TLR5基因單核苷酸多態(tài)性與幽門螺桿菌感染、非賁門胃癌發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)

高芳 衛(wèi)星如 馬立聰 田旭陽 黨彤 賈彥彬,

(1包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院內(nèi)蒙古消化病研究所)

幽門螺桿菌(H.pylori)是定植于胃黏膜、含有鞭毛蛋白特殊結(jié)構(gòu)的需氧革蘭陰性菌。世界衛(wèi)生組織將H.pylori確定為胃的Ⅰ類致癌原〔1〕。Toll樣受體(TLR)5是一種可識別細菌鞭毛蛋白〔2,3〕的模式識別受體，表達于胃上皮細胞膜的表面〔4〕。H.pylori感染機體后可引起慢性萎縮性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等一系列胃腸道疾病〔5〕。而H.pylori感染人體后，宿主胃黏膜上皮中TLR5的表達水平上調(diào)〔6,7〕。研究證實，TLRs基因多態(tài)性在一定程度上可以影響宿主對H.pylori感染及相關(guān)疾病的遺傳易感性〔8〕。此外，TLR5可能參與了H.pylori感染后各種胃部疾病的發(fā)生發(fā)展〔9〕，甚至引起胃癌的發(fā)生。在我們前期研究TLR5基因多態(tài)性與H.pylori的感染、非賁門胃癌的發(fā)病風險中發(fā)現(xiàn)，包頭地區(qū)漢族人群中TLR5基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs17163737與H.pylori、非賁門胃癌的發(fā)病風險相關(guān)聯(lián)〔10，11〕。由于單一基因多態(tài)性在癌變的過程中起微效效應(yīng)，TLR5基因其余的單核苷酸多態(tài)性是否也和胃癌變有關(guān)還需進一步探索，本研究探討TLR5基因SNP rs5744138、rs2241096、rs160827 rs20961-41、rs160812基因多態(tài)性與H.pylori感染、非賁門胃癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究樣本 選取2008年9月至2010年6月間包頭市腫瘤醫(yī)院經(jīng)組織病理學診斷為非賁門胃癌的患者288例為病例組，均未接受過放療或化療。再選取281例同期在包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院無癌癥病史和明顯的胃部疾病的體檢者為正常對照組。兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義(t=0.40，P=0.69；χ2=0.06，P=0.80)。研究對象均為漢族，相互之間無血緣關(guān)系且在包頭居住5年以上，簽署了知情同意書，并提供血液標本2 ml。本研究已獲得包頭醫(yī)學院倫理學委員會的批準。

1.2H.pylori感染的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)血清學方法，在正常對照組血清中檢測人抗H.pylori的抗體滴度。試劑盒購于(BIOHIT公司，芬蘭)，嚴格按照說明書進行操作。并根據(jù)試劑盒推薦：抗體滴度≥30 EIU，判斷H.pylori感染為陽性。

1.3SNP位點的篩選和基因分型 采用Agorithm-Tagger-pairwise Tagging軟件，根據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的中國漢族遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)，篩選研究基因的標記單核苷酸多態(tài)性(Tag-SNP)〔11〕。篩選范圍包括基因第一個外顯子上游20 kb和最后一個外顯子下游10 kb的序列。篩選過程中使用的參數(shù)為連鎖不平衡值r2>0.8，最小等位基因頻率(MAF)>5%。最終本研究篩選出TLR5 rs5744138、rs2241096、rs160827 rs2096141、rs160812的5個位點，見表1。對5個SNP采用TaqMan法在所有樣本中進行基因分型，成功率均大于98%。

表1 TLR5基因的Tag-SNPs的概況

1)頻率低的等位基因在前，頻率高的等位基因在后;2)基于GRCh37.p10

1.4統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行。在正常對照組中用χ2檢驗檢測樣本中的基因型分布是否遵循Hardy-Weinberg平衡；使用Haploview4.0軟件對SNP位點進行連鎖不平衡分析，并采用D′置信區(qū)間法劃分單體型塊(LD block)。TLR5單體型塊包括rs34270714-rs5744174-rs851139-rs2241097-rs17163737(Block 1)、rs574413-8-rs2241096-rs1640827-rs2096141-rs160812(Block 2)之間存在強連鎖不平衡，分別構(gòu)成單體型區(qū)域。在我們先前的實驗中，已經(jīng)對Block 1進行了研究〔11〕。本實驗我們重點研究了Block 2。

用非條件性Logistic回歸計算比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)，評價各等位基因、基因型及單體型與H.pylori感染、非賁門胃癌發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)性〔10,11〕。

2 結(jié) 果

2.1各SNP位點與H.pylori感染的關(guān)系 SNP rs5744138、rs2241096、rs160827、rs2096141、rs160812的基因型分布在H.pylori感染陰性組和陽性組均符合Hardy Weinberg平衡定律(P>0.05)。H.pylori的陽性率為43.3%。5個SNP位點的等位基因、基因型在H.pylori感染陽性和陰性人群中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各SNP位點等位基因、基因型與H.pylori感染的關(guān)聯(lián)

