溫(30±5)℃、不同流速(1.0±0.1)mL/min、不同流動(dòng)相比例、不同色譜柱(Thermo C18、Agilent C18、SHESEIDO C18)以及不同的液相色譜儀(島津、Agilent、Thermo)進(jìn)行測(cè)試，分別計(jì)算，對(duì)鹽酸二甲雙胍含量進(jìn)行考察。結(jié)果顯示鹽酸二甲雙胍含量的RSD為0.45%，含量耐用性較好。

4 格列吡嗪含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

4.1 專屬性試驗(yàn)

溶液配制：精密稱取鹽酸二甲雙胍原料藥125 mg、格列吡嗪原料藥2.5 mg、肉桂提取物150 mg、淀粉約70 mg，分別置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL振搖使溶解，并加水稀釋至刻度，搖勻，即得鹽酸二甲雙胍溶液、格列吡嗪溶液、肉桂提取物溶液及淀粉溶液。

格列吡嗪陰性溶液：精密稱取鹽酸二甲雙胍原料藥125 mg、肉桂提取物150 mg、淀粉約70 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL振搖使溶解，并加水稀釋至刻度，搖勻，濾過即得。

混合溶液：精密稱取鹽酸二甲雙胍原料藥125 mg、格列吡嗪原料藥2.5 mg、肉桂提取物150 mg、淀粉約70 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL振搖使溶解，并加水稀釋至刻度，搖勻，濾過即得。

分別精密量取上述溶液和60%甲醇溶液各20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明，格列吡嗪陰性溶液色譜圖中未見格列吡嗪色譜峰，其他各組分及溶劑色譜圖顯示均不會(huì)對(duì)格列吡嗪的含量測(cè)定產(chǎn)生干擾，混合溶液中格列吡嗪色譜峰與格列吡嗪原料藥色譜峰保留時(shí)間一致，分離度符合要求。該方法專屬性好，能有效分離待測(cè)組分與其他組分(圖3)。

圖3 混合對(duì)照品溶液(A)；不含格列吡嗪陰性對(duì)照溶液(B)Fig.3 Mixture reference (A);Non glipizide negative sample (B)

4.2 線性考察

線性貯備液制備：精密稱取格列吡嗪對(duì)照品25.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL振搖使溶解，并加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%線性溶液：分別精密量取線性貯備液7.0 mL、8.0 mL、9.0 mL、10.0 mL、11.0 mL、12.0 mL、13.0 mL，置100 mL量瓶中，加60%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。根據(jù)含量測(cè)定方法取上述7種不同濃度的線性溶液各20 μL進(jìn)樣。

試驗(yàn)結(jié)果表明，格列吡嗪在17.48～32.45 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見圖4。

圖4 格列吡嗪線性關(guān)系考察結(jié)果Fig.4 The standard curve line of glipizide

4.3 精密度考察

參照格列吡嗪含量測(cè)定方法及3.3試驗(yàn)方法對(duì)儀器精密度及方法精密度進(jìn)行考察，以峰面積計(jì)算精密度，儀器精密度RSD為0.45%，方法精密度RSD為0.43%，試驗(yàn)表明，儀器精密度與方法精密度均良好。

4.4 穩(wěn)定性考察

精密稱取樣品1粒，照含量測(cè)定方法中供試品溶液配制方法處理，作為供試品溶液，放置在室溫條件下，經(jīng)0 h、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h分別精密量取供試品溶液20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積計(jì)算穩(wěn)定性，RSD為0.3%，試驗(yàn)結(jié)果表明：供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.5 回收率考察

精密稱取格列吡嗪對(duì)照品25 mg，置200 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為回收率貯備液。精密稱取樣品適量，以60%甲醇作為溶劑，加回收率儲(chǔ)備液后制成高濃度樣品溶液(120%)、中濃度樣品溶液(100%)、低濃度樣品溶液(80%)3份，照含量測(cè)定方法進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算回收率分別為100.20%、100.10%、99.10%、99.46%、100.80%、99.25%、99.48%、98.82%、100.10%，平均回收率為99.7%，RSD為0.64%，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法回收率良好。

4.6 耐用性考察

分別使用正常色譜條件，不同柱溫(30±5)℃、不同流速(1.0±0.1)mL/min 、不同流動(dòng)相比例、不同色譜柱(Thermo C18、Agilent C18、SHESEIDO C18)以及不同的液相色譜儀(島津、Agilent、Thermo)進(jìn)行測(cè)試，分別計(jì)算，對(duì)鹽酸二甲雙胍含量進(jìn)行考察。結(jié)果所有格列吡嗪含量的RSD為0.65%，含量測(cè)定方法耐用性較好。

5 樣品含量測(cè)定

通過已建立的方法對(duì)3批樣品的鹽酸二甲雙胍及格列吡嗪含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示：鹽酸二甲雙胍含量在97.53%～100.26%之間、格列吡嗪的含量在99.83%～101.71%之間。說明該方法可以測(cè)定鹽酸二甲雙胍格列吡嗪中鹽酸二甲雙胍和格列吡嗪的含量，結(jié)果見表1和表2。

表1 3批樣品鹽酸二甲雙胍含量測(cè)定結(jié)果Tab.1 Determination results of metformin hydrochloride in 3 batches of samples

表2 3批樣品格列吡嗪含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of glipizide in 3 batches of samples

6 討論

復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊遼寧修和藥業(yè)有限公司的獨(dú)家品種，有臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，使用該復(fù)方制劑比單獨(dú)使用二甲雙胍或格列吡嗪更顯著的降低II型糖尿病患者的糖化血紅蛋白水平，同時(shí)患者的依從性、耐受性好，因此該制劑在臨床上使用較為廣泛[9-10]。按照本文建立的含量測(cè)定方法對(duì)鹽酸二甲雙胍格列吡嗪膠囊進(jìn)行含量測(cè)定，在測(cè)定條件下其他物質(zhì)對(duì)于鹽酸二甲雙胍及格列吡嗪的測(cè)定均無干擾，測(cè)定結(jié)果可信，耐用性好，表明建立的方法具有廣泛的適用性，可以準(zhǔn)確測(cè)定復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中鹽酸二甲雙胍、格列吡嗪的含量，能有效控制復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊的質(zhì)量，對(duì)復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定有一定的提升作用。