張琮 趙佩 楊盛 張占海 張清會(huì)
(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院 1特需病區(qū),河南 南陽(yáng) 473000;2心血管內(nèi)科)
急性心肌梗死(AMI)的治療會(huì)引發(fā)心肌缺血再灌注損傷(MIRI),如何減輕MIRI是AMI臨床研究的熱點(diǎn)〔1,2〕。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)非編碼RNA,其可作為AMI診斷的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)〔3〕。miR-322-5p是miRNA家族成員,參與多種疾病發(fā)展進(jìn)程。研究表明,miR-322-5p在肺動(dòng)脈高壓模型大鼠的右心室中〔4〕及高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞〔5〕中的表達(dá)水平降低。miR-322在脂多糖(LPS)刺激的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7中表達(dá)下調(diào),上調(diào)miR-322能促進(jìn)細(xì)胞增殖,緩解炎性損傷〔6〕。本研究通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)5可能是miR-322-5p的靶點(diǎn)。PRMT5在缺氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷中上調(diào)表達(dá),其過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔7〕。PRMT5在缺血再灌注腎損傷和缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷中表達(dá)增加,干擾其表達(dá)可減輕缺血再灌注和缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化損傷〔8〕。但miR-322-5p和PRMT5在H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷中的表達(dá)、影響及兩者的關(guān)系目前還尚未可知。本課題建立H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2損傷模型,旨在研究miR-322-5p和PRMT5對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響及miR-322-5p能否靶向PRMT5發(fā)揮作用,以期為MIRI的治療提供新靶點(diǎn)。
1.1材料 H9c2細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC;胎牛血清(FBS)購(gòu)自浙江天杭;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購(gòu)自南京建成;高糖/低糖DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自北京索萊寶;野生型(WT)和突變型(MUT)PRMT5熒光素酶載體、PRMT5小干擾RNA(si-PRMT5)、miR-322-5p模擬物(mimics)、小干擾RNA 陰性序列(si-NC)、miR-322-5p抑制劑(anti-miR-322-5p)、PRMT5過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-PRMT5)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)、空載體(pcDNA)、抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)和引物序列購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實(shí)驗(yàn)所需試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;Western印跡所需抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將H9c2細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基(含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基)中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.2.2H/R模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組〔9〕H/R模型建立:根據(jù)文獻(xiàn)〔9〕方法,將H9c2細(xì)胞用缺氧培養(yǎng)箱(95%N2、5%CO2)中飽和的低糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基置于缺氧培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)3 h,然后換為完全培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)4 h。
1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-322-5p和PRMT5 mRNA的表達(dá) 接種H9c2細(xì)胞至6孔板,接種密度為2×105個(gè)/孔。培養(yǎng)4 h后,分為對(duì)照(Con)組和H/R組。Con組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)7 h。H/R組:按1.2.2建立H/R模型。培養(yǎng)結(jié)束后,將各組細(xì)胞中總RNA用試劑盒進(jìn)行提取,并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后行PCR反應(yīng)。引物序列:miR-322-5p上游5′-CAGCAGCAATTCATGTTTTGAA-3′,下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;PRMT5 上 游 5′-GGACGGAGAAGGGCAGACTA-3′,下 游 5′-CCCGCATCCAGAACATGGAA-3′;U6上 游5′-GTCGAGAGCTGAGCTGCAC-3′,下 游 5′-AGCGTAGCTCGGCCACGTA-3′;GAPDH上 游5′-CGATGCGCGCTGATCGCCC-3′,下 游 5′-GCGATGCTTTACTCTCTAC-3′。用2-ΔΔCt法分析miR-322-5p相對(duì)U6、PRMT5mRNA相對(duì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)量。
1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 接種H9c2細(xì)胞至6孔板,接種密度為2×105個(gè)/孔。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合為一層時(shí),利用LipofectamineTM2000試劑盒分別轉(zhuǎn)染miR-322-5pmimics、miR-NC、anti-miR-322-5p、anti-miR-NC、si-PRMT5、si-NC、共轉(zhuǎn)染miR-322-5p mimics和pcDNA-PRMT5、miR-322-5pmimics和pcDNA,轉(zhuǎn)染時(shí)間6 h。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-322-5p表達(dá)或Western印跡檢測(cè)PRMT5蛋白表達(dá),驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果后,將各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.5檢測(cè)MDA含量及SOD和GSH-Px活性 將轉(zhuǎn)染miR-322-5p mimics、miR-NC、si-PRMT5、si-NC、共轉(zhuǎn)染miR-322-5p mimics和pcDNA-PRMT5、miR-322-5p mimics和pcDNA細(xì)胞均接種至6孔板,接種密度為2×105個(gè)/孔。培養(yǎng)4 h后,均按1.2.2建立H/R模型,分別記為H/R+miR-322-5p組、H/R+miR-NC組、H/R+si-PRMT5組、H/R+si-NC組、H/R+miR-322-5p+pcDNA-PRMT5組、H/R+miR-322-5p+pcDNA組。同時(shí)接種未轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞,按1.2.3分為Con組和H/R組。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,裂解細(xì)胞,將裂解液3 500 r/min離心10 min。取上清液,分別利用MDA、SOD和GSH-Px試劑盒檢測(cè)上清液MDA含量、SOD和GSH-Px活性。
