脅腹寧顆粒對(duì)CNAG大鼠TLR4/MyD88信號(hào)通路的影響

張宇 李婷 郭軍鵬 凌冰 張兆鵬 冷炎

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130000；2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

慢性非萎縮性胃炎(CNAG)指在致病因素作用下胃黏膜發(fā)生的慢性非萎縮性炎癥病變，為胃黏膜以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)為主的慢性炎癥〔1〕，表現(xiàn)為進(jìn)食后出現(xiàn)胃部飽脹或疼痛、反酸噯氣等不適癥狀〔2〕，如未及時(shí)防治，將出現(xiàn)惡化。目前公認(rèn)胃癌的發(fā)生經(jīng)歷了“炎癌轉(zhuǎn)化”模式，即CNAG→慢性萎縮性胃炎→胃癌癌前病變→胃癌等演變階段。慢性炎癥惡性轉(zhuǎn)化是絕大多數(shù)癌癥發(fā)生發(fā)展的共有過(guò)程,同時(shí)，炎癥也是胃癌發(fā)生的啟動(dòng)因素,并參與癌變的每個(gè)環(huán)節(jié)。在CNAG惡性進(jìn)展和演變的過(guò)程中，白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等促炎癥因子就在此過(guò)程中發(fā)揮了重要作用〔3〕。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，炎性通路Toll樣受體(TLR)4及其下游信號(hào)通路髓樣分化因子(MyD)88對(duì)于CNAG疾病的發(fā)生發(fā)展也具有重要的作用〔4〕。脅腹寧顆粒為長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的自制藥物，前期實(shí)驗(yàn)證明脅腹寧顆粒對(duì)CNAG大鼠胃黏膜有修復(fù)作用〔5〕，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討脅腹寧顆粒對(duì)CNAG大鼠TLR4/MyD88信號(hào)通路及炎性因子IL-6、TNF-α的影響,為研究脅腹寧顆粒治療CNAG的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 40只健康Wistar大鼠，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001，質(zhì)量200～220 g，雌雄各半。

1.2藥物 脅腹寧顆粒(長(zhǎng)衛(wèi)藥制字(96)1392號(hào)，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心)；奧美拉唑腸溶膠囊(批號(hào):8171204151，四川科倫藥業(yè))。

1.3主要試劑與儀器 兔MyD88(D80F5，Cell Signling)；鼠β-actin(60008-1-lg)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(SA00001-1)、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(SA00001-2)、兔TLR4(19811-1-AP)、大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、大鼠IL-6 ELISA試劑盒(Proteintech)。凝膠成像儀(Omega Lum G)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1分組與造模 隨機(jī)將40只Wistar大鼠分為正常組10只，CNAG造模組(模型組)30只。模型組給予0.02%的氨水配合饑飽失常法(1 d禁食，2 d飽食)自由飲用，造模時(shí)間為13 w。

1.4.2給藥方法與標(biāo)本采集 依據(jù)臨床應(yīng)用劑量換算成大鼠給藥劑量，脅腹寧顆粒組予以脅腹寧顆粒1.67 g/(kg·d)灌胃。奧美拉唑組予以?shī)W美拉唑3.3 mg/(kg·d)灌胃。正常組給予正常飲用水，模型組給予氨水(0.8 ml/100 g)灌胃。灌胃共14 d。藥物干預(yù)結(jié)束后，禁食24 h，經(jīng)麻醉沿腹中線開(kāi)腹，腹主動(dòng)脈血，3 000 r/min離心后取上清液備用。取胃組織，沿胃小彎剪開(kāi)，用生理鹽水清洗胃內(nèi)容物，固定在泡沫浮板上，放入10%中性甲醛溶液中備用。

1.4.3蘇木素-伊紅(HE)染色評(píng)價(jià)大鼠胃竇部病理組織學(xué)改變 HE染色，光鏡下觀察胃黏膜組織上皮細(xì)胞完整度、黏膜厚度、腺體數(shù)量及排列是否整齊,有無(wú)充血、水腫,有無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。

1.4.4ELISA檢測(cè)IL-6、TNF-α含量 操作方法按試劑盒進(jìn)行，在450 nm波長(zhǎng)用酶標(biāo)儀測(cè)各孔樣品的光密度值。

1.4.5Western印跡檢測(cè)大鼠胃竇部TLR4、MyD88蛋白表達(dá) 取50 mg胃賁門部組織，經(jīng)蛋白裂解后取20 μg總蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉(zhuǎn)膜2 h，以5%脫脂奶粉封閉1 h，分別用TLR4(1∶1 000)、MYD88(1∶2 000)、β-actin(1∶10 000)的一抗4℃過(guò)夜，TBST洗3次;二抗室溫孵育1 h。增強(qiáng)化學(xué)熒光素顯像并攝片，以O(shè)mega Lum G進(jìn)行圖像分析，計(jì)算目標(biāo)條帶與內(nèi)參(β-actin)灰度的比值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠胃組織病理學(xué)觀察 正常組胃黏膜厚度正常，腺體排列整齊，細(xì)胞呈單層柱狀。固有層腺體密集，未見(jiàn)增生。模型組與正常組相比，其胃黏膜上皮細(xì)胞排列不規(guī)則，固有層腺體雖完整，但黏膜肌有大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，存在充血、水腫;奧美拉唑組及脅腹寧顆粒組較模型組可見(jiàn)不同程度的改善，胃黏膜腺體排列整齊，固有層淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞不同程度減少，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠胃黏膜組織病理圖像(HE染色，×10)