1)數(shù)據(jù)有缺失，2)平衡了性別和年齡因素；表3同

2.2各SNP位點與非賁門胃癌發(fā)病風險的關(guān)系 所有檢測的SNP的等位基因、基因型頻率在兩組中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.3TLR5基因的單體型與H.pylori感染的關(guān)系 以H.pylori感染為結(jié)局變量，使用Haploview軟件對TLR5基因的不同位點進行連鎖不平衡分析，單體型塊的劃分采用D′置信區(qū)間法，發(fā)現(xiàn)rs5744138-rs2241096-rs1640827-rs2096141(Block)之間存在強連鎖不平衡，構(gòu)成單體型區(qū)域。分析結(jié)果顯示，各單體型在H.pylori感染陽性和陰性人群中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

2.4TLR5基因的單體型與非賁門胃癌發(fā)生的關(guān)系 以非賁門胃癌為結(jié)局變量，使用Haploview軟件對TLR5基因的不同位點進行連鎖不平衡分析，單體型塊的劃分采用D′置信區(qū)間法，發(fā)現(xiàn)rs5744138-rs2241096-rs1640827-rs2096141-rs1640812(Block)之間存在強連鎖不平衡，分別構(gòu)成單體型區(qū)域。分析結(jié)果顯示，各單體型在兩組中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

表3 各SNP位點等位基因、基因型與非賁門胃癌的關(guān)聯(lián)分析

表4 TLR5基因單體型與H.pylor感染的關(guān)系

SNP順序為rs5744138-rs2241096-rs1640827-rs2096141

表5 TLR5基因單體型與非賁門胃癌的關(guān)系

SNP順序為rs5744138-rs2241096-rs1640827-rs2096141-rs1640812

3 討 論

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展過程受多種環(huán)境因素和遺傳因素的影響。H.pylori感染是引起胃黏膜病變的生物致病因子之一，可導(dǎo)致慢性胃炎尤其是慢性活動性胃炎的發(fā)生和進展，部分患者可進展為消化性潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌等嚴重臨床結(jié)局〔12,13〕。

TLRs是一種模式識別受體，能夠特異性地識別細菌、病毒等多種病原微生物，進而激活機體產(chǎn)生非特異性免疫應(yīng)答。TLRs的表達具有組織特異性，其中TLR2、TLR4、TLR5和TLR9在胃中有選擇性表達〔8〕。TLR5是TLRs中唯一可以識別細菌蛋白質(zhì)的受體，其配體是細菌的鞭毛蛋白〔2,3〕。研究發(fā)現(xiàn)，在H.pylori感染者當中10%～20%的患者會發(fā)展成消化性潰瘍，發(fā)展成為胃癌的比例僅占1%～2%〔14〕，說明宿主的遺傳因素在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。TLRs在H.pylori感染及其引起的相關(guān)疾病中起到了重要的作用，其編碼基因是研究H.pylori感染及其相關(guān)疾病分子遺傳學的重要候選基因〔15,16〕。

TLR5基因位于染色體1q41-q42，編碼TLR5蛋白質(zhì)。Hayashi等〔17〕證實了先天免疫系統(tǒng)對H.pylori感染的識別主要是通過細菌鞭毛蛋白和TLR5之間的相互作用。Xu等〔16〕研究顯示，TLR5基因SNP rs1640827和rs17163737與H.pylori感染相關(guān)聯(lián)。衛(wèi)星如等〔18〕研究表明，在共顯性遺傳模式下，TLR5基因SNP rs2072493與H.pylori的感染關(guān)聯(lián)，與AA基因型攜帶者相比，攜帶AG基因型者可使H.pylori感染的風險降低。而有研究表明〔10〕，TLR5 rs17163737與H.pylori感染關(guān)聯(lián)。H.pylori感染屬于多基因疾病，環(huán)境、遺傳因素都在疾病的發(fā)展中起一定的作用。單一SNP起微效效應(yīng)。結(jié)果提示TLR5 rs5744138、rs2241096、rs160827 rs2096141、rs160812與H.pylori感染沒有關(guān)聯(lián)。目前，關(guān)于這5個SNP與H.pylori感染、胃癌的發(fā)病風險的研究報道不多，還需進一步研究證實。

本研究還探討了TLR5基因多態(tài)性與非賁門胃癌發(fā)病風險的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，SNP rs5744138、rs2241096、rs160827 rs2096141、rs160812位點的等位基因、基因型頻率在非賁門胃癌病人和正常對照中的分布差異無統(tǒng)計學意義。Xu等〔16〕研究顯示，TLR5基因SNP rs5744174、rs1640827和rs17163737與GC發(fā)病風險上升。同時TLR5基因多態(tài)性可能增加萎縮性胃炎和胃癌的發(fā)病風險〔19〕。而有研究表明〔11〕，TLR5基因SNP rs17163737與非賁門胃癌的發(fā)病風險相關(guān)聯(lián)，與攜帶GG基因型的人群比較，GT基因型攜帶者非賁門胃癌的發(fā)病風險可提高1.605倍(GT vs GG:OR=1.605,95%CI=1.131～2.280)，SNP rs34270714、rs5744174、rs851139與非賁門胃癌發(fā)病風險沒有關(guān)聯(lián)(P>0.05)。單個SNP在胃癌的發(fā)病過程作用是微小的。今后應(yīng)進一步擴大樣本量，研究在胃癌變過程中，基因多態(tài)性的聯(lián)合效應(yīng)。