1.2.6流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞分組同1.2.5。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,收集細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次,利用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。
1.2.7Western印跡檢測(cè)PRMT5和凋亡相關(guān)蛋白 細(xì)胞分組同1.2.5。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,收集細(xì)胞,將細(xì)胞中總蛋白用放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)試劑進(jìn)行提取。經(jīng)二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)蛋白濃度后,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離。將分離蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和封閉處理,用4℃冰箱中分別用PRMT5(1∶1 000)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2(1∶2 000)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax,1∶2 000)和GAPDH(1∶1 000)孵育過(guò)夜。洗膜,室溫條件下用羊抗兔二抗孵育2 h。加顯影液顯影,曝光拍照,ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。
1.2.8雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 接種H9c2細(xì)胞至6孔板,接種密度為2×105個(gè)/孔。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合為一層時(shí),利用LipofectamineTM2000試劑盒分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PRMT5與miR-NC或miR-322-5p mimics、MUT-PRMT5與miR-NC或miR-322-5pmimics,轉(zhuǎn)染時(shí)間6 h。收集細(xì)胞并裂解,離心(半徑10 cm、3 500 r/min、10 min)。取20 μl上清液,向其中加100 μl 1×螢火蟲(chóng)或海腎熒光素酶反應(yīng)工作液,混合均勻后,檢測(cè)螢火蟲(chóng)和海腎的熒光強(qiáng)度。以螢火蟲(chóng)與海腎熒光強(qiáng)度的比值表示細(xì)胞熒光素酶活性。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。
2.1miR-322-5p和PRMT5在H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2中的表達(dá) miR-322-5p在H/R組H9c2細(xì)胞中的含量較Con組顯著降低(0.43±0.04 vs 1.00±0.05,t=26.706,P<0.05)。H/R組H9c2細(xì)胞中PRMT5 mRNA和蛋白含量較Con組均顯著升高(mRNA:3.41±0.32 vs 1.00±0.06,t=22.207,P<0.05;蛋白:0.84±0.07 vs 0.41±0.04,t=16.000,P<0.05;),見(jiàn)圖1。
圖1 PRMT5蛋白在H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)
2.2過(guò)表達(dá)miR-322-5p對(duì)H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 miR-322-5p在轉(zhuǎn)染miR-322-5pmimics的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)量為(2.58±0.16),較轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞中的表達(dá)量(1.00±0.03)顯著升高(t=29.118,P<0.05),說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-322-5p的H9c2細(xì)胞構(gòu)建成功。與Con組相比,H/R組H9c2細(xì)胞中MDA含量顯著增多,SOD和GSH-Px活性較Con組均顯著降低(P<0.05);與H/R+miR-NC組相比,H/R+miR-322-5p組H9c2細(xì)胞中MDA含量顯著減少,SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表1。說(shuō)明H9c2細(xì)胞經(jīng)H/R處理后,細(xì)胞抗氧化能力減弱;過(guò)表達(dá)miR-322-5p減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2氧化損傷。
表1 過(guò)表達(dá)miR-322-5p對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響
2.3過(guò)表達(dá)miR-322-5p對(duì)H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 與Con組相比,H/R組H9c2細(xì)胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax表達(dá)量顯著升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與H/R+miR-NC組相比,H/R+miR-322-5p組H9c2細(xì)胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax表達(dá)量顯著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表1,圖2,圖3。說(shuō)明經(jīng)H/R處理后凋亡加劇,而過(guò)表達(dá)miR-322-5p減少H/R處理的H9c2細(xì)胞凋亡。
圖2 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)
2.4敲減PRMT5對(duì)H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2氧化應(yīng)激的影響 PRMT5蛋白在si-PRMT5的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)量為0.20±0.02,較轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞中的表達(dá)量(0.41±0.04)顯著降低(t=14.087,P<0.05),說(shuō)明敲減PRMT5的H9c2細(xì)胞構(gòu)建成功,見(jiàn)圖4。H/R組H9c2細(xì)胞中MDA含量較Con組增多,SOD和GSH-Px活性較Con組均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);H/R+si-PRMT5組H9c2細(xì)胞中MDA含量較H/R+si-NC組降低,SOD和GSH-Px活性較H/R+si-NC組均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。說(shuō)明心肌細(xì)胞H9c2經(jīng)H/R處理后細(xì)胞抗氧化能力減弱,敲減PRMT5可減輕H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷。