2.2干預(yù)后各組血清炎癥因子IL-6、TNF-α水平比較 與正常組比較，模型組血清中IL-6、TNF-α水平明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，奧美拉唑組以及脅腹寧顆粒組IL-6、TNF-α濃度均明顯降低(P<0.05)，且脅腹寧顆粒組降低更明顯(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 脅腹寧顆粒對(duì)CNAG大鼠IL-6、TNF-α表達(dá)的影響

2.3干預(yù)后各組TLR4、MyD88蛋白表達(dá)比較 與正常組相比，模型組TLR4、MyD88蛋白表達(dá)量均明顯增高(P<0.05)。藥物干預(yù)后，奧美拉唑組與脅腹寧顆粒組較模型組蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 脅腹寧顆粒對(duì)CNAG大鼠TLR4、MyD88蛋白表達(dá)的影響

表2 脅腹寧顆粒對(duì)CNAG大鼠TLR4、MyD88蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

胃炎屬于中醫(yī)學(xué)“胃痛”“嘈雜”“胃痞”等病證范疇。胃以降為順，因滯而病，主要與脾胃虛弱、情志失調(diào)、藥物、飲食不節(jié)、外邪等多種因素有關(guān)，上述因素?fù)p傷脾胃，致運(yùn)化失司，升降失常，導(dǎo)致氣滯、濕阻、寒凝、火郁等，表現(xiàn)為胃痛、脹滿等癥狀。其病位在胃，與肝、脾兩臟密切相關(guān)?！杜R證指南醫(yī)案》云:“治肝可以安胃”。因此治胃則需要先調(diào)肝，肝氣疏，則胃氣和。脅腹寧顆粒則驗(yàn)應(yīng)此語(yǔ)。

脅腹寧顆粒為長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的自制藥物，為全國(guó)名老中醫(yī)劉鐵軍終身教授臨證二十余年的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)制劑室加工研制成顆粒劑。方中含有大黃，其性苦寒，可排濕熱之邪，為君藥；延胡索、川楝子為金鈴子散，可疏肝泄熱，活血止痛，共為臣藥，佐君藥加強(qiáng)疏肝行氣，和胃止痛之功；木香行氣導(dǎo)滯、健脾消脹,可增強(qiáng)胃動(dòng)力,促進(jìn)胃排空；郁金為血家要藥，能夠開(kāi)郁通滯、調(diào)和肝脾、緩急止痛。芍藥、甘草合為芍藥甘草湯，具有調(diào)和肝脾，緩急止痛之功，而甘草又可調(diào)和諸藥。諸藥相伍,既可行氣，又可益氣，安胃之余又可調(diào)肝,標(biāo)本兼治,共湊行氣導(dǎo)滯、通腑瀉下之功效。

CNAG的病情進(jìn)展與TLRs及其下游信號(hào)通路的激活密切相關(guān)〔5〕。Toll樣受體是一類分布廣泛,表達(dá)于多種細(xì)胞中的天然免疫受體,可非特異性結(jié)合病原相關(guān)分子,啟動(dòng)機(jī)體炎癥反應(yīng),在免疫防御中起著重要作用〔6〕。其中,起主要作用的TLR4被激活后,經(jīng)MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路兩個(gè)途徑傳遞信息，在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔7～9〕。臨床研究已證實(shí)〔3〕脅腹寧顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路對(duì)CNAG大鼠胃黏膜進(jìn)行修復(fù)。而TLRs信號(hào)通路的激活可解除NF-κB與IκB的結(jié)合，令NF-κB從胞質(zhì)移入胞核內(nèi)，與靶基因上特定的序列結(jié)合，從而引起炎性因子的釋放，加速胃黏膜的損傷〔10〕。

IL-6和TNF-α等屬促炎細(xì)胞因子,常用于評(píng)估胃黏膜損傷的嚴(yán)重程度〔11〕。IL-6細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)過(guò)程中起到重要作用。有研究認(rèn)為〔12〕TLRs介導(dǎo)的復(fù)合體誘導(dǎo)MyD88依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激活I(lǐng)L-6、IL-12增加胃上皮細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)；TNF-α是經(jīng)典的促炎癥因子,在炎癥的啟動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生,可以維持并促進(jìn)胃黏膜組織的炎癥,對(duì)于炎性反應(yīng)和腫瘤發(fā)生過(guò)程十分關(guān)鍵。

本研究證實(shí)TLR4/MyD88信號(hào)通路的激活參與了CNAG的發(fā)病過(guò)程;經(jīng)脅腹寧顆粒治療后，胃組織中TLR4/MyD88信號(hào)通路蛋白表達(dá)量及血清中IL-6、TNF-α濃度均明顯下降，提示脅腹寧顆粒可能通過(guò)抑制TLR4/MyD88的持續(xù)活化發(fā)揮治療作用。綜上，脅腹寧顆粒具有改善CNAG大鼠胃黏膜組織病理改變的作用，其治療機(jī)制可能與降低組織中TLR4/MyD88信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)及抑制炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。然而未證實(shí)在該通路中發(fā)揮主要作用的是該顆?；蚰骋凰幬锍煞?、某一配伍，故仍需進(jìn)一步研究。