圖3 細(xì)胞凋亡流式圖
圖4 轉(zhuǎn)染si-PRMT5的H9c2細(xì)胞中PRMT5蛋白表達(dá)
表2 敲減PRMT5對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響
2.5敲減PRMT5表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響 與H/R+si-NC組相比,H/R+si-PRMT5組H9c2細(xì)胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax表達(dá)量較H/R+si-NC組降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量較H/R+si-NC組升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2、圖5,圖6。說(shuō)明H9c2細(xì)胞經(jīng)H/R處理后凋亡加劇,敲減PRMT5減少H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。
圖5 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)
圖6 細(xì)胞凋亡流式圖
2.6miR-322-5p靶向調(diào)控PRMT5的表達(dá) PRMT5的3′UTR序列與miR-322-5p互補(bǔ)的位點(diǎn)見(jiàn)圖7。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PRMT5與miR-322-5pmimics的H9c2細(xì)胞熒光素酶活性為(0.41±0.04),較共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PRMT5與miR-NC的細(xì)胞熒光素酶活性(1.00±0.06)顯著下降(t=24.545,P<0.05);共轉(zhuǎn)染MUT-PRMT5與miR-322-5p mimics的H9c2細(xì)胞熒光素酶活性為(0.99±0.05),與共轉(zhuǎn)染MUT-PRMT5與anti-miR-NC的細(xì)胞熒光素酶活性(0.97±0.07)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.697,P=0.496)。PRMT5蛋白在轉(zhuǎn)染miR-322-5p mimics的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)量較轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞顯著降低(0.21±0.02vs 0.43±0.04,t=14.758,P<0.05),PRMT5蛋白在轉(zhuǎn)染anti-miR-322-5p mimics的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)量較轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的細(xì)胞顯著升高(0.84±0.08 vs 0.42±0.04,t=14.087,P<0.05),見(jiàn)圖8。說(shuō)明miR-322-5p靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控PRMT5的表達(dá)。
圖7 PRMT5的3′UTR中含有與miR-322-5p互補(bǔ)的核苷酸序列
圖8 miR-322-5p對(duì)H9c2細(xì)胞中PRMT5蛋白表達(dá)的影響
2.7上調(diào)PRMT5逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)miR-322-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的作用 H/R+miR-322-5p+pcDNA-PRMT5組細(xì)胞中PRMT5蛋白表達(dá)量、MDA含量、細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)量較H/R+miR-322-5p+pcDNA組均升高,SOD和GSH-Px活性和Bcl-2蛋白表達(dá)量較H/R+miR-322-5p+pcDNA組均降低(P<0.05)。見(jiàn)圖9,表3,圖10。說(shuō)明上調(diào)PRMT5可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-322-5p對(duì)H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用。
圖9 各組細(xì)胞凋亡流式圖
表3 上調(diào)PRMT5逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)miR-322-5p對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的作用
1,2:H/R+miR-322-5p+pcDNA組、H/R+miR-322-5p+pcDNA-PRMT5組圖10 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)
研究表明,miRNA在治療不可逆心血管疾病(如AMI)以及修復(fù)/再生細(xì)胞療法的研究方面取得了進(jìn)展〔10〕。研究發(fā)現(xiàn),miR-322-5p在肺動(dòng)脈高壓模型大鼠的右心室表達(dá)減少〔4〕,并可緩解炎癥損傷〔6〕。miR-322/503的表達(dá)在MIRI過(guò)程中減少,miR-322/503的過(guò)表達(dá)通過(guò)上調(diào)p-Akt和p-GSK3β的表達(dá),減少梗死面積,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖〔11〕。還有研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染心臟祖細(xì)胞(CPCs)產(chǎn)生的胞外體miR-322(CPCexo-322)可通過(guò)增強(qiáng)梗死心臟邊緣區(qū)的血管生成,保護(hù)心臟梗死〔12〕。本研究結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-322-5p可減輕H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激,并減少細(xì)胞凋亡,miR-322-5p對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌發(fā)揮保護(hù)作用。
PRMT5是組蛋白和非組蛋白上精氨酸殘基對(duì)稱(chēng)二甲基化的主要酶,調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞從基因表達(dá)調(diào)節(jié)到細(xì)胞增殖和分化的許多生物學(xué)過(guò)程,PRMT5被認(rèn)為是多種疾病的治療靶點(diǎn),包括傳染病、心臟病和癌癥〔13〕。研究發(fā)現(xiàn),PRMT5在心臟中高度表達(dá),是心肌肥厚信號(hào)的重要調(diào)節(jié)因子,PRMT5的過(guò)度表達(dá)顯著抑制苯腎上腺素刺激心肌細(xì)胞GATA4的乙酰化和心肌肥厚反應(yīng),而PRMT5的敲除則誘導(dǎo)GATA4的活化和心肌細(xì)胞肥大,激活心臟中PRMT5的表達(dá)可能是預(yù)防心肌肥厚和心力衰竭的潛在治療方法〔14〕。本研究驗(yàn)證了PRMT5在心肌細(xì)胞H/R損傷中的作用。此外,本研究結(jié)果提示miR-322-5p通過(guò)靶向下調(diào)PRMT5的表達(dá)來(lái)阻礙H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。
綜上,miR-322-5p是H/R處理的大鼠心肌細(xì)胞H9c2中表達(dá)下調(diào)的miRNA,過(guò)表達(dá)miR-322-5p可通過(guò)靶向下調(diào)PRMT5抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,這提示miR-322-5p有望成為心肌細(xì)胞MIRI損傷分子治療的靶點(diǎn